小建中湯對潰瘍性結(jié)腸炎幼鼠結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL表達(dá)的影響

李潔 曲梅 黃婧怡 彭淑平

摘要：目的 建立幼鼠潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）模型，小建中湯行治療干預(yù)，以長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding RNA，lncRNA）ANRIL（lncRNA-INK基因座反義鏈非編碼，antisense noncoding RNA in the INK4 locus）為切入點，評估小建中湯對UC幼鼠的治療作用。方法 60只Wistar幼鼠隨機分為空白組，模型組，柳氮磺砒啶（SASP）組，中藥高劑量組，中藥中劑量組，中藥低劑量組，除空白組外，其余各組予3%葡聚糖硫酸鈉（Dextransulfate sodium salt，DSS），造模5天?？瞻捉M，模型組每日予蒸餾水灌胃，SASP組予SASP藥液灌胃，中藥高中低劑量組分別予小建中湯灌胃。用藥7 d后，各組HE染色后評估結(jié)腸病理變化，實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測幼鼠結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測幼鼠結(jié)腸黏膜相關(guān)炎性因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組病理評分顯著增高（P<0.05），與模型組比較，SASP組，中藥各組病理評分下降（P<0.05）;與空白組比較，模型組lncRNA ANRIL表達(dá)顯著增高（P<0.05），與模型組比較，SASP組，中藥各組lncRNA ANRIL表達(dá)下降（P<0.05）;與空白組比較，模型組IL-1β表達(dá)顯著增高（P<0.05），與模型組比較，SASP組，中藥各組IL-1β表達(dá)下降（P<0.05）。結(jié)論 小建中湯可下調(diào)結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL的表達(dá)，抑制下游炎癥因子IL-1β的分泌，達(dá)到治療UC幼鼠的目的。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎;小建中湯;長鏈非編碼核糖核酸ANRIL;白細(xì)胞介素-1β

中圖分類號：R516.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）05-0071-04

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種難治性炎癥性腸病，病因未明，病變可累及整段結(jié)腸，以腹痛、腹瀉、血便為主要臨床表現(xiàn)[1-2]。近年研究表明，UC兒童患者逐年增加，發(fā)病較成人更為嚴(yán)重[3]。因此完善兒童UC的早期診療，是臨床熱點之一。目前內(nèi)鏡、腸黏膜病理活檢是UC的有效診斷方法，但其創(chuàng)傷大，兒科應(yīng)用受到限制[4]。Cuixia Qiao等[5]發(fā)現(xiàn)lncRNA ANRIL的上調(diào)可促進(jìn)UC的發(fā)展，lncRNA ANRIL有望成為診斷兒童UC的新指標(biāo)。UC難治愈，易復(fù)發(fā)，兒童可選藥物少，中藥復(fù)方小建中湯由桂枝三兩，芍藥六兩，炙甘草二兩，生姜三兩，大棗十二枚，膠飴一升，6味中藥組成，具有“溫中健脾”的功效，與兒童“脾常不足”病機契合，且其味道甘甜，更能讓兒童接受。有研究表明小建中湯可明顯改善“脾胃虛寒”型UC患者的臨床癥狀及體征[6-8]。本研究通過DSS冰水溶液誘導(dǎo)幼鼠“脾胃虛寒”型UC模型，根據(jù)幼鼠結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL及下游炎癥因子IL-1β表達(dá)的變化，探討小建中湯對兒童UC的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠雄性，3周齡（剛斷乳），體質(zhì)量40～50 g，動物合格證：44002100029803，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心提供。

1.2 主要試劑 DSS（分子量為36000～50000），貨號160110，由美國mpbio公司提供;RNAiso Plus，貨號R0901，由美國sigma公司提供;SYBR Premix Ex TaqTM，貨號PR036A，由寶生物工程（大連）有限公司提供;ELISA IL-1β試劑盒，貨號ml037361，由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供;SASP，批號09210409，由上海信誼天平藥業(yè)有限公司提供;中藥飲片由深圳寶安人民醫(yī)院藥房提供;

