Box-Behnken響應面法優(yōu)化小桐子枝葉中生物堿提取工藝

◎ 林 巧，江文世，李瑤佳，何劭英

（1.西昌學院，四川 西昌 615000；2.攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川 西昌 615000）

小桐子（Jatropha curcasL.），別名麻瘋樹，是大戟科麻瘋樹屬落葉叢生小樹木。人們最開始是在美洲熱帶地區(qū)發(fā)現(xiàn)小桐子這種植物，目前小桐子在中國西南部有大量人工栽培種植或半野生種[1]。此植物種仁含油量最高值為61.5%，是一種十分理想的熱帶地區(qū)生物柴油原料植物，小桐子目前已被大面積種植于云南、四川、貴州等地。小桐子不僅是世界上古老的藥用植物，還是有毒植物，但其全株均可入藥[2-3]。目前，學術界對小桐子的研究集中在從小桐子枝葉中提取、分離、鑒定得到具有抑菌活性的毒蛋白curcin和β-1,3-葡聚糖酶（β1,3-glucanase），并對其活性及作用機理等方面進行了研究，但對小桐子中生物堿以及小桐子果殼中的抗菌活性的研究少有報道[4]。本文通過對小桐子果殼中物質進行分離并研究了小桐子枝葉中生物堿的最佳提取工藝，以期為使用小桐子果殼研制抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

項目組分別于2019年和2020年多次前往會理縣采集小桐子葉片樣品，經(jīng)鑒定為麻瘋樹的干燥帶枝葉，共采集樣品約20 kg。樣品經(jīng)過清洗、晾曬、烘干和粉碎過60目篩，得到干燥粉末樣品約5 kg。

1.2 儀器與設備

試驗中用到的儀器與設備相關信息如表1所示。

表1 儀器與設備信息表

1.3 試驗方法

1.3.1 待分離樣品的制備

按一定料液比加入小桐子葉樣品粉末和一定體積分數(shù)的提取溶劑，用1%的鹽酸溶液定容，調節(jié)pH值。在一定溫度下超聲提取一定時間過濾，旋轉蒸發(fā)濃縮，二氯乙烷萃取分離，分離得到的水相中加入pH=10的10%的碳酸鈉溶液堿化，二氯乙烷萃取分離，將得到的有機相置于烘箱烘干得到生物堿的粗提物。

1.3.2 單因素優(yōu)化試驗

研究不同提取溶劑、超聲溫度、超聲時間、溶劑體積分數(shù)、料液比和鹽酸pH值對小桐子生物堿提取率的影響。

（1）控制pH=2，超聲溫度40 ℃，超聲時間30 min，料液比1∶30（g·mL-1），分別采用甲醇、乙醇（體積分數(shù)80%）和丙酮、1%HCl-水和10%碳酸鈉-水提取小桐子中的生物堿。

（2）控制pH=2，設置超聲時間為30 min，乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超聲溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的溫度條件下進行單因素試驗。

（3）控制pH=2，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在超聲時間為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的條件下進行單因素試驗。

（4）控制pH=2，超聲時間、超聲溫度、乙醇體積分數(shù)分別設置為30 min，40 ℃，80%，在料液比（g·mL-1）分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60時，進行單因素試驗。

（5）控制pH=2，超聲時間50 min，超聲溫度40 ℃，料液比1∶30（g·mL-1），在乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%和90%的條件下進行單因素試驗。

（6）控制超聲時間30 min，超聲溫度40℃，乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶30（g·mL-1），在鹽酸pH值為1、2、3、4和5的條件下進行單因素試驗。

1.3.3 響應面試驗設計

以生物堿總含量Y為響應值，以提取溶劑的體積分數(shù)A、超聲時間B、超聲溫度C這3個不同的因素為自變量，并且將每個自變量都設置成低、中、高3個水平[5]，利用Design-Expert8.0.6軟件，采用Box-Behnken對小桐子枝葉生物堿超聲提取工藝進行3因素3水平的研究[6]，因素水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3.4 標準曲線繪制

