橙葉總黃酮的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及性質(zhì)探究

李 丹， 汪秀妹， 何雅婷

( 1.莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院， 福建 莆田 351100；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室， 福建 莆田 351100；3.生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學(xué)校重點實驗室， 福建 莆田 351100 )

0 引言

橙子是具代表性的柑橘果樹。 研究表明， 橙子的樹葉中含有一定量的黃酮[1]。 黃酮有消炎、鎮(zhèn)靜和抗菌等作用， 是良好的活性氧清除劑[2]。黃酮安全無毒， 已被應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。柑橘類植物中的黃酮類化合物擁有消炎和抗過敏等特性[3]， 在日用化工領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。 我國的柑橘資源非常豐富， 深入開發(fā)柑橘類植物中的黃酮資源， 有巨大的經(jīng)濟和社會效益。超聲波提取法是一種分離并提取植物中天然活性成分的有效方法， 利用超聲波的空化效應(yīng)特性加速溶出植物中的有效成分。 跟其他傳統(tǒng)的方法相比， 超聲波提取法具有不破壞有效成分結(jié)構(gòu)、 效率高和時間短等優(yōu)點[4]。 近些年來， 超聲波提取法越來越多地被應(yīng)用于銀杏、 金銀花、 金線蓮、 黃連、 葛根等植物中的黃酮提取[5]。

本文以橙葉為原料， 利用超聲波技術(shù)， 在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取橙葉中黃酮的工藝， 并對橙葉總黃酮提取物的穩(wěn)定性、 抗氧化活性和抑菌性進行研究， 以期為開發(fā)天然抗氧化劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙葉: 采摘于福建省莆田市白沙地區(qū)種植的贛南臍橙果樹； 蘆丁標準品、 ABTS 純度99 %，購于上海源葉生物科技有限公司； 亞硝酸鈉、 硝酸鋁、 無水乙醇、 抗壞血酸、 三氯化鐵等均為分析純， 購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24 型恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)， AR12CN 型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)， KQ-600KDE 型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)， UV-5500PC 紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)， DGG-9053A 型電熱鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)， RE85C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 橙葉粉末樣品的制備

橙新葉集中采摘于3 月， 完整無腐敗， 洗凈， 剪碎， 放置于烘箱中50℃干燥6 h， 粉碎后的橙葉碎渣過50 目篩， 最后把收集的橙葉粉末裝進密封袋中， 在低溫、 干燥的環(huán)境中保存， 備用。

1.3.2 橙葉總黃酮的提取及總黃酮含量的測定

參考陳建琴等[6]的方法提取橙葉黃酮， 在510 nm 處測定蘆丁標準品溶液和橙葉總黃酮粗提液的吸光值， 繪制曲線， 其回歸方程為y＝11.179x-0.3116， 相關(guān)系數(shù)R2＝0.9994。 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法測定橙葉總黃酮得率。

式(1)中:c是橙葉總黃酮粗提液濃度， g/L；v是橙葉總黃酮粗提液體積， L；m是橙葉粉末質(zhì)量， g。

1.3.3 單因素試驗

固定料液比1 ∶40、 超聲浸提溫度70℃、 超聲浸提時間30 min、 超聲功率400 W， 研究乙醇濃度(40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%)對橙葉總黃酮得率的影響； 固定乙醇濃度60%、超聲浸提溫度70℃、 超聲浸提時間30 min、 超聲功率400 W， 研究料液比(1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40、 1 ∶50、 1 ∶60 g/mL)對橙葉總黃酮得率的影響； 固定料液比1 ∶40、 乙醇濃度60%、 超聲浸提時間30 min、 超聲功率400 W，研究超聲浸提溫度(30℃、 40℃、 50℃、 60℃、70℃、 80℃)對橙葉總黃酮得率的影響； 固定料液比1 ∶40、 乙醇濃度60%、 超聲浸提溫度70℃、 超聲功率400 W， 研究超聲浸提時間(20、30、 40、 50、 60、 70 min)對橙葉總黃酮得率的影響； 固定料液比1 ∶40、 乙醇濃度60%、 超聲浸提溫度70℃、 超聲浸提時間30 min， 研究超聲功率(240、 300、 360、 420、 480、 540 W)對橙葉總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化