1.3 分組與造模 將60只Wistar大鼠隨機分為空白組，模型組，柳氮磺砒啶組，中藥高劑量組，中藥中劑量組，中藥低劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組予0℃冰水灌胃，3%DSS冰水溶液代替飲用水，10℃涼水浴15 min/d，造模周期5 d。

1.4 給藥 空白組與模型組每日予蒸餾水灌胃。柳氮磺吡啶成人每天用量為4～6 g，按成人等效劑量，柳氮磺吡啶組幼鼠每天用藥量為0.45 g/kg。小建中湯由桂枝9 g，白芍18 g，生姜9 g，大棗12 g，炙甘草6 g，飴糖40 g組成，常規(guī)煎藥，過濾，以成人等效劑量作為中劑量組，中藥高、中、低劑量組幼鼠每天分別予生藥量16.92 g/kg，8.46 g/kg，4.23 g/kg。

1.5 取樣 麻醉處死大鼠，取整段結(jié)腸，清理內(nèi)容物，生理鹽水洗凈，濾去多余水分。

1.6 病理組織結(jié)果

1.6.1 固定與包埋 截取中段結(jié)腸0.5 cm，4%多聚甲醛固定24 h;梯度乙醇脫水，70%乙醇1 h，85%乙醇1 h，95%乙醇1 h，100%乙醇50 min（重復(fù)2次）;二甲苯透明30 min（重復(fù)2次）;55℃石蠟封片（重復(fù)2次）;模具包埋。

1.6.2 切片 切取3 μm厚度，置于多聚賴氨酸附膜的載玻片上，65℃烘烤2 h。

1.6.3 染色 二甲苯脫蠟10 min（重復(fù)2次）;梯度乙醇置換二甲苯，100%乙醇5 min（重復(fù)2次），95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水沖洗5 min（重復(fù)2次）;明礬蘇木素浸染15 min，蒸餾水沖洗15 min;淡氨水返藍(lán)1 min;1%伊紅酒精液染色3 min;梯度乙醇脫水，95%乙醇30 sec，100%乙醇30 sec（重復(fù)2次）;二甲苯60 sec（重復(fù)3次）;中性樹膠封片。

1.6.4 光鏡下觀察 鏡下病理評分標(biāo)準(zhǔn)如下[9]：炎癥程度，無炎癥，0分;輕度炎癥，1分;重度炎癥，2分。病變深度：無病變，0分;病變侵及黏膜下層，1分;病變侵及肌層，2分;病變侵及漿膜層，3分。隱窩損傷：無損傷，0分;基底1/3隱窩被破壞，1分;基底2/3隱窩被破壞，3分;全部隱窩和上皮被破壞，4分。病理評分=炎癥+病變深度+隱窩損傷。

1.7 結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL的表達(dá)

1.7.1 總RNA提取 取100 mg結(jié)腸黏膜樣本，加入1mL RNAiso Plus，冰面研磨，離心后取上清液;加入200 μL氯仿，震蕩，離心后取上清液;加入同體積異丙醇，靜置，離心，取沉淀;加入1 mL 75%酒精，吹打，離心，取沉淀;待酒精揮發(fā)，加入50 μL去離子DEPC水，沉淀溶解后，-20℃保存。

1.7.2 引物合成 查閱文獻(xiàn)，確定引物序列，以GAPDH為內(nèi)參。見表1。

1.7.3 參照試劑盒說明操作，行逆轉(zhuǎn)錄及qPCR反應(yīng)，采用2-△△Ct法，對結(jié)果分析。

1.8 結(jié)腸黏膜IL-1β的表達(dá)

