基于cox1序列的中國6個花鱸野生群體遺傳多樣性

范嗣剛，黃 皓,2，王鵬飛，閆路路，趙 超，張 博，邱麗華,2

基于序列的中國6個花鱸野生群體遺傳多樣性

范嗣剛1，黃 皓1,2，王鵬飛1，閆路路1，趙 超1，張 博1，邱麗華1,2

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所 / 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

【】利用細胞色素C氧化酶1基因（）序列片段研究中國6個花鱸（）野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構。用PCR方法獲得花鱸個體的序列，測序后，用MEGA X、DnaSP 6.12和Arlequin 3.01等軟件進行數(shù)據(jù)分析?！尽吭?個花鱸群體229個樣品共檢測到48個多態(tài)性位點和50個單倍型。單倍型多樣性為0.799 ～ 0.888，核苷酸多樣性為0.001 6 ～ 0.002 7。6個花鱸群體遺傳分化指數(shù)（st）為- 0.008 1 ～ 0.176 7。分子方差分析顯示，遺傳分化90.98%來自群體內，9.02%來自群體間。鄰接系統(tǒng)進化樹顯示6個花鱸群體分為兩大支。單倍型鄰接樹和單倍型網(wǎng)絡關系圖結果表明，未檢測到有地理譜系結構的單倍型。中性檢驗顯示，花鱸群體可能經(jīng)歷過種群擴張。

花鱸；序列；遺傳多樣性；遺傳結構

花鱸（）隸屬于鱸形目（Perciformes）鮨科（Serranidae）花鱸屬，俗稱鱸魚、七星鱸、花寨等[1]，屬廣溫、廣鹽性魚類，廣泛分布于中國、朝鮮半島和日本沿海[2]?；|生長速度快，肉質鮮美，無肌間刺，營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值較高，是我國重要海水養(yǎng)殖魚種。目前，我國花鱸產(chǎn)業(yè)繁育和養(yǎng)殖模式主要為北方培育和提供親魚，福建和浙江育苗，廣東和福建養(yǎng)成，導致花鱸種質混亂[2-3]，加上多年的人工繁殖和高強度捕撈，中國花鱸近親繁殖加劇，種質退化嚴重，良種缺乏，急需開展遺傳選育[3]。遺傳多樣性評估是遺傳選育的重要環(huán)節(jié)，分析花鱸遺傳多樣性對花鱸遺傳選育研究極為重要。

線粒體DNA（mtDNA）是一種核外遺傳物質，有分子質量小、結構簡單、進化速度快等特點，是評估群體遺傳和生物進化的有效標記[4-7]，已廣泛應用于水生動物的群體遺傳學研究[7-10]。已有少量基于線粒體序列的花鱸群體遺傳學研究。Liu等[11]用細胞色素b（Cytochrome b，Cytb）基因序列分析了9個地域的花鱸遺傳結構。劉明月等[12]用Cytb分析了我國6個沿海地區(qū)花鱸野生群體；Gong等[13]用線粒體基因組序列研究了中國沿海12個花鱸群體的遺傳結構，認為存在兩個地理群體；Wang等[14]用細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（Cytochrome c oxidase subunit I，cox1）基因部分序列研究了中國5個花鱸地理群體遺傳多樣性。除線粒體DNA方法外，還有基于SSR和基因組重測序等方法的研究[15-19]。但地理群體、采集時間、研究手段不同，花鱸遺傳多樣性會有差異。本研究利用線粒體基因序列，分析中國沿海6個花鱸群體遺傳多樣性，探討其群體關系，為花鱸遺傳選育研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集與DNA提取

2020年在我國沿海6個地區(qū)海域捕獲野生花鱸229尾，其中在天津（TJ）（118°0′E，38°50′N）、上海（SH）（122°29′E，31°17′N）、長島（CD）（120°3′E，38°7′N）各采集39尾，青島（QD）（120°30′E，35°58′N）38尾，廈門（XM）（118°14′E，24°21′N）40尾，北海（BH）（108°56′E，21°24′N）34尾。分別取每個個體的鰭條，用無水乙醇固定，運回實驗室后于-20℃下保存。用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 [天根生化科技(北京)有限公司，中國] 提取各樣品DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國）檢測DNA的完整性和濃度。

