超聲波細(xì)胞破碎法輔助提取山黃皮果熊果酸的工藝優(yōu)化

王冬梅，黃振勇，梁曉君，韋馨平，任惠，淡明，徐兵強(qiáng)，張娥珍*

（1.南寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 南寧 530021；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海南 海口 570000）

山黃皮果（Clausena excavata），俗稱雞皮果，因其果實(shí)熟透后果皮色澤和經(jīng)絡(luò)像煮熟的雞皮而得名，屬蕓香科黃皮屬多年生樹種，主要分布于我國廣西、云南、廣東等地，越南、菲律賓等國家也有少量分布[1]。山黃皮果實(shí)中含有豐富的維生素C[2]、氨基酸[3-4]、黃酮[5]和多種萜烯類化合物[6]，營養(yǎng)價(jià)值極高，屬食藥兩用植物，果實(shí)可新鮮食用、干燥入藥或用作調(diào)味品等，具有消脂健胃、清熱解毒等功效。熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸，是一種五環(huán)三萜類天然化合物，普遍存在各種水果和植物中，熊果酸不溶于水，易溶于醇類，具有良好的抗氧化性。熊果酸在抑制腫瘤[7]、降血糖[8]、降血脂[9]、護(hù)肝[10]、減肥[11]以及治療代謝綜合癥[12]等方面具有顯著效果，在功能產(chǎn)品開發(fā)上具有較高的開發(fā)潛力。市面上山黃皮果的產(chǎn)品常見的為其干制品、鹽漬品和醬制品[13]，近年來對山黃皮果的研究也多集中在種質(zhì)資源收集和品種選育方面[14-16]，山黃皮果實(shí)黃酮[17]、揮發(fā)油[18]等，但加工方面的研究比較少，尤其對其果實(shí)熊果酸方面的研究報(bào)道較少。目前熊果酸的提取主要有回流法[19]、超臨界萃取[20]、亞臨界提取[21]、微波輔助提取[22]和超聲波輔助提取[23]等方法，其中比較常用的是超聲波輔助提取法，操作簡單，提取效果好。山黃皮果具有非常好的開發(fā)應(yīng)用前景，但是目前山黃皮果深加工方面的開發(fā)力度有限，產(chǎn)品附加值不高，產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。本研究采用超聲波細(xì)胞破碎法對山黃皮果實(shí)中熊果酸進(jìn)行提取，通過單因素和響應(yīng)面法相結(jié)合優(yōu)化熊果酸提取工藝，為特色功能食品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

山黃皮果（桂研15號）：采自廣西龍州縣。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、香蘭素、冰乙酸、乙酸乙酯（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

超聲波細(xì)胞破碎儀（JY98-Ⅲ DN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)（3-18KS）：西格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-100F型）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；高速萬能粉碎機(jī)（FW80）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-6100）：上海元析儀器有限公司；電子分析天平（ATX-124）：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 山黃皮果的預(yù)處理

新鮮采摘回來的山黃皮果用流動水清洗，瀝干水分，去除果蒂，對半橫切，平鋪于凍干盤中，放置至真空冷凍干燥機(jī)，設(shè)置冷阱溫度-65℃，樣品溫度35℃，真空度≤60 Pa，進(jìn)行自動凍干[24]。凍干后的山黃皮果取出后用高速萬能粉碎機(jī)迅速打粉，裝入塑料袋封口密封，-20℃冰箱貯藏備用。

1.2.2 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

熊果酸的測定采用分光光度法[25]。分別準(zhǔn)確移取0.4 mg/mL 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL于10 mL比色管，加熱揮干去除溶劑，冷卻后依次加入0.8mL5%香蘭素冰乙酸溶液和2mL高氯酸，混合均勻，60℃水浴30 min，流動水冷卻至25℃，用乙酸乙酯定容至10 mL，混勻，以不添加熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液管作為空白對照，于546nm波長處測量吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸曲線方程：y=0.034 6x-0.026 7，R2=0.999 1。