1.8.1 結(jié)腸黏膜勻漿液提取 取100 mg結(jié)腸黏膜樣本，加入1 mL 0.1M PBS，冰面研磨，離心后取上清液-20℃保存。

1.8.2 參照試劑盒說明操作，計算濃度，對結(jié)果分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸病理組織切片觀察 空白組結(jié)腸標(biāo)本未見明顯病理變化;模型組結(jié)腸標(biāo)本見黏膜水腫，腸腺體破壞，大量炎細(xì)胞浸潤;藥物各組均見不同程度黏膜水腫，腸腺體破壞，炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 結(jié)腸病理組織切片評分結(jié)果 與空白組比較，模型組結(jié)腸病理評分顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，柳氮磺砒啶組表達(dá)，中藥各組表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。見表2。

2.3 結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL表達(dá)結(jié)果 與空白組比較，模型組lncRNA ANRIL表達(dá)結(jié)果顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，柳氮磺砒啶組表達(dá)，中藥各組表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。見表3。

2.3 結(jié)腸黏膜IL-1β表達(dá)結(jié)果 與空白組比較，模型組IL-1β表達(dá)結(jié)果顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，柳氮磺砒啶組表達(dá)，中藥各組表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。見表4。

3 討論

UC是可累及全腸的難治性疾病，臨床表現(xiàn)以腹痛、腹瀉、黏液血便為主，屬中醫(yī)“泄瀉”“腸風(fēng)”范疇。兒童患者逐年增加，診斷困難，較成人表型更嚴(yán)重。lncRNA是序列長度大于200核苷酸的非編碼RNA。越來越多證據(jù)表明，LncRNA在UC的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10、11]。ANRIL位于染色體9p21區(qū)[12]，近年研究普遍認(rèn)為lncRNA ANRIL的上調(diào)可促進(jìn)UC的發(fā)生發(fā)展，lncRNA ANRIL的表達(dá)有望成為UC診斷的指標(biāo)。

IL-1β是白細(xì)胞介素IL-1的一種，參與多種生物學(xué)效應(yīng)，上調(diào)免疫，促進(jìn)下游細(xì)胞因子分泌，引起腸道炎癥反應(yīng)[13]，在UC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

現(xiàn)已有大量的臨床研究應(yīng)用小建中湯治療消化性潰瘍[14]。兒童UC可選藥物少，中醫(yī)藥治療兒童UC療效肯定，兒童脾常不足，喜食生冷，UC證型以“脾胃虛寒”居多，中藥復(fù)方小建中湯是溫中健脾的經(jīng)典方，針對兒童“脾胃虛寒”型UC療效確切。

DSS誘導(dǎo)的UC動物模型應(yīng)用廣泛，重復(fù)率高，病理學(xué)表現(xiàn)跟人類UC相似[15]。本研究通過物理刺激聯(lián)合3%DSS冰水溶液代替飲用水，誘導(dǎo)“脾胃虛寒型”UC幼鼠模型[16]，模擬兒童“脾胃虛寒型”UC，予SASP，小建中湯行治療干預(yù)，以結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL表達(dá)的改變?yōu)榍腥朦c。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組幼鼠可出現(xiàn)足溫下降，扎堆，消瘦，血便，癥狀與“脾胃虛寒”病機契合，而用藥各組均能不同程度改善上述癥狀。模型組結(jié)腸病理評分較正常組結(jié)腸病理評分顯著增高，用藥各組結(jié)腸病理評分較模型組結(jié)腸病理評分明顯下降。模型組幼鼠結(jié)腸黏膜lncRNA ANRIL，IL-1β表達(dá)顯著升高，提示lncRNA ANRIL參與UC的發(fā)生發(fā)展，機理可能與lncRNA ANRIL過度表達(dá)可促進(jìn)IL-1β分泌相關(guān)。中藥各組幼鼠結(jié)腸黏膜中l(wèi)ncRNA ANRIL，IL-1β的表達(dá)較模型組均有不同程度的下降，證明復(fù)方小建中湯可下調(diào)“脾胃虛寒”型UC幼鼠lncRNA ANRIL的表達(dá)，抑制IL-1β分泌，從而達(dá)到治療UC的目的。

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（收稿日期：2021-11-12）