化學(xué)發(fā)光探針構(gòu)建及應(yīng)用進展

馮玉蓉，徐 帥，宦雙燕，袁 林，張曉兵

(湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410082)

化學(xué)發(fā)光是指分子吸收化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能而被激發(fā)并發(fā)射光子的過程?；瘜W(xué)發(fā)光現(xiàn)象最早被發(fā)現(xiàn)于一些生物體內(nèi)，如海洋生物。之后，科學(xué)家在一些實驗過程中也發(fā)現(xiàn)了化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。1877 年，Radziszewski 發(fā)現(xiàn)洛芬堿在堿性條件下被過氧化氫等物質(zhì)氧化時可以發(fā)射綠光[1]；1928 年，Albrecht 觀察到魯米諾在堿性介質(zhì)中的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象[2]；1954 年，Eisenbrand 發(fā)現(xiàn)光澤精在堿性條件下與過氧化氫反應(yīng)發(fā)生化學(xué)發(fā)光，且具有較高的化學(xué)發(fā)光效率[3]。隨著人們對化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的研究不斷深入，目前已經(jīng)構(gòu)建了多種化學(xué)發(fā)光體系?；瘜W(xué)發(fā)光分子在應(yīng)用過程中不需要外部激發(fā)光源，從而可以有效避免外加光源干擾，其在生物成像，特別是活體成像領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢。

本文主要介紹魯米諾、過氧草酸酯、1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系在檢測和腫瘤治療中的應(yīng)用。

1 魯米諾類化學(xué)發(fā)光體系

魯米諾，又稱發(fā)光氨，1928 年科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)它被氧化時能發(fā)出藍光[2]。魯米諾及其衍生物因具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、發(fā)光效率高、合成簡單等特點，被廣泛應(yīng)用于傳感、生物成像和腫瘤治療等領(lǐng)域。

當用氧化劑如過氧化氫處理魯米諾的堿性水溶液時，會有光產(chǎn)生[4]。在堿性溶液中，魯米諾首先與堿性物質(zhì)作用生成中間物魯米諾負離子；在氧化劑的作用下，魯米諾負離子被進一步氧化生成不穩(wěn)定的有機過氧化物中間體，隨后分解得到激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸；激發(fā)態(tài)分子躍遷回到基態(tài)的過程中伴隨著光的產(chǎn)生，其最大發(fā)射波長約為425 nm[5](圖1)。魯米諾類化學(xué)發(fā)光分子具有化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率高的特點，因此常被用于檢測生物標記物。

圖1 魯米諾發(fā)光原理Fig.1 General luminescence mechanism of Luminol

1.1 魯米諾化學(xué)發(fā)光體系在檢測活性物種和活體成像中的應(yīng)用

2011 年，Waite 課題組開發(fā)了一種檢測羥基自由基的魯米諾化學(xué)發(fā)光探針1(圖2)。該探針對羥基自由基的檢測限為31 nmol/L[6]。2013 年，基于魯米諾發(fā)光體系，Pluth 課題組設(shè)計了兩種硫化氫化學(xué)發(fā)光探針2，3(圖2)。這兩種化學(xué)發(fā)光探針都對H2S具有強化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，并且能檢測正常生理水平下生物體內(nèi)的H2S含量[7]。

圖2 檢測羥基自由基和硫化氫的魯米諾化學(xué)發(fā)光探針Fig.2 Chemiluminescence probe for hydroxyl radicals and hydrogen sulfide based on Luminol

盡管魯米諾化學(xué)發(fā)光探針具有檢測限低、選擇性好等特點，但其仍然存在著發(fā)射波長短(約425 nm)、組織穿透深度有限等缺點，阻礙了該體系在生物成像中的應(yīng)用。因此，研究人員通過將魯米諾化學(xué)發(fā)光體系與不同熒光染料連接，得到性能改善的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系。

2007 年，Burgess 課題組將魯米諾衍生物分別與熒光素(λem=524 nm)和尼羅紅(λem=634 nm)共價連接，利用分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移機理，得到發(fā)射波長分別為524 和634 nm 的化學(xué)發(fā)光分子4 和5[8](圖3)。