將鹽酸川芎嗪對照品稱取0.018 0 g放入規(guī)格為25 mL的容量瓶中。接著向容量瓶中添加氯仿溶解鹽酸川芎嗪對照品，并迅速稀釋至刻度線。如上操作后可得濃度為0.720 mg·mL-1的鹽酸川芎嗪對照品溶液。準確量取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL上述方法配制的鹽酸川芎嗪對照品溶液，先分別裝于規(guī)格為60 mL的分液漏斗中，然后再向其中加入7 mL溴甲酚綠緩沖液，并向其中加入氯仿至溶液體積達到10 mL。按以上方法完成顯色，分取氯仿層，參比為空白溶液，于420 nm處測定吸光度。橫坐標為鹽酸川芎嗪對照品質量濃度（mg·mL-1），縱坐標為吸光度，由此可以進行線性擬合，從而繪制標準曲線[7]。

1.3.5 提取物中生物堿含量測定

取小桐子生物堿的粗提物2 mL，放置于規(guī)格為60 mL分液漏斗中，接著向漏斗中加入溴甲酚綠緩沖液7 mL，并向其中加入氯仿至溶液體積達到10 mL，按以上方法完成顯色，分取氯仿層，參比為空白溶液，于420 nm處測定吸光度。按照以下的公式計算生物堿提取率。

式中：m1為小桐子生物堿質量，g；m2為小桐子粉末質量，g。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由表3可知，在以下5種不同的提取溶劑中，采用乙醇作為提取溶劑時，小桐子生物堿提取率最高。這可能是因為小桐子生物堿是屬于親脂性的仲胺或叔胺生物堿，易溶于極性較小的有機溶劑中。

表3 不同溶劑對小桐子生物堿提取率的影響表

2.2 不同超聲溫度對生物堿提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲溫度的增加，小桐子生物堿提取率先增加后降低。當超聲溫度為40 ℃時，生物堿提取率最高；當超聲提取溫度＞40 ℃時，小桐子生物堿提取率不斷下降。這是因為溫度過高，提取溶劑乙醇揮發(fā)，生物堿在溶劑中的溶解率下降，生物堿提取率降低。因此，選擇超聲提取溫度為30 ℃、40 ℃和50 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 超聲溫度對生物堿提取率的影響圖

2.3 不同超聲時間對小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由圖2可知，在一定的范圍中，小桐子枝葉中生物堿提取率隨著不同超聲時間的增加而呈現(xiàn)增加狀況，當超聲所用時間超過20 min后，隨著超聲時間的增加，生物堿的提取率卻逐漸下降，這可能是由于超聲時間的增加破壞了生物堿的內部結構，同時使提取溶劑揮發(fā)了一部分，導致生物堿提取率下降。因此，選擇超聲提取時間為10 min、20 min和30 min進行響應面優(yōu)化試驗。

圖2 超聲時間對生物堿提取率的影響圖

2.4 不同乙醇體積分數(shù)對小桐子枝葉中生物堿提取率的影響

由圖3可知，在一定范圍中，小桐子枝葉中生物堿提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的狀態(tài)。當乙醇的體積分數(shù)達到80%時，生物堿的提取率達到最高值，繼續(xù)增加乙醇的體積分數(shù)，生物堿繼而提取率下降。因此，本試驗選擇乙醇的體積分數(shù)為70%、80%和90%進行響應面優(yōu)化試驗。

圖3 乙醇體積分數(shù)對生物堿提取率的影響圖

2.5 不同料液比對小桐子生物堿提取率的影響

由圖4可知，在一定范圍內，小桐子生物堿提取率會隨著料液比的增加而呈現(xiàn)逐漸增大的狀態(tài)，料液比超過1∶30（g·mL-1）后，生物堿提取率逐漸下降。這是因為在一定范圍內，增加料液比有助于增大提取溶劑與浸提物的接觸面積，提取率增加。但是料液比過大，不利于小桐子生物堿的溶出，生物堿提取率降低。

圖4 料液比對生物堿提取率的影響圖

2.6 不同鹽酸pH值對小桐子生物堿提取率的影響

由圖5可知，在一定范圍內，隨著pH值增加，生物堿的提取率不斷降低。這是因為生物堿與酸反應形成可溶于水的物質被萃取出來。因此，選擇最佳鹽酸pH值為1。

圖5 pH值對生物堿提取率的影響圖

2.7 響應面試驗

Box-Behnken試驗設計與結果見表4。利用Design-Expert 8.0.6響應面試驗設計軟件對表4中的試驗結果進行分析擬合后得到的二次多項回歸方程為Y=0.61-8.25×10-3A+4.75×10-3B+3×10-3C-5×10-4AB+2×10-3AC+1×10-2BC-0.045A2-0.021B2-0.025C2（R2=0.878 9），該數(shù)據(jù)說明該模型的擬合度比較適宜，試驗所得誤差值比較小。