響應(yīng)面的因素水平表見表1。 受實驗室設(shè)備的限制， 超聲波功率只能調(diào)節(jié)為10 的整數(shù)倍，因此響應(yīng)面試驗的超聲波功率都取單因素試驗的最優(yōu)值420 W。 在單因素試驗的基礎(chǔ)上， 采用Box-behnken 試驗得到最佳提取工藝。 隨后對模 型進行3 次驗證試驗。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與因素水平

1.3.5 橙葉總黃酮抗氧化活性測定

橙葉總黃酮以800 mg/L 為初始濃度， 采用二倍稀釋法用無水乙醇依次稀釋至0.78 mg/L，以同濃度的抗壞血酸為對照。 參考艾薇等[7]的方法測定樣品對ABTS＋·清除能力。 參考程宏楨等[8]的方法測定樣品對Fe3＋還原能力。

1.3.6 抑菌試驗

參考曾俊等[9]的方法， 橙葉總黃酮用無水乙醇采用二倍稀釋法配制成800、 400、 200、 100、50、 25、 12.5、 6.25、 3.13 g/L 的待測樣品溶液， 以蒸餾水為空白對照， 觀察抑菌圈。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2020 整合， 采用Origin8.5繪圖， 利用SPSS22.0 軟件計算半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration， IC50)。 所有試驗均3 次重復(fù)， 數(shù)據(jù)以 “均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

乙醇濃度對橙葉總黃酮得率的影響見圖1(a)， 當乙醇濃度為60%時得率最高， 為(6.01±0.02)%， 因此乙醇濃度選擇60%。 料液比對橙葉總黃酮得率的影響見圖1(b)， 料液比為1 ∶40 g/mL 時得率最高， 為(5.94±0.03)%， 因此料液比設(shè)定在1 ∶40 g/mL。 超聲浸提溫度對橙葉總黃酮得率的影響見圖1 (c)， 超聲浸提溫度為70℃時得率最高， 為(6.01±0.02)%， 因此超聲浸提溫度選取70℃。 超聲浸提時間對橙葉總黃酮得率的影響見圖1(d)， 當提取時間達到30 min 時得率最高， 為(7.32±0.01)%， 因此超聲浸提時間選擇30 min。 超聲功率對橙葉總黃酮得率的影響見圖1(e)， 超聲功率420 W 時得率最高，為(6.66±0.01)%， 所以超聲功率設(shè)定在420W。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 分析設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面分析優(yōu)化結(jié)果見表2。 得到響應(yīng)面的回歸方程:Y ＝7.65-0.092A ＋0.12B ＋0.042C-0.020D ＋0.068AB ＋0.041AC ＋6.500×10-3AD ＋0.030BC ＋0.046BD ＋0.029CD -0.18A2-0.27B2-0.22C2-0.21D2。 式中，Y、A、B、C、D分別代表橙葉總黃酮得率、 乙醇濃度、 料液比、 超聲浸提溫度、 超聲浸提時間。 回歸模型的方差分析見表3。 如表3 所示， 模型的P ＜0.0001， 代表回歸模型極顯著； 模型失擬項P ＞0.05， 不顯著， 表明此試驗?zāi)Ｐ涂煽俊?此模型的相關(guān)校正系數(shù)R2＝0.956 1， 校正絕對系數(shù)RAdj2＝0.9122， 表明試驗誤差小， 模型擬合程度較高。 其中A、B的P值均小于0.01， 表明其對Y有極顯著的影響。 因素C和AB的P值均小于0.05， 表明其對Y有顯著的影響。 由F值可知各因素對橙葉總黃酮得率影響的大小順序為:B(料液比)＞ A(乙醇濃度)＞ C(超聲浸提溫度)＞D(超聲浸提時間)。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 等高線和響應(yīng)面分析因素間的交互作用

料液比(B)和乙醇濃度(A)交互作用對橙葉總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線圖見圖2。 響應(yīng)面的陡峭程度越大， 交互作用越顯著。 交互作用的顯著度也與等高線的橢圓度成正比。 從圖2 可以看出， 交互作用AB 響應(yīng)面陡峭， 等高線橢圓，表示交互作用AB 顯著影響橙葉總黃酮的提取效果。 這與表3 的結(jié)果一致。