2015 年，Rochford 課題組將BODIPY 與魯米諾共價連接，利用化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(chemiluminescence resonance energy transfer，CRET)機理，得到具有雙發(fā)射峰(456，514 nm)(圖3)的BODIPY-魯米諾化學(xué)發(fā)光分子6[9]。探針6 被應(yīng)用于檢測活體內(nèi)源性超氧化物，在520 nm 處呈現(xiàn)BODIPY 發(fā)射峰。然而，由于較低的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率和較差的細胞膜穿透能力，探針6 在細胞內(nèi)成像能力相對于母體魯米諾化學(xué)發(fā)光分子較差。因此，通過進一步改進提升CRET 效率和細胞通透性，該類化學(xué)發(fā)光探針有望進一步應(yīng)用于細胞和活體成像。

圖3 基于能量轉(zhuǎn)移的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系Fig.3 Luminol chemiluminescence system based on energy transfer mechanism

2021 年，Wang 課題組基于pH 超敏感納米遞送技術(shù)平臺，構(gòu)建了一類智能近紅外自發(fā)光納米探針7(圖4)，實現(xiàn)了活體內(nèi)淋巴轉(zhuǎn)移的成像檢測與判斷[10]。探針7 由髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)響應(yīng)的化學(xué)發(fā)光分子魯米諾、近紅外探針焦脫鎂葉綠素a(pyropheophorbide a，PPa)和pH 超敏感聚合物3 部分組成。當探針7 進入前哨淋巴結(jié)后，被炎性巨噬細胞吞噬，進而在酸性的巨噬體中解離，隨后魯米諾被腫瘤過表達的MPO 激活發(fā)光，并通過CRET 將藍色的化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)變?yōu)榻t外光。借助該化學(xué)發(fā)光納米探針，作者成功區(qū)分腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和良性淋巴結(jié)；并且在小體積活體腫瘤(100～200 mm3)模型中實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)移性前哨淋巴結(jié)的早期檢測。

圖4 基于魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的納米探針Fig.4 Nanoparticles based on Luminol chemiluminescence system

1.2 魯米諾化學(xué)發(fā)光體系在腫瘤治療中的應(yīng)用

光動力治療(photodynamic therapy，PDT)是一種非侵入性的、光激活的治療手段，可用于多種疾病的治療。然而，目前的光動力療法多依賴于光敏劑(photo sensitizer，PS)吸收外部光源，因此，PDT 的效果仍然受到光源的穿透深度、光敏劑吸光效率的限制?；诨瘜W(xué)發(fā)光不需要外加光源這一顯著優(yōu)勢，可以有效解決外加光源穿透深度限制PDT 治療效果的問題。

2019 年，Wang 課題組設(shè)計開發(fā)了一種新型光療系統(tǒng)8(圖5)，該系統(tǒng)由能夠發(fā)光的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系和血紅蛋白連接的共軛聚合物納米顆粒(Hb-NPs)組成[11]。如圖5 所示，Hb-NPs 可以吸收魯米諾與H2O2作用后產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光，從而敏化由血紅蛋白產(chǎn)生的氧分子，產(chǎn)生活性氧殺死癌細胞。為了提高循環(huán)過程中血紅蛋白的穩(wěn)定性，Hb-NPs 被封裝在融合脂質(zhì)體中，并在與癌細胞接觸后被細胞內(nèi)化。在PDT 過程中，該系統(tǒng)不需要外部光源，且可以解決PDT 過程中細胞內(nèi)氧分子水平不足的問題。

圖5 魯米諾化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)用于光動力治療Fig.5 Luminol chemiluminescence system for photodynamic therapy

2 過氧草酸酯類化學(xué)發(fā)光體系

過氧草酸酯類化學(xué)發(fā)光因具有高靈敏度、高量子產(chǎn)率和化學(xué)發(fā)光時間長等優(yōu)勢，被廣泛用于生物成像和腫瘤治療等領(lǐng)域。