1.2 PCR擴增與測序

根據(jù)花鱸線粒體基因組序列（KP408212.1），用Primer premier 5軟件設計基因片段擴增引物：-F，ATATAGCGTTCCCTCGAATG；-R，AAAAGGATTACCGCTACCAG。PCR體系為20 μL，其中ExTaq酶（Takara，日本）0.2 μL，10×ExTaq Buffer（含Mg2+）2 μL，dNTP Mix 1.6 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.8 μL，DNA（50 ng/μL）0.6 μL，去離子水14 μL。反應程序：95℃ 5 min；95℃30 s，52℃30 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)；72℃7 min。用瓊脂糖凝膠檢測反應產(chǎn)物。用膠回收試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）回收目的片段，送至擎科生物技術有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

用MEGA X[20]比對cox1序列，用DnaSP 6.12[21]軟件計算多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)量及單倍型多態(tài)性（Haplotype diversity，d）、核苷酸多態(tài)性（Nucleotide diversity，）和Tajima’s檢測。用MEGA X[20]的Maximum Composite Likelihood模型計算單倍型間的遺傳距離，用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。

用軟件Arlequin 3.01中的分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）計算群體間和群體內的差異和遺傳分化指數(shù)（st）。根據(jù)公式m= (0.5/st)?0.5計算基因流[22]。用PopArt 1.7[23]構建單倍型進化網(wǎng)絡圖。

2 結果與分析

2.1 序列特征與遺傳多樣性

花鱸229個個體基因部分序列長984 bp，含GC 49.1%。在這984個核苷酸位點中，有48個多態(tài)性位點（占4.88%），其中單突變點23個，簡約信息位點25個。

共檢測到50個單倍型（表1），其中Hap2、9、12為6個群體共有單倍型，Hap1為5個群體共有，Hap3、16為4個群體共有，Hap10、14、24為3個群體共有，Hap11、18、21、22、31為2個群體共有。其余28個單倍型為各群體獨有，上海群體獨有的單倍型最多（9個），其次為青島群體（7個），廈門群體獨有的單倍型最少（1個）。單倍型Hap1被51個個體共享，包含個體數(shù)最多；其次為Hap12，被45個個體共享；Hap9被25個個體共享。所有的單倍型序列已遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登記號為OK274345－OK274394。

表1 花鱸6個野生群體cox1序列的單倍型的分布情況

6個花鱸群體序列d為0.799 ～ 0.888，其中廈門群體最高，長島群體最低（表2）。6個花鱸群體的為0.001 6 ～ 0.002 7，其中北海群體最高，青島群體最低。整體上，6個花鱸群體的d為0.892，為0.002 3。各群體的Tajima’s均為負值（表2）。

表2 6個花鱸群體的遺傳多樣性參數(shù)

說明：“*”表示有顯著性差異（0.05）

Note: “*”means significant difference（0.05）

2.2 種群遺傳結果

花鱸6群體間遺傳分化系數(shù)st為-0.008 1 ～ 0.176 7（表3），僅天津群體與長島群體間st值為負，其余群體間st均為正值。天津群體與上海群體的st值最大（0.176 7）。除天津群體與長島群體，上海群體與青島群體的st無顯著差異外，其余群體間st均有顯著差異（0.05）?；|6群體間基因流m為-62.228 4 ～ 999.500 0（表3）。

表3 6個花鱸群體間遺傳分化系數(shù)Fst（對角線下）和基因流Nm（對角線上）

說明：“*” 表示有顯著差異（0.05）

Note: “*”means significant difference（0.05）

AMOVA結果（表4）顯示，6群體的總st為0.090 2，差異不顯著。其中90.98%的遺傳變異來自群體內，僅有9.02%的遺傳變異來自群體間。

表4 6個花鱸群體遺傳變異的分子方差分析

2.3 單倍型系統(tǒng)進化樹與網(wǎng)絡圖

50個單倍型的NJ系統(tǒng)進化樹（圖1）表明，單倍型無明顯的譜系分化，6個群體所有單倍型無規(guī)律地均勻分布，未發(fā)現(xiàn)與地理分布相對應的分支。

