三倍體漆樹組織培養(yǎng)無菌體系建立技術(shù)研究

王壯盧宇馬東曉

（1西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南昆明 650224；2西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

漆樹（Toxicodendron vernicifluum）是漆樹科（Anacardiaceae）漆屬（Toxicidendron）的一種落葉喬木，有“涂料之王”的美譽(yù)[1]，被廣泛用于軍工、冶煉、石油、化工、采礦、紡織印染、工藝品加工及家具表面處理等領(lǐng)域[2]。漆樹的主要產(chǎn)品是生漆，化學(xué)油漆的出現(xiàn)曾導(dǎo)致生漆市場在較長時期處于低迷狀態(tài)。近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)和對綠色家居生活方式的追求，生漆作為環(huán)保油漆的重要原料，越來越受到人們的關(guān)注，發(fā)展前景非常廣闊[3]。三倍體漆樹（2n=3x=45）在自然界存在數(shù)量極少，是具有較高實(shí)用價值的經(jīng)濟(jì)樹種，生長迅速，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生漆，同時具有抗寒冷、抗干旱、抗病蟲害等特點(diǎn)[4]，深受漆農(nóng)歡迎。本文選用當(dāng)年生三倍體漆樹幼嫩莖段為外植體，對其進(jìn)行消毒時間、方法與腋芽誘導(dǎo)研究，以期為三倍體漆樹無性繁殖推廣與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取西南林業(yè)大學(xué)格林溫室大棚內(nèi)無病蟲害、生長健壯的當(dāng)年生三倍體漆樹幼嫩莖段為外植體，于晴天上午 8：00—9：00采集。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體預(yù)處理。選取生長健壯的三倍體漆樹幼嫩莖段，用剪刀剪去多余枝條和葉柄，先用紗布蘸取0.2%次氯酸鈉溶液清洗莖段2～3 min，其間不斷擦拭莖段表面，用自來水沖洗3～5次后，將材料上的殘留水珠用紗布擦拭干凈。

1.2.2 外植體消毒。分別使用75%乙醇和0.1%升汞進(jìn)行莖段表面消毒處理。采用75%乙醇浸泡振蕩30、60、90 s與 0.1%升汞浸泡振蕩 2、4、6 min 的處理組合進(jìn)行消毒時間試驗(yàn)，共計9個處理。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段，3次重復(fù)。接種3 d后觀察是否有污染產(chǎn)生，7 d后統(tǒng)計其污染率，根據(jù)各組污染情況確定最適宜的消毒時間處理組合。

1.2.3 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，培養(yǎng)室溫度為（23±2）℃，光照周期為 12 h/d。

（1）基本培養(yǎng)基篩選?；九囵B(yǎng)基選用MS、1/2 MS、DCR、WPM、White，上述基本培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，pH值為5.8～6.2。每種基本培養(yǎng)基為一個處理，每個處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段。接種時，將莖段垂直插入基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率及腋芽的生長情況，最終篩選出適宜三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

（2）外源激素篩選。以選出的培養(yǎng)基為三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基，設(shè)計不同配比的外源激素組合，共計12個處理，不同外源激素組合方案如表1所示。將三倍體漆樹外植體分別接種于培養(yǎng)基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段，30 d后統(tǒng)計平均誘導(dǎo)腋芽數(shù)、平均苗高及幼苗的生長情況。

表1 三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)外源激素篩選設(shè)計

（3）活性炭添加量篩選。以篩選出的基本培養(yǎng)基和外源激素（MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L）為基礎(chǔ)，設(shè)計不同量活性炭配比，共計5個處理，活性炭添加量分別為 0、0.1、0.2、0.3、0.4 g/L。 選取適宜三倍體漆樹外植體接種于該培養(yǎng)基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種2個莖段，30 d后統(tǒng)計平均誘導(dǎo)腋芽數(shù)、平均苗高及幼苗生長情況，最終篩選出適宜三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的較優(yōu)培養(yǎng)條件。不同活性炭添加量配比組合方案如表2所示。

表2 三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)活性炭添加量篩選設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對三倍體漆樹外植體消毒效果的影響

從表3可以看出，75%乙醇消毒30 s，0.1%升汞分別消毒2、4、6 min處理的外植體污染率均較高，分別為80.00%、86.70%、73.30%。說明以上處理均不能有效抑制外植體污染的發(fā)生。但75%乙醇消毒30 s、0.1%升汞消毒6 min處理的外植體生長情況較好，其余2個處理外植體的生長情況均不理想。在9個處理組合中，75%乙醇消毒30 s、0.1%升汞消毒4 min處理的污染率最高，為86.70%；75%乙醇消毒90 s，0.1%升汞消毒4、6 min，外植體的污染率均為0，但生長情況較差，成活率較低，分別為40.0%、33.3%；75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min處理的外植體污染率較低，為13.30%，成活率達(dá)95.0%，生長情況也為良好。綜上所述，9個處理組合中，75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min處理為三倍體漆樹外植體最佳消毒處理組合。