過氧草酸酯類化學(xué)發(fā)光體系屬于間接化學(xué)發(fā)光，一般由草酸酯、氧化劑(通常為過氧化氫)和合適的染料組成。如圖6 所示，當體系中的過氧化氫氧化過氧草酸酯產(chǎn)生過氧酸單元后，過氧酸單元經(jīng)過內(nèi)部環(huán)化反應(yīng)形成電子激發(fā)的1，2-二氧雜環(huán)丁酮中間體；隨后，中間體分解為二氧化碳釋放能量，從而通過CRET 激發(fā)附近的熒光團釋放化學(xué)發(fā)光[12]。

圖6 過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光機理Fig.6 General luminescence mechanism of peroxyoxalate

2.1 過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系在檢測及生物成像中的應(yīng)用

由于過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系遇水易分解，且其化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率易受水的影響，因此，過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系常被設(shè)計為納米顆粒，用于生物活體成像。

2014 年，Rao 課題組將熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)ERT)機理和化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)機理相結(jié)合，設(shè)計開發(fā)了一種基于半導(dǎo)體材料的納米顆粒(圖7)。該納米顆粒具有兩個獨立的成像通道：基于CRET 的過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光通道用于檢測H2O2；基于FRET 的熒光成像通道用于檢測ONOO-和次氯酸鹽[13]。該納米顆粒成功應(yīng)用于對乙酰氨基酚(APAP)和異煙肼(INH)誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，H2O2和ONOO-同時無串擾成像。

圖7 FRET-CRET 半導(dǎo)體聚合物納米顆粒組分結(jié)構(gòu)Fig.7 Composition structure of FRET-CRET semiconductor polymer nanoparticle

近紅外發(fā)光成像技術(shù)具有低背景熒光干擾、較小的組織光損傷和更深的組織穿透性等優(yōu)點，因此，開發(fā)近紅外化學(xué)發(fā)光體系，可以進一步發(fā)揮化學(xué)發(fā)光在活體成像中的優(yōu)勢。

2016 年，Pu 課題組基于草酸酯發(fā)光體構(gòu)建了過氧化氫響應(yīng)的近紅外化學(xué)發(fā)光半導(dǎo)體聚合物納米顆粒9(semiconducting polymer nanoparticles，SPNs)(圖8)[14]。以不同光電特性的聚芴衍生物作為發(fā)光報告分子，分別與底物雙(2，4，6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)配對，得到一系列對H2O2具有高選擇性的SPN，并從中篩選得到化學(xué)發(fā)光性能優(yōu)越的SPN-PFPV。隨后，作者將NIR 染料-硅2，3-萘酚菁雙(三己基甲硅烷基氧化物)(NIR775)作為CRET能量受體摻入SPN-PFPV 中，得到具有近紅外發(fā)射的化學(xué)發(fā)光納米探針SPN-NIR。SPN-NIR 實現(xiàn)了活體內(nèi)外源性H2O2與LPS 誘導(dǎo)的腹膜炎和神經(jīng)炎癥中內(nèi)源性H2O2成像。

圖8 過氧草酸酯類化學(xué)發(fā)光半導(dǎo)體聚合物納米顆粒的組分結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理Fig.8 Composition structure and response mechanism of semiconductor polymer nanoparticle based on peroxyoxalate

2020 年，Zhang 課題組設(shè)計了級聯(lián)CRET 和FRET 過程的過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系，實現(xiàn)了對關(guān)節(jié)炎小鼠的近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ)化學(xué)發(fā)光成像。該體系由化學(xué)發(fā)光底物雙[3，4，6-三氯-2-(戊氧基羰基)苯基]草酸酯(CPPO)和兩個donor-acceptordonor(D-A-D)熒光染料(BTD540，BBTD700)組成[15]。如圖9 所示，CPPO 首先被H2O2氧化成不穩(wěn)定的1，2-二氧雜環(huán)丁酮(DOD)中間體；該中間體分解產(chǎn)生的能量通過CRET 過程轉(zhuǎn)移至BTD540；隨后，BTD540 通過FRET 過程將能量進一步轉(zhuǎn)移至BBTD700，得到近紅外二區(qū)發(fā)射的化學(xué)發(fā)光信號。由于BTD540 和BBTD700 的大斯托克斯位移和高熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，該體系的最大發(fā)射波長可達935 nm，從而在活體內(nèi)成像具有更深的穿透深度和更高的信背比。該體系成功實現(xiàn)了對關(guān)節(jié)炎小鼠中H2O2的近紅外二區(qū)化學(xué)發(fā)光成像。

