火麻仁多肽的制備及減肥功能研究

◎ 徐 梅，王常青，趙大洲

（1.廈門(mén)元之道生物科技有限公司，福建 廈門(mén) 361100；2.山西大學(xué)，山西 太原 030006）

火麻（Cannabis sativaL.）又名漢麻、線麻等，為?？拼舐閷僖荒晟荼局参?，廣泛分布在亞歐的溫帶和熱帶地區(qū)，成熟的火麻仁種子可提取食用油脂和蛋白質(zhì)?；鹇槿势墒翘崛∈秤没鹇槿视秃蟮娘炂桑鞍踪|(zhì)含量50%～70%，國(guó)內(nèi)外已見(jiàn)到用蛋白酶水解火麻仁蛋白制取多肽的報(bào)道[1-2]?，F(xiàn)有制備的火麻仁多肽的工藝多采用堿溶酸沉法提取火麻仁蛋白，然后再用堿性或中性蛋白酶水解多肽，獲得的活性多肽為抗氧化肽和降壓肽，目前尚未見(jiàn)到用多種蛋白酶依次水解火麻仁粕制備具有抑制胰α-淀粉酶和胰脂肪酶活性多肽的報(bào)道，也未見(jiàn)到火麻仁多肽減肥功能的實(shí)驗(yàn)研究[3-4]。本文用酸性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶3次水解脫脂火麻仁粕，得到的多肽經(jīng)膜分離后得到了分子量300～6 000 Da的活性多肽，并研究了該多肽對(duì)肥胖模型小鼠的減肥效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁粕，山西宏田嘉利農(nóng)業(yè)科技有限公司；3.350酸性蛋白酶（3.350酶）、537酸性蛋白酶（537酶）、胃蛋白酶、MSD酸性蛋白酶（MSD酶）、3.4310酸性蛋白酶（3.4310酶）和中性蛋白酶，肽度科技（廈門(mén)）有限公司；阿卡波糖，德國(guó)拜爾公司；奧利司他膠囊，重慶華森制藥股份有限公司；α-淀粉酶和胰脂肪酶，Sigma公司；昆明種小鼠SPF級(jí)，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；動(dòng)物飼料及輔料，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）有限公司；高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超濾-納濾膜組件，中科瑞陽(yáng)膜技術(shù)（北京）有限公司；全自動(dòng)定氮儀，上海寶英光電科技有限公司；UVD-680-3紫外檢測(cè)儀及色譜工作站，上海金達(dá)生物科技有限公司；Thermo MR23冷凍離心機(jī)，美國(guó)熱電公司；Spectramax M5多功能酶標(biāo)儀，天津泰科嘉華金屬貿(mào)易有限公司；其他均為常規(guī)儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻仁多肽的制備與分離

（1）酸性蛋白酶水解制備火麻仁多肽的工藝研究?；鹇槿势煞郯戳弦海ㄙ|(zhì)量）比1∶20加水浸泡，調(diào)pH值至2.5～3.0，倒入膠體磨磨漿，將勻漿料液等分為8份，分別為L(zhǎng)、M、N、O、P、Q、R和S，其中L和M樣品加入3.4310酶，N和Q樣品加入537酶，O和R樣品加入MSD酶，P和S樣品加入3.350酶，加酶量5 000 u·g-1，按樣品中蛋白計(jì)。各樣品在50～52 ℃水解70 min后，加熱滅酶；然后在M、N、O和P樣品中分別加入胃蛋白酶2 600 u·g-1，40～42 ℃水解45 min后加熱滅酶，離心取上清液；L、Q、R和S樣品不經(jīng)胃酶水解，離心取上清液。8份上清液經(jīng)膜分離濃縮后，稀釋至15 mg·mL-1檢測(cè)α-淀粉酶、脂肪酶抑制率，選出消化酶抑制活性高的上清液A保存。

（2）中性蛋白酶二次水解火麻仁粕殘?jiān)臅r(shí)間與溫度實(shí)驗(yàn)。取上清液A離心得到的沉淀殘?jiān)尤胍欢康乃? 000 u·g-1的中性蛋白酶，在pH值為7.5和50 ℃下，分別取樣水解60～160 min，將殘?jiān)乃庖簻缑负?，離心得到上清液B，檢測(cè)計(jì)算B液的多肽得率和15 mg·mL-1含量下的脂肪酶抑制率，以確定適宜水解時(shí)間。取上清液A離心的殘?jiān)?，分別在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和 60 ℃水解 120 min，以確定適宜水解溫度。其他工藝條件同上。

（3）火麻仁活性多肽的膜分離篩選方法。將A、B兩上清液混合后，分別用截留分子量為10 000 Da、6 000 Da、4 000 Da和2 000 Da的超濾膜和300 Da的納濾膜分離，得到5個(gè)分子量Mw組分（6 000～10 000 Da、4 000～6 000 Da、2 000～4 000 Da、＜2 000 Da和300～6 000 Da）；將5段多肽分離液調(diào)整到多肽含量15 mg·mL-1后，測(cè)定各肽段的消化酶抑制率和質(zhì)量百分比（色譜工作站軟件），確定最佳活性分子段。