圖2 料液比和乙醇濃度對橙葉總黃酮得率的響應(yīng)面和等高線圖

2.2.3 驗證試驗

響應(yīng)面軟件的優(yōu)化分析結(jié)果為: 乙醇濃度57.91%、 料液比1 ∶41.99 g/mL、 超聲波浸提溫度70.88℃、 超聲浸提時間29.76 min 時， 得到理論最佳橙葉總黃酮得率為7.67%。 為驗證試驗結(jié)果的穩(wěn)定性， 采用優(yōu)化工藝條件做驗證試驗，乙醇濃度58.0%、 料液比1 ∶42 g/mL、 超聲浸提溫度71.0℃、 超波浸提時間30 min， 重復(fù)試驗3次， 得到橙葉總黃酮得率為(7.64 ± 0.03)%。試驗結(jié)果與理論結(jié)果相近， 進一步表明了試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.3 抗氧化活性測定結(jié)果

橙葉總黃酮和抗壞血酸對ABTS＋·的清除效果見圖3。 濃度≥50 mg/L 條件下， 抗壞血酸和橙葉總黃酮對ABTS＋·均有90%以上的清除率。 當濃度為800mg/L 時， 抗壞血酸可清除99%的ABTS＋· ，橙葉總黃酮可清除98.79%的ABTS＋·， 二者清除能力接近。 由計算得出， 抗壞血酸和橙葉總黃酮清除ABTS＋·的IC50 值分別為1.80 和20.98 mg/L。 結(jié)果表明橙葉黃酮可以有效地清除ABTS＋·， 具有良好的體外抗氧化活性。 橙葉總黃酮和抗壞血酸對Fe3＋還原能力效果見圖4。 樣品的Fe3＋還原能力通過所測得的吸光度值反應(yīng)出來， 吸光度的數(shù)值越大， 對Fe3＋的還原能力越大， 其體外抗氧化活性就越強。 由圖4 可知， 在濃度為0.78～50 mg/L 時， 橙葉總黃酮對Fe3＋的還原能力略大于抗壞血酸。 隨著濃度增大， 抗壞血酸對Fe3＋的還原能力大于橙葉總黃酮， 橙葉總黃酮及抗壞血酸的還原能力均呈現(xiàn)較好的上升趨勢。

圖3 橙葉總黃酮和抗壞血酸對ABTS+·的清除作用

圖4 橙葉總黃酮和抗壞血酸對Fe3+的還原能力

2.4 抑菌試驗結(jié)果

橙葉總黃酮對大腸桿菌的抑制作用見圖5。通過觀察抑菌圈的大小， 評估橙葉總黃酮對大腸桿菌的抑制效果: 抑菌圈越大， 則表示抑菌作用越強[10-11]。 由圖5 可以看出， 橙葉總黃酮對大腸桿菌具有較明顯的抑制效果。 抑菌作用隨總黃酮濃度升高而增強。 橙葉總黃酮抑制大腸桿菌的最低濃度為12.5 g/L。

圖5 橙葉總黃酮對大腸桿菌的抑制作用

3 結(jié)語

天然抗氧化劑由于其毒性和副作用一般較低， 作為營養(yǎng)補充劑在過去幾年中得到越來越多的重視。 自由基， 包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)， 是通過線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的， 自由基的正作用和破壞作用的微妙平衡對生命體至關(guān)重要， 當ROS 和RNS 的產(chǎn)生超過機體的防御和抗氧化劑的作用時， 氧化應(yīng)激就可能產(chǎn)生， 這是幾種退行性疾病發(fā)生的根本原因[12]。 黃酮類物質(zhì)充當抗氧化劑， 具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性。研究表明， 植物黃酮能夠預(yù)防癌癥、 心血管疾病、 糖尿病[13]。 因此研究植物黃酮的提取具有重要的生物學(xué)意義。

中國的柑橘資源非常豐富， 每年修剪的枝葉是一份巨大的資源， 而這些含有豐富黃酮類化合物的資源大多數(shù)沒有被直接利用， 通常被作為廢棄物處理。 因此， 從橙葉中提取黃酮， 可為橙葉的處置提供思路， 使資源得到更加充分的利用。

采用超聲輔助提取橙葉總黃酮， 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法得到橙葉總黃酮的最優(yōu)提取條件為: 乙醇濃度58%、 料液比1 ∶42 g/mL、 超聲浸提溫度71℃、 超聲浸提時間30 min。 抗氧化活性測定結(jié)果顯示了橙葉總黃酮的抗氧化活性良好。 抑菌試驗結(jié)果表明， 橙葉總黃酮對大腸桿菌有明顯的抑制作用。 本研究為開發(fā)天然抗氧化劑提供了數(shù)據(jù)支持， 具有一定的現(xiàn)實意義。