圖9 過氧化氫激活NIR-II 化學(xué)發(fā)光探針的過程及機理Fig.9 Activation mechanism of NIR-II chemiluminescence probe towards hydrogen peroxide

2.2 過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系在腫瘤治療中的應(yīng)用

2017 年，Liu 課題組構(gòu)建了一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的新型納米診療體系，用于成像指導(dǎo)的化學(xué)激發(fā)光動力治療。該納米體系由雙[2，4，5-三氯-6-(戊氧基羰基)苯基]草酸酯(CPPO)與新型的具有近紅外發(fā)射和活性氧生成能力的AIE 光敏劑TBD 組成(圖10)[16]。H2O2氧化CPPO 產(chǎn)生的化學(xué)能經(jīng)過CRET 過程傳遞給AIE 體系，既能夠產(chǎn)生近紅外化學(xué)發(fā)光信號實現(xiàn)活體腫瘤精準成像，也可以有效產(chǎn)生單線態(tài)氧，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞生長。

圖10 化學(xué)發(fā)光診療體系的構(gòu)建和激活機理Fig.10 Construction and activation mechanism of chemiluminescence diagnosis and treatment system

3 1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系

在魯米諾類和過氧草酸酯類的化學(xué)發(fā)光體系中，需要氧化劑觸發(fā)化學(xué)發(fā)光，因此常被設(shè)計為檢測活性物種的探針，而在檢測其他物種方面應(yīng)用較少。此外，過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系常被設(shè)計為間接化學(xué)發(fā)光探針，而化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移效率會對化學(xué)發(fā)光強度產(chǎn)生較大影響。這些因素限制了魯米諾和過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光體系在生物成像方面的應(yīng)用。

1969 年，Mumford 課題組在3，3，4-三甲基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷熱分解為丙酮和乙醛的過程中觀察到發(fā)光。當在苯溶液中于60 ℃分解時，3，3，4-三甲基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷最大發(fā)射波長為430～440 nm[17](圖11)，該項研究證明了1，2-二氧雜環(huán)丁烷類分子在構(gòu)建化學(xué)發(fā)光體系方面的潛力。

圖11 1，2-二氧雜環(huán)丁烷熱分解發(fā)光過程Fig.11 Thermal decomposition and luminescence process of 1，2-Dioxetane

3.1 1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)展歷程

1982 年，在生物發(fā)光的啟發(fā)下，Schaap 課題組發(fā)現(xiàn)酚羥基取代基的去質(zhì)子化可以將穩(wěn)定的、發(fā)光效率低的二氧雜環(huán)丁烷轉(zhuǎn)化為性能優(yōu)越的發(fā)光中間體[18]。當酚羥基去質(zhì)子形成酚鹽后，電子從酚鹽取代基向雜環(huán)丁烷轉(zhuǎn)移從而引發(fā)1，2-二氧雜環(huán)丁烷的裂解，得到電荷轉(zhuǎn)移激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)的過程中，其能量以光輻射的形式釋放(圖12)。相較于酚羥基取代，酚鹽取代的1，2-二氧雜環(huán)丁烷的分解速率是其4.4 × 106倍，證明酚鹽是產(chǎn)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖12 1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光機理Fig.12 General luminescence mechanism of 1，2-Dioxetane

1987 年，Schaap 課題組在上述結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入了金剛烷取代基，進一步提升了1，2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物的熱穩(wěn)定性[19]，基于此，Schaap 首次開發(fā)出生物酶激活的化學(xué)發(fā)光體系(圖13，化合物10)。同時，由于羥基易于修飾，Schaap 課題組所開發(fā)的這種化學(xué)發(fā)光體系可以作為檢測各種生物物質(zhì)的通用化學(xué)發(fā)光平臺。當檢測底物存在時，羥基的保護基團(即識別基團)斷裂，釋放出不穩(wěn)定的酚鹽結(jié)構(gòu)，隨即發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移和電子回轉(zhuǎn)，導(dǎo)致分子裂變，釋放能量，并激發(fā)苯甲酸酯產(chǎn)生光(圖13)[20]。