表4 Box－Behnken設計與結果表

2.7.1 方差分析與顯著性檢驗

對方程進一步進行方差分析，結果見表5。由表5可知，模型P=0.016 3＜0.05，說明本次試驗回歸模型中的自變量與因變量這兩個變量的回歸關系顯著，失擬項P=0.46＞0.05，說明由本試驗數(shù)據(jù)所得的二次多項回歸方程的擬合程度較好。綜上，本試驗具有統(tǒng)計學意義。A、B、C3個因素對試驗中小桐子枝葉生物堿提取率的影響大小的順序為A＞B＞C，并且得出二次項A2、B2、C2對響應值的影響比其他項更為顯著，綜上所述各因素與響應值之間并不是單一的線性關系。交互項對生物堿總含量影響的強弱可表示為BC＞AC＞AB，由此說明超聲所用時間與所設溫度比對響應值的影響明顯。

表5 方差分析結果表

2.7.2 響應面分析

根據(jù)響應面圖中評價此試驗各個不同的因素之間的交互性強度，優(yōu)選出最佳提取工藝。由圖6可知，因素A（提取溶劑的體積分數(shù)）的曲面比其他兩圖較為陡峭，說明提取溶劑的體積分數(shù)的不同對生物堿成分提取效率的影響比其他兩個因素大一些。BC交互作用強，說明超聲所用時間與設置的溫度的交互作用對生物堿總含量的影響比較明顯，AB和AC交互作用是比較弱的，綜上，溶劑的體積分數(shù)與超聲所用的時間、設置的溫度與超聲所用的時間的交互作用對生物堿提取量的影響小一些。

圖6 各因素與生物堿總提取量的響應面圖

2.8 最優(yōu)工藝與驗證

通過本次試驗得出最佳的提取方案為超聲所用時間20.15 min，提取溶劑的體積分數(shù)為79.15%，超聲溫度為40 ℃。基于對試驗本身實際操作情況的理解和后續(xù)試驗的簡便性的考慮，本試驗最終確定的最優(yōu)提取工藝為取樣0.5 g的小桐子枝葉藥材樣品磨成粉末，加入79.15%乙醇，超聲提取20.15 min，設置溫度為40 ℃。分別選取3批小桐子葉藥材飲片，在綜上所述的最優(yōu)工藝條件下做驗證試驗。試驗所得生物堿成分總含量分別為0.606 0%、0.595 8%、0.601 4%，平均值為0.601 1%（RSD=0.85%），與模型中預測值的相對誤差為0.59%，表明試驗所建立的模擬回歸方程擬合度高，經(jīng)試驗所得出的優(yōu)化方案是穩(wěn)定的、可靠的。

3 結論

有學者研究表明生物堿是以鹽的形態(tài)存在于植物中的含氮有機化合物，其治病功效強，如毛莨科黃連根莖中的小蘗堿具有消炎作用，罌粟果皮中所含的嗎啡堿可鎮(zhèn)痛，三尖杉堿和長春花堿是治癌的良藥。生物堿具有良好的應用前景，如何更加高效地從相關植物種提取出生物堿是當前生物用藥方面必要的研究內容。

本試驗采用超聲法將小桐子枝葉藥材中生物堿提取出來，相比于傳統(tǒng)的酸（堿）性水溶液提取法、樹脂吸附法、浸漬法用時更短，能耗更小，提取率增加且有效成分保留完整。在后續(xù)操作中，本試驗利用單因素試驗法結合Box－Behnken響應面法[8]，對各個單因素試驗水平連續(xù)分析，從不同單因素中篩選出最適合小桐子枝葉生物堿提取條件，避免了因提取方案不佳造成的生物堿提取損失問題發(fā)生。本試驗得到的小桐子枝葉中生物堿的最優(yōu)提取工藝，操作簡便、效率高、穩(wěn)定可靠。