表3 不同處理下消毒效果比較

2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.2.1 基本培養(yǎng)基對三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)效果的影響。不同的基本培養(yǎng)基對三倍體漆樹外植體的腋芽誘導(dǎo)效果不同。由表4可知，在5個處理中，以MS、1/2 MS、WPM、White為基本培養(yǎng)基處理的萌芽率均較理想，以MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基處理的出芽質(zhì)量均能達(dá)到良好，但以MS為基本培養(yǎng)基處理的生長狀態(tài)更好，葉片翠綠，腋芽粗壯。以White培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的主芽質(zhì)量一般。以DCR為基本培養(yǎng)基的萌芽率很低，僅為30%，無腋芽，莖段呈紅色。說明在三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)階段，以DCR為基本培養(yǎng)基難以成功誘導(dǎo)出芽。綜上所述，以MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基處理的腋芽誘導(dǎo)效果均良好，以MS、1/2 MS、WPM為基本培養(yǎng)基處理萌芽率均達(dá)到95%，以MS基本培養(yǎng)基處理的出芽質(zhì)量更好。因此，MS培養(yǎng)基為三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)最佳基本培養(yǎng)基。

表4 不同基本培養(yǎng)基腋芽誘導(dǎo)效果

2.2.2 不同外源激素對三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)效果的影響。以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將外植體置于不同激素處理下，三倍體漆樹外植體的腋芽誘導(dǎo)效果不同。由表5可知，處理A1、A6、A8的萌芽率均為95%，但處理A6與處理A8的出芽質(zhì)量均不理想。說明處理A1的激素種類和添加量較適合三倍體漆樹腋芽的誘導(dǎo)。處理A7、A12均未添加細(xì)胞分裂素，其中處理A7添加NAA，處理A12添加IBA，處理A7的萌芽率僅為50%，處理A12的萌芽率為0。說明在三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)階段，僅添加生長素NAA或僅添加生長素IBA不適宜腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。處理A1、A2中均添加了細(xì)胞分裂素（6-BA、ZT），處理 A2在添加 6-BA、ZT的基礎(chǔ)上添加了生長素NAA，處理A2的萌芽率較處理A1低。說明在三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)階段，向培養(yǎng)基中加入生長素NAA不利于腋芽誘導(dǎo)。

表5 不同外源激素處理下腋芽誘導(dǎo)效果

2.2.3 活性炭添加量對三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)效果的影響。由表6可知，在75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min條件下，各處理萌芽率均能達(dá)90%以上，其中處理B1和處理B4萌芽率均為95%，處理B2、B3、B5萌芽率均為90%。從出芽質(zhì)量來看，未添加活性炭的處理B1與添加0.1 g/L活性炭的處理B2莖段略黑，處理B3部分莖段略黑，處理B4莖段顏色為翠綠且腋芽生長健壯（圖1）。說明在三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)階段，添加活性炭0.3 g/L以上能夠有效抑制三倍體漆樹幼嫩莖段褐化。綜上所述，結(jié)合萌芽率和出芽質(zhì)量，處理B4萌芽率最高（95%）、莖段翠綠、腋芽健壯。因此，最適宜三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L+活性炭0.3 g/L。

表6 不同活性炭添加量處理下腋芽誘導(dǎo)效果

3 結(jié)論與討論

以當(dāng)年生三倍體漆樹幼嫩莖段為外植體，主要選取其包含頂芽的上三節(jié)幼嫩莖段進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)，腋芽誘導(dǎo)時間短，污染率較低。該幼嫩莖段是理想的三倍體漆樹外植體。組織培養(yǎng)體系建立的前提是建立無菌體系，因而保證外植體低污染率對建立組培體系十分重要[5]。楊 宏等[6]采用9種培養(yǎng)基進(jìn)行長山核桃莖段腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)，結(jié)果表明，這9種處理幾乎均可誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，最佳的誘導(dǎo)組合是WPM+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L。羅一然等[7]研究發(fā)現(xiàn)，適宜小木漆幼嫩莖段的消毒方法為75%乙醇浸泡20 s、0.05%苯扎氯胺浸泡1 min、0.1%升汞浸泡20 min；6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L組合的腋芽萌發(fā)率最高，達(dá)到91.67%，但與6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L組合的萌發(fā)率（88.33%）差異不顯著，這表明細(xì)胞分裂素6-BA在誘導(dǎo)外植體腋芽萌發(fā)時具有明顯的促進(jìn)作用。李錦宇等[8]研究表明，綜合考慮外植體的污染率與存活率，適宜日本野漆樹外植體的消毒方法為75%乙醇浸泡10 s+2.0%潔爾滅浸泡1.5 min+0.1%升汞浸泡4 min。從基本培養(yǎng)基來看，MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的腋芽粗壯，White培養(yǎng)基上萌發(fā)的腋芽直徑處于中等，而1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的腋芽細(xì)瘦。李 斌等[9]研究發(fā)現(xiàn)，75%乙醇浸泡15 s、0.1%升汞浸泡10 min為金鐵鎖外植體消毒的最理想條件。本文通過設(shè)計不同的消毒組合后得出：先用紗布蘸取0.2%次氯酸鈉溶液清洗三倍體漆樹莖段2～3 min，其間不斷擦拭其表面，再用自來水沖洗3～5次，將材料上的殘留水珠用紗布擦拭干凈后用75%酒精浸泡60 s、0.1%升汞浸泡4 min進(jìn)行外植體消毒，能夠有效地對三倍體漆樹莖段進(jìn)行表面消毒，能最低限度地?fù)p害腋芽，腋芽誘導(dǎo)后的污染率也較低。在三倍體漆樹腋芽誘導(dǎo)階段，最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L+活性炭0.3 g/L。