圖13 乙酰酯酶激活的二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系及發(fā)光機理Fig.13 Dioxetane chemiluminescence system and luminescence mechanism activated by acetyl esterase

3.2 1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系性能調(diào)控新策略

相較于其他化學(xué)發(fā)光體系，1，2-二氧雜環(huán)丁烷類并不依賴于氧化物種來激發(fā)化學(xué)發(fā)光，因此，該體系可根據(jù)需求構(gòu)建多種化學(xué)探針。然而，早期的1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系仍然存在著易被水猝滅、發(fā)光強度低、發(fā)射波長短等缺點，難以在生物體內(nèi)應(yīng)用。

1989 年，Schaap 課題組將1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光分子和熒光染料包裹在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)中，形成的膠束將化學(xué)發(fā)光分子與水隔離，有效避免了水對化學(xué)發(fā)光的猝滅作用。當化學(xué)發(fā)光分子被激活后，其能量轉(zhuǎn)移至共同包裹在膠束中的熒光染料，使化學(xué)發(fā)光強度相較于單獨化學(xué)發(fā)光體系增強400 倍(圖14，化合物11)[21]。然而，考慮到膠束穩(wěn)定性及毒性問題，基于該策略構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光體系無法用于生物成像。

圖14 基于能量轉(zhuǎn)移的膠束包封的化學(xué)發(fā)光體系Fig.14 Micellar encapsulated chemiluminescence system based on energy transfer

2019 年，Shabat 課題組用熒光染料-β-環(huán)糊精包封1，2-二氧雜環(huán)丁烷形成主客體復(fù)合物。β-環(huán)糊精的包封作用可以有效避免水的猝滅作用，同時化學(xué)能傳遞激活熒光染料能顯著增強化學(xué)發(fā)光。與單獨存在的化學(xué)發(fā)光分子相比，該主客體復(fù)合物使化學(xué)發(fā)光強度增強了1 500 倍，在活體層面實現(xiàn)了LPS 誘導(dǎo)炎癥期間小鼠腹腔內(nèi)內(nèi)源性H2O2成像[22]。

為提升1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光強度，2016 年，Shabat 課題組通過將化學(xué)發(fā)光分子與熒光染料共價連接，得到了熒光顯著增強的化學(xué)發(fā)光體系。當化學(xué)發(fā)光分子結(jié)構(gòu)中與酚羥基相連的保護基團在底物的作用下脫除后，釋放出化學(xué)能，該能量隨即通過共價鍵傳遞至熒光染料，激活染料發(fā)光[23](圖15)?；谝陨显?，該課題組設(shè)計了兩種響應(yīng)β-半乳糖苷酶(β-gal)的化學(xué)發(fā)光探針12 和13，完成了對HEK293-LacZ 細胞中過表達的β-gal 的高對比度成像。當探針在體外被β-gal激活后再進行活體注射，探針12 實現(xiàn)了小鼠皮下注射的外源性β-gal 成像；而借助近紅外化學(xué)發(fā)光特性，探針13 實現(xiàn)了小鼠腹腔內(nèi)注射的外源性βgal 的高對比度成像。

圖15 與熒光染料共價連接的1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系Fig.15 1，2-Dioxetane chemiluminescence system conjugated to fluorescent dyes

雖然將1，2-二氧雜環(huán)丁烷與熒光染料共價連接，可以在一定程度上增強化學(xué)發(fā)光強度，但最終化學(xué)發(fā)光強度會受到化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移效率的影響。此外，基于上述策略構(gòu)建的間接化學(xué)發(fā)光染料還存在著光穩(wěn)定性差、合成困難等缺點。因此，設(shè)計開發(fā)直接化學(xué)發(fā)光的染料和探針，對進一步發(fā)揮化學(xué)發(fā)光在活體成像中的優(yōu)勢十分必要。