1.3.2 多肽含量的測(cè)定方法

多肽含量按《大豆肽粉》（GB/T 22492—2008）中附錄B的方法測(cè)定。

1.3.3 多肽得率Q的計(jì)算方法

多肽得率Q的就算公式如下：

式（1）中：S為水解液（離心或超濾）中多肽的含量，g·mL-1；T為水解液的體積，mL；W為水解原料液中的粗蛋白量，g。

1.3.4 α-淀粉酶和脂肪酶活抑制率的測(cè)定與計(jì)算

α-淀粉酶抑制率采用3,5二硝基水楊酸比色法測(cè)定[5]；脂肪酶抑制率的檢測(cè)與計(jì)算參照文獻(xiàn)中方法[6]，其中脂肪酶活力的測(cè)定按照《脂肪酶制劑》（GB/T 23535—2009）的方法。

1.3.5 火麻仁多肽的減肥實(shí)驗(yàn)方法

選成年雄性小鼠，屏障系統(tǒng)下基礎(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)7 d，按體重分成5組，分別為基礎(chǔ)組、基礎(chǔ)+多肽組、高熱量模型組、多肽小劑量組和多肽大劑量組?；A(chǔ)組和基礎(chǔ)+多肽組動(dòng)物喂食基礎(chǔ)飼料，其余3組動(dòng)物喂高熱量飼料（見(jiàn)表1），每日定量供食，自由飲水，飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，濕度40%～60%?；A(chǔ)組和高熱量模型組每天灌胃乳清蛋白［1 g·（kg·d）-1］；基礎(chǔ)+多肽組每天灌胃火麻仁多肽和乳清蛋白各0.5 g·kg-1；多肽小劑量組［0.8 g·（kg·d）-1］和多肽大劑量組［1.6 g·（kg·d）-1］每天灌胃火麻仁多肽。實(shí)驗(yàn)期4周，實(shí)驗(yàn)前后稱體重，結(jié)束后處死動(dòng)物，摘取睪丸及腎周圍脂肪墊稱重，計(jì)算脂體比和體重增重率。統(tǒng)計(jì)攝食量和攝入總熱量（攝入總熱量=攝食量×每公斤飼料熱量），進(jìn)行分析總結(jié)。飼料配方見(jiàn)表1。

表1 飼料配方表

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁多肽最佳工藝條件的確定

2.1.1 酸性蛋白酶+胃蛋白酶最佳組合水解工藝的確定

不同蛋白酶組合水解火麻仁多肽的活性數(shù)據(jù)如表2所示，所有火麻仁酶解樣品均無(wú)脂肪酶抑制活性；缺少用胃蛋白酶二次水解的水解液L、R和S沒(méi)有α淀粉酶抑制活性，537酶一次水解的火麻仁水解液Q的α淀粉酶抑制率為42.5%，但是經(jīng)過(guò)胃蛋白酶二次水解后的水解液N的α淀粉酶抑制率只有22.35%，說(shuō)明537酶水解多肽的α淀粉酶抑制活性對(duì)胃蛋白酶的耐受性差；只有用3.4310酶+胃蛋白酶依次水解的水解液M可產(chǎn)生較高的α淀粉酶抑制率，同時(shí)也預(yù)示這種活性多肽有一定的過(guò)胃穩(wěn)定性，因此，這兩種酶組合的水解工藝作為第一階段酶解活性肽的優(yōu)選。將M水解液的離心上清液A冷藏，以備后期合并超濾和檢測(cè)。將M水解料液的離心沉淀殘?jiān)鳛榈诙A段中性蛋白酶解試驗(yàn)的底物。

表2 不同蛋白酶組合水解火麻仁多肽的活性數(shù)據(jù)表（多肽濃度 15 mg·mL-1）

2.1.2 沉淀殘?jiān)m宜酶解時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果

采用3.4310酶和胃蛋白酶依次水解得到的火麻仁多肽的α淀粉酶抑制率可達(dá)到66.59%，但是火麻仁蛋白的多肽得率只有34%～38%。因此本文將水解M料液的離心沉淀用中性蛋白酶再次水解，結(jié)果如圖1所示，在水解80～140 min時(shí)脂肪酶抑制率變化不大，超過(guò)140 min后，脂肪酶抑制率逐漸下降；多肽得率在水解120 min時(shí)最高，之后逐漸下降，綜合以上兩方面因素，確定M料液沉渣水解120 min為中性蛋白酶酶解的適宜時(shí)間。

圖1 水解時(shí)間對(duì)多肽得率和脂肪酶抑制率的影響圖

2.1.3 沉淀殘?jiān)m宜酶解溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖2可以看出，沉淀殘?jiān)?0～55 ℃溫度范圍內(nèi)水解，脂肪酶抑制率變化不大；50 ℃時(shí)多肽得率最高，低于50 ℃時(shí)得率較低，該蛋白酶未發(fā)揮出有效活性，高于50 ℃時(shí)多肽得率隨溫度下降較快，可能與水解溫度高，酶容易失活有關(guān)。因此適宜水解溫度為50 ℃。