部分序列的單倍型網(wǎng)絡關系（圖2）顯示，Hap12處于網(wǎng)絡圖的中心位置，可能是最原始的單倍型，其次為Hap1和Hap9。各群體的單倍型在網(wǎng)絡中散亂混雜分布，單倍型的進化關系與地理分布無明顯聯(lián)系，與單倍型系統(tǒng)進化樹結果相符。

只顯示Bootstraps > 50%的點

圖2花鱸cox1基因序列的單倍型網(wǎng)絡

3 討論

遺傳多樣性是物種生存、進化和適應環(huán)境的基礎，物種遺傳多樣性高則適應環(huán)境能力強，進化潛力大。序列遺傳多態(tài)性較高，已用于各種魚類遺傳多樣性研究[9,12-13]。本研究獲得花鱸基因的部分序列，長984 bp，其中多態(tài)性位點有48個（占4.88%）。Wang等[14]研究的花鱸群體基因部分序列長586 bp，多態(tài)性位點21個（占3.58%），單倍型20個，與之比對，本研究序列僅有339 bp為同一段序列。因此本研究有645 bp的cox1序列是首次用于花鱸的群體遺傳多樣性分析。另外，本研究的多態(tài)性位點數(shù)量和比例均高于Wang等[13]，說明多態(tài)位點在整個序列中均有分布。本研究序列的單倍型是Wang等[13]的2倍，與本研究選擇的序列更長有關。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是反應遺傳多樣性高低的重要指標。本研究中，花鱸各群體d總體為0.892，為0.002 3（表3），與Wang等[14]的結果相似，均為高單倍型多樣性（d> 0.5），低核苷酸多樣性（< 0.005）。這種結果也在其他魚類、甲殼類和海參中檢測到[18,24-27]，暗示花鱸種群近期可能經(jīng)歷了快速擴張事件，隨著種群數(shù)量的增加，單倍型多樣性顯著提高，但無時間使核苷酸發(fā)生變異[28]，因此核苷酸多樣度較低。這在中性測試結果中也得到證實：6個中國花鱸群體的Tajima’s均為負值，花鱸群體可能經(jīng)歷過種群擴張。

Liu等[11]的基于線粒體Cytb基因部分序列的中國花鱸6野生群體遺傳多樣性結果表明，d為0.96 ～ 1.00，為0.008 ～ 0.015，均高于本研究和Wang等[14]的結果，說明20多年來，花鱸野生群體遺傳多樣性是下降的，原因可能是野生個體被大量捕撈。在韓國也發(fā)現(xiàn)，近20 a花鱸野生群體的遺傳多樣性有所下降[25]。另外，本研究的6個花鱸野生群體與Wang等[14]的5個花鱸野生群體有相同或相近的采樣地點：均采集了青島群體和上海群體，另外采集點北海和防城港相鄰，廈門和列嶼相鄰。經(jīng)比較，本研究的群體遺傳多樣性均高于Wang等[14]的結果，如本研究青島群體d為0.848，上海群體d為0.825；在Wang等[14]的青島群體d為0.572，上海崇明群體d為0.656。這可能是由所采集樣品不同所致。另外，隨著花鱸的人工繁育、養(yǎng)殖技術和養(yǎng)殖模式日趨成熟，已能滿足人們的消費需求，緩解了花鱸野生群體的捕撈。

本研究的3個北方群體（天津、青島和長島）的值均較低（其中青島群體的最低），低于其他3個南方群體（上海、廈門和北海），Wang等[14]也發(fā)現(xiàn)青島群體的值最低。這可能說明花鱸在北方被大量捕撈?；|在中國北方海域比在南方海域生長性和環(huán)境適應性更佳[29]。因此大量的野生花鱸個體被捕撈并運送到中國南方地區(qū)甚至到日本、韓國等國家[29]，從而導致北方的花鱸群體種質資源受到嚴重破壞。因此長期的過度捕撈使北方的花鱸群體經(jīng)歷了瓶頸事件，使值降低。