2017 年，Shabat 課題組通過在1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光母體結(jié)構(gòu)酚羥基鄰位引入不同吸電子基團，獲得了具有直接化學(xué)發(fā)光且具有高量子產(chǎn)率的化學(xué)發(fā)光染料。該類化學(xué)發(fā)光染料的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率最高可提高3 個數(shù)量級(表1)[24]?；谝陨显O(shè)計策略，Shabat 課題組設(shè)計開發(fā)了系列直接化學(xué)發(fā)光探針用于活體生物酶(化合物19、20)[25-26]、小分子(化合物21、22)[27-28]等的檢測(圖16)。

圖16 基于1，2-二氧雜環(huán)丁烷的化學(xué)發(fā)光探針Fig.16 Chemiluminescence probes based on 1，2-Dioxetane

表1 吸電子取代基對化學(xué)發(fā)光性質(zhì)的影響Tab.1 The influence of electron-withdrawing substituents on chemiluminescence properties

3.3 1，2-二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系波長調(diào)控策略及多模式生物應(yīng)用

上述基于1，2-二氧雜環(huán)丁烷的直接化學(xué)發(fā)光探針可以用于活體成像，但它們的發(fā)射波長大多位于可見光區(qū)，這不利于更深層組織的活體成像。

2017 年，Shabat 課題組將化學(xué)發(fā)光分子與近紅外熒光染料(DCMC)共價連接，擴展了化學(xué)發(fā)光母體的共軛體系，得到了最大發(fā)射波長為690 nm 的直接近紅外化學(xué)發(fā)光染料(圖17，化合物23)。在此染料的基礎(chǔ)上，他們還分別構(gòu)建了對β-gal(化合物24)和H2O2(化合物25)特異性響應(yīng)的近紅外化學(xué)發(fā)光探針，并將H2O2探針用于小鼠炎癥模型活體成像[29]?；诖朔N策略構(gòu)建的近紅外化學(xué)發(fā)光染料具有比較突出的活體成像效果，因此，這類近紅外化學(xué)發(fā)光染料也被設(shè)計為探針用于活體內(nèi)檢測疾病相關(guān)活性物種(化合物26、27、28)[30-31](圖17)。

2021 年，Pu 課題組將二氰基亞甲基-4H-苯并硫代吡喃和二氰基亞甲基-4H-苯并硒基吡喃與二氧雜環(huán)丁烷單元連接，得到了最大發(fā)射波長分別為760 和780 nm 的近紅外化學(xué)發(fā)光染料29 和30(圖17)，基于這兩種染料構(gòu)建的響應(yīng)β-gal 的化學(xué)發(fā)光探針能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細胞和荷瘤小鼠中β-gal 的高對比度成像[32]。

圖17 基于1，2-二氧雜環(huán)丁烷的近紅外化學(xué)發(fā)光探針Fig.17 Near infrared chemiluminescence probes based on 1，2-Dioxetane

基于化學(xué)發(fā)光在活體成像方面的突出優(yōu)勢，2018 年，Shabat 課題組將化學(xué)發(fā)光與前藥相結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光強度來監(jiān)控藥物釋放。如圖18 所示，當探針31 被β-gal 激活后，釋放出單甲基耳他汀E藥物的同時產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。該課題組在細胞水平證明了探針31 的化學(xué)發(fā)光強度與藥物釋放水平具有良好的線性關(guān)系，同時釋放的藥物能夠有效殺死癌細胞[33]。

圖18 基于1，2-二氧雜環(huán)丁烷的化學(xué)發(fā)光探針用于前藥設(shè)計Fig.18 Chemiluminescence probe based on 1，2-Dioxetane for prodrug design