圖2 水解溫度對(duì)脂肪酶抑制率與多肽得率的影響圖

結(jié)合前期加酶量和pH值單因素實(shí)驗(yàn)（省略未列出），最終確定中性蛋白酶水解M料液沉渣的適宜條件為加酶量5 000 u·g-1、pH值為7.5、溫度50 ℃和時(shí)間120 min，得到的水解液經(jīng)離心獲得上清液B，供下一步膜分離。

2.2 火麻仁活性多肽的膜分離篩選結(jié)果

將上清液B與上清液A合并后，經(jīng)膜分離得到5個(gè)分子量段的火麻仁多肽，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。α-淀粉酶抑制活性高的多肽在4 000～6 000 Da分子段，2 000～4 000 Da段多肽雖有一定活性，但活性較小，有可能是前段的活性大分子從4 000 Da的超濾膜漏出所致；而抑制脂肪酶活性高的分子集中在2 000 Da段以下，2 000～4 000 Da段的多肽也有一定活性，有可能是2 000 Da的超濾膜未將小分子活性多肽全部濾出。如果想分別得到兩種消化酶抑制活性高的多肽，就要通過(guò)2次超濾和2次納濾，加工成本高，工藝煩瑣。而通過(guò)一次超濾和一次納濾得到的300～6 000 Da的多肽段同時(shí)包含了較高的α-淀粉酶抑制活性和脂肪酶抑制活性，且質(zhì)量百分比達(dá)到81.65%，多肽得率為53.6%，具有工藝簡(jiǎn)單，消化酶的綜合抑制活性高的優(yōu)點(diǎn)，因此選用300～6 000 Da的多肽為本研究的火麻仁活性多肽。

表3 各段多肽的α-淀粉酶和脂肪酶抑制率表（多肽濃度15 mg·mL-1）

2.3 火麻仁活性多肽的減肥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明（表4），與高熱量組相比，同樣攝入高熱量飼料的火麻仁活性多肽大、小劑量組動(dòng)物的脂肪體重比和體重增重率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），大劑量組的脂肪體重比降低效果優(yōu)于小劑量組。說(shuō)明該多肽中的α-淀粉酶抑制肽和脂肪酶抑制肽通過(guò)抑制淀粉和脂肪的吸收減緩了肥胖模型動(dòng)物的體重增長(zhǎng)，也說(shuō)明該火麻仁活性多肽可以抵抗胃蛋白酶和腸肽酶的降解，在小腸中保持一定的活性，可加工成減肥功能食品。此外，對(duì)比基礎(chǔ)組和基礎(chǔ)+多肽組的可以發(fā)現(xiàn)，健康動(dòng)物在喂食常規(guī)飼料并攝入適量的火麻仁多肽后，體重增重率雖然比未攝入多肽的動(dòng)物有所降低，但是并無(wú)顯著差異，說(shuō)明適量攝入該多肽對(duì)正常動(dòng)物的體重等無(wú)明顯影響。

表4 火麻仁活性多肽對(duì)小鼠體重增重率及脂肪體重比的影響表（）

表4 火麻仁活性多肽對(duì)小鼠體重增重率及脂肪體重比的影響表（）

注：*表示與模型組相比P＜0.05；**表示P＜0.01。

組別 數(shù)量 每只攝入總熱量/kJ每只總攝食質(zhì)量/g 體重增重率/% 脂肪/體重基礎(chǔ)組 9 1 432.0 90 22.30±4.22* 2.39±0.40*基礎(chǔ)+多肽組 9 1 432.0 90 19.97±5.34* 2.20±0.33*高熱量組 8 1 719.5 90 28.56±5.71 3.66±0.46多肽大劑量組 9 1 719.5 90 14.48±3.85** 1.91±0.30**多肽小劑量組 9 1 719.5 90 16.10±4.10** 2.46±0.34*

3 結(jié)論

綜上所述，脫脂火麻仁粕選用3.4310性蛋白酶+胃蛋白酶依次水解，可以得到具有抑制α-淀粉酶活性的火麻仁多肽，α-淀粉酶抑制率可以達(dá)到66.59%，但是第一階段水解多肽得率只有34%～38%，因此本文將3.4310酶+胃蛋白酶水解液的離心沉淀物再用中性蛋白酶水解，可以獲得具有脂肪酶抑制活性的多肽水解液，多肽得率在18%左右，第二階段水解的適宜條件為溫度50 ℃、時(shí)間120 min、pH值為7.5和加酶量5 000 u·g-1。將第一、第二階段的酶解多肽的分離液合并后，經(jīng)過(guò)膜分離得到的300～6 000 Da的混合多肽的α-淀粉酶抑制率為52.18%，脂肪酶抑制率為36.79%，該活性肽的得率為53.6%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該活性肽對(duì)高熱量模型小鼠的減肥效果好，各劑量組與模型組相比均有顯著差異（P＜0.05），可開(kāi)發(fā)為減肥功能食品。