1.2.3 山黃皮果熊果酸提取工藝

熊果酸提取工藝參考陳靜等[26]方法并作修改。山黃皮果粉按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，加熱煮沸10 min，抽濾，收集濾渣進(jìn)行真空冷凍干燥。稱取一定量干燥后的山黃皮果渣粉，按一定料液比加入乙醇溶液，超聲波細(xì)胞破碎提取一定時(shí)間，離心取上清液即為待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定待測液熊果酸含量。熊果酸提取量計(jì)算公式如下。

式中：X為提取液中熊果酸含量，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)單因素變量原則，分別考察料液比為1∶10、1 ∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%，超聲功率為 150、200、250、300、350 W 和超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60 min 對山黃皮果熊果酸提取效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素為影響因素，以熊果酸提取量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10軟件，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案因素水平Table 1 Response surface design factor level

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

采用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析，用Origin pro 2017進(jìn)行顯著性分析并繪圖，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對熊果酸提取效果的影響

料液比對山黃皮果熊果酸提取的影響見圖1。

圖1 料液比對熊果酸提取效果的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on ursolic acid extraction

由圖1可知，一定范圍內(nèi)，提高溶劑用量能顯著提高山黃皮果熊果酸的提取量（P<0.05），當(dāng)料液比為1 ∶25（g/mL）時(shí)，熊果酸含量最高達(dá)到了 4.67 mg/g；隨著溶劑用量繼續(xù)升高，熊果酸提取量逐步下降，但變化不大（P>0.05）。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是適當(dāng)提高溶劑用量有助于超聲波空化作用的形成，促進(jìn)熊果酸的溶出，但是溶劑用量過高對空化作用有所削弱，導(dǎo)致熊果酸提取量下降[27]。綜合考慮，料液比選擇在1 ∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）較為適宜。

2.2 乙醇濃度對熊果酸提取效果的影響

乙醇濃度對山黃皮果熊果酸提取的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對熊果酸提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on ursolic acid extraction

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度從40%提高到50%時(shí)，熊果酸提取量從3.16 mg/g提高到了4.58 mg/g，提高了44.81%，提高效果顯著（P<0.05）；在乙醇濃度為60%時(shí)，熊果酸提取量達(dá)到了5.02 mg/g，顯著高于其他處理（P<0.05）；當(dāng)繼續(xù)提高乙醇濃度，熊果酸提取量有明顯下降趨勢（P<0.05）。熊果酸易溶于有機(jī)溶劑，一定范圍內(nèi)提高乙醇濃度，使乙醇濃度的極性與熊果酸相近，有利于熊果酸的溶出，但是繼續(xù)提高乙醇濃度，其溶液極性與熊果極性差距加大，會導(dǎo)致提取量下降[25]。綜合考慮，山黃皮果熊果酸提取在乙醇濃度50%～70%較為適宜。

2.3 超聲功率對熊果酸提取效果的影響

超聲功率對山黃皮果熊果酸提取效果的影響見圖3。

圖3 超聲功率對熊果酸提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on ursolic acid extraction

由圖3可知，超聲功率從150 W增加到200 W時(shí)，山黃皮果熊果酸提取量從4.23mg/g提高到4.96mg/g，提高了17.06%，效果顯著（P<0.05）；在超聲功率為250 W時(shí)，熊果酸提取量最高達(dá)到5.06 mg/g，隨著超聲功率增加，熊果酸提取量變化不明顯（P>0.05），在超聲功率增加到350 W時(shí)，熊果酸含量有顯著下降（P<0.05）。從能耗方面考慮，山黃皮果熊果酸提取超聲功率范圍選擇在200 W～300 W之間較為適宜。

2.4 超聲時(shí)間對熊果酸提取效果的影響

超聲時(shí)間對山黃皮果熊果酸提取效果的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對熊果酸提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on ursolic acid extraction