st是衡量群體間遺傳分化程度的重要指標。根據(jù)Wright[30]研究，st為0～0.05，群體間遺傳分化很小，可忽略；st為0.05～0.15，群體間存在中等程度的遺傳分化；st為0.15～0.25，群體間遺傳分化較大；st＞0.25時，群體間存在明顯的遺傳分化，st為負值，說明群體間無遺傳分化，基因交流非常頻繁。本研究中，中國沿?；|群體總體遺傳分化指數(shù)為0.090 2，表明中國花鱸群體遺傳分化水平總體處于中等程度。在6個花鱸群體間，天津群體與上海群體、青島群體、北海群體的遺傳分化程度較大（0.15

本研究發(fā)現(xiàn)，中國沿海6花鱸群體的遺傳變異主要來自群體內（90.98%）。Liu等[11]的基于線粒體Cytb和控制區(qū)序列的花鱸群體遺傳變異有93.72%來自群體內。王桂興等[17]用花鱸微衛(wèi)星標記研究中國6個花鱸群體的遺傳多樣性，也證實中國花鱸群體有91.96%遺傳變異來自群體內。這些結果均表明中國沿?；|的遺傳變異主要來自群體內。線粒體DNA單倍型是研究物種群體遺傳變化程度的一個重要參數(shù)。本研究共檢測到50個單倍型，所有單倍型無規(guī)則地分布在整個系統(tǒng)進化樹和網(wǎng)絡圖中，未形成與地理分布相符合的譜系結構，說明目前中國花鱸群體的遺傳分化程度不高。Hap12和Hap1為主要單倍型，被多個群體共享且分布頻率高，在單倍型網(wǎng)絡圖中處于中心位置，可能是花鱸群體祖先單倍型，是對外界環(huán)境適應能力強且能在花鱸群體中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢單倍型。Hap12、Hap1通過數(shù)個堿基的替換演變成其他單倍型。Wang等[14]也發(fā)現(xiàn)可能有兩種祖先單倍型。同時，花鱸各群體均有特有單倍型，表明花鱸群體的遺傳多樣性豐富。在花鱸種質資源管理中，需重視特有單倍型的保護，使其保持多樣化。

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Population Genetic Diversity of Spotted Sea Bass () from China Based on MitochondrialGene Sequence

FAN Si-gang1, HUANG Hao1,2, WANG Peng-fei1, YAN Lu-lu1, ZHAO Chao1, ZHANG Bo1, QIU Li-hua1,2

（1.,,,510300,; 2.,201306,）

【】To study the genetic diversity and genetic structure of six wildpopulations from China by the cytochrome c oxidase subunit 1 () genes of mitochondrial DNA.【】cox1 sequence was amplified with PCR technology and analyzed by MEGA X, DnaSP 6.12 and Arlequin 3.01 softwares.【】More than 48 polymorphic sites and 50 haplotypes were detected from 229 individuals from six populations. The haplotype diversity (d) was 0.799 - 0.888, and the nucleotide diversity () was 0.001 6 - 0.002 7, the genetic diversity index (st) was - 0.008 1－0.176 7. The analysis of molecular variance (AMOVA) showed that 90.98% genetic variation occurred within populations and 9.02% occurred among populations. The analysis of N-J tree and network of haplotypes indicated that there were no geographic haplotype. Neutrality test indicated that these populations might have undergone a population expansion.

;gene sequence; genetic diversity; genetic structure

范嗣剛，黃皓，王鵬飛，等. 基于序列的中國6個花鱸野生群體遺傳多樣性[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（3）：11-17.

Q75；S917.4

A

1673-9159（2022）03-0011-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.002

2021-10-09

國家自然科學基金（31802281）；廣東省重點領域研發(fā)計劃項目（2021B0202020002）；中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費專項 (2020TD21) ；廣州市科技計劃項目（202102020487）；廣州市農(nóng)村科技特派員項目（20212100051）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(2021TS03；2021SD11)

范嗣剛（1982―），男，博士，副研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: fansigang@scsfri.ac.cn

邱麗華（1971―），女，博士，研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: qiugroup_bio@outlook.com

（責任編輯：劉慶穎）