為進一步拓展化學(xué)發(fā)光探針在復(fù)雜生物環(huán)境中的應(yīng)用，2019 年，Pu 課題組報道了單分子熒光-化學(xué)發(fā)光探針32 用于小鼠肝損傷過程中多組分同時雙模態(tài)成像。如圖19 所示，該探針利用化學(xué)發(fā)光成像通道可以實現(xiàn)超氧陰離子的成像；借助熒光成像通道可以檢測caspase-3 的活性。在活體層面，該探針能夠?qū)崿F(xiàn)藥物誘導(dǎo)小鼠肝毒性發(fā)展過程中氧化應(yīng)激和細胞凋亡階段的標記物的縱向檢測和成像[34]。借助雙模態(tài)成像的優(yōu)勢，該探針可以在無光譜串擾的前提下檢測出肝毒性過程中超氧陰離子和caspase-3 水平的順序上調(diào)。這種檢測策略為多目標的檢測提供了新的思路，還成功實現(xiàn)了對急性腎損傷發(fā)展過程中多種目標物的檢測[35-36]。

圖19 單分子熒光-化學(xué)發(fā)光報告分子及其響應(yīng)機理Fig.19 Unimolecular chemo-fluoro-luminescent reporter and response mechanism

4 總結(jié)與展望

相較于其他成像手段，化學(xué)發(fā)光不需要額外的激發(fā)光源，因此，在活體成像中，化學(xué)發(fā)光具有背景熒光干擾小、成像對比度高的突出優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于生物傳感、成像和腫瘤治療等領(lǐng)域。在本文中，我們詳細介紹了魯米諾、過氧草酸酯、1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光機理、設(shè)計策略，以及在生物體內(nèi)檢測活性物種和腫瘤治療等方面的應(yīng)用。

化學(xué)發(fā)光強度低是限制化學(xué)發(fā)光生物應(yīng)用的主要因素，研究人員通過多種策略來增強化學(xué)發(fā)光強度，例如：將化學(xué)發(fā)光體系與熒光染料共價連接，通過化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移過程增強化學(xué)發(fā)光；Shabat 課題組在分子結(jié)構(gòu)中引入不同吸電子基團，構(gòu)建直接化學(xué)發(fā)光染料并提升染料化學(xué)發(fā)光強度，在所得染料的基礎(chǔ)上設(shè)計開發(fā)可生物體內(nèi)檢測酶和活性物種的化學(xué)發(fā)光探針。因此，通過對化學(xué)發(fā)光分子進行結(jié)構(gòu)改進，有望獲得更多性能優(yōu)越的化學(xué)發(fā)光體系。

盡管化學(xué)發(fā)光體系在探針設(shè)計和應(yīng)用方面已取得快速進展，但它仍然存在一些問題亟待解決與突破：1)基于1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光體系已構(gòu)建出多種激活型探針用于檢測生物體內(nèi)的酶和小分子，但此類化學(xué)發(fā)光染料仍然存在著合成路線復(fù)雜、波長較短的問題，限制其在探針設(shè)計、生物傳感和成像方面的應(yīng)用。因此，開發(fā)合成簡單的新型化學(xué)發(fā)光體系，對發(fā)揮化學(xué)發(fā)光的成像優(yōu)勢十分必要。2)近紅外化學(xué)發(fā)光染料已被設(shè)計合成，而相較于近紅外一區(qū)(NIR-I，700～900 nm)，近紅外二區(qū)成像在組織穿透深度和成像信背比方面具有不可比擬的優(yōu)勢。因而，設(shè)計開發(fā)NIR-II 化學(xué)發(fā)光染料和探針將進一步促進化學(xué)發(fā)光在活體成像中的應(yīng)用。3)與一些水溶性、脂溶性熒光染料相似，當化學(xué)發(fā)光探針在生物體內(nèi)被激活時，釋放的染料分子易從反應(yīng)部位擴散，從而較難提供成像的原位信息。因此，開發(fā)能夠原位成像的化學(xué)發(fā)光體系對提升成像準確度具有重要意義。

綜上所述，化學(xué)發(fā)光作為一種成像分析手段，在生物應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢。通過設(shè)計開發(fā)新型化學(xué)發(fā)光體系或?qū)ΜF(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光體系進行修飾和改進，可得到性能更優(yōu)越的化學(xué)發(fā)光體系，擴大其生物應(yīng)用范圍。