由圖4可知，20 min～40 min時(shí)，熊果酸提取量差異不顯著（P>0.05）；在超聲時(shí)間為50 min時(shí)，熊果酸提取量達(dá)4.75 mg/g，高于其他處理。隨著超聲時(shí)間的延長，熊果酸提取量有所降低，在超聲時(shí)間為70 min時(shí)，熊果酸提取量顯著低于其他處理（P<0.05），其中原因可能是超聲時(shí)間過長，在超聲波的熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)作用下，熊果酸發(fā)生分解[28]，從而導(dǎo)致含量降低。因此，超聲時(shí)間在40 min～60 min較為適宜。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化山黃皮果熊果酸提取工藝

2.5.1 回歸模型建立和方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以熊果酸提取量為響應(yīng)值，以料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間為影響因素，用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表2和表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 2 Results of response surface optimization

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y=5.02+0.28A+0.15B-0.013C+0.19D+0.076AB-0.38AC-0.064AD+0.10BC+0.20BD-0.1CD-0.52A2-0.5B2-0.36C2-0.11D2。

由表3可知，模型P<0.01，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)P>0.05，表現(xiàn)為不顯著。決定系數(shù)R2=0.997 1，調(diào)整后系數(shù)R2Adj=0.994 1，說明模型擬合效果較好。各因素對山黃皮果熊果酸提取影響的順序：料液比>超聲時(shí)間>乙醇濃度>超聲功率。除一次項(xiàng)C對山黃皮果熊果酸提取影響不顯著外，其他項(xiàng)影響均極顯著（P<0.01）。

2.5.2 交互作用分析

各因素對山黃皮果熊果酸提取影響的響應(yīng)面和等高線見圖5～圖10。

圖8 乙醇濃度與超聲功率響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surface and contour of ethanol concentration and ultrasonic power

圖9 乙醇濃度與超聲時(shí)間響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface and contour of ethanol concentration and ultrasonic time

圖10 超聲功率與超聲時(shí)間響應(yīng)面及等高線Fig.10 Esponse surface and contour of ultrasonic power and ultrasonic time

響應(yīng)面中，曲線越彎曲、邊線越陡則該因素對多糖提取率的影響越大，等高線呈橢圓說明因素間交互影響顯著[29-30]。從圖5～圖10響應(yīng)面曲面可知，各交互項(xiàng)曲面均較為陡峭，隨著各因素的增加，響應(yīng)值均呈先增加后減少的趨勢，等高線接近橢圓，說明各交互項(xiàng)對響應(yīng)值的影響都極顯著（P<0.01），結(jié)果與方差分析一致。

2.5.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得到的最佳工藝參數(shù)：料液比1∶26.6（g/mL）、乙醇濃度 59.51%、超聲功率 233.69 W、超聲時(shí)間59.75 min，在此工藝上，山黃皮果熊果酸提取量理論值為5.16 mg/g?？紤]實(shí)際可操作性，調(diào)整工藝參數(shù)為料液比1∶27（g/mL）、乙醇濃度60%、超聲功率234 W、超聲時(shí)間60 min。對所得最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，做3個(gè)平行試驗(yàn)取平均值，結(jié)果得到山黃皮果熊果酸的提取量為5.15 mg/g，接近預(yù)測值。由此表明，預(yù)測值與實(shí)際值有良好的擬合性，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠，該工藝可有效提高山黃皮果熊果酸提取量。

3 結(jié)論

熊果酸是一種天然三萜類化合物，具有抗致癌、抗促癌、降血糖等多種生物學(xué)活性，有較高的開發(fā)利用價(jià)值。本試驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)上，以熊果酸提取量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波細(xì)胞破碎法輔助提取山黃皮果熊果酸的工藝條件，確定了各因素對山黃皮果熊果酸提取量的影響順序?yàn)榱弦罕?超聲時(shí)間>乙醇濃度>超聲功率。優(yōu)化后山黃皮果熊果酸的最佳工藝條件為料液比1∶27（g/mL）、乙醇濃度60%、超聲功率234 W、超聲時(shí)間60 min，根據(jù)此工藝山黃皮果熊果酸的提取量達(dá)5.15 mg/g。