慢性乙型肝炎患者血清miR-21和miR-148b水平變化及其預測肝組織炎癥分級和纖維化分期價值探討*

羅 珂，丁 莉，劉 美

肝組織病理學檢查是有效評估慢性肝炎患者肝組織炎癥活動度分級和纖維化分期的金標準[1]。然而，肝活檢屬于有創(chuàng)檢查，不便于大范圍推廣，更不便于作為治療慢性乙型肝炎(CHB)患者定期復查的手段。因此，尋找一種簡易可靠的檢測指標以衡量慢性肝炎肝組織炎癥活動度和纖維化程度成為研究者共同努力的方向之一[2，3]。微小RNA(microRNAs，miRNAs) 是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類非編碼、短序列、具調控功能的小分子RNA，參與調控生物生長發(fā)育等重要的生命過程[4]。臨床已發(fā)現(xiàn)miRNAs 在多種病毒感染性疾病發(fā)病過程中起關鍵作用，多種病毒可合成自身 miRNAs，還可在感染過程中引起宿主miRNAs表達變化[5]。在肝臟，miR-21已經被證實參與肝細胞增殖、肝纖維化發(fā)生、膽管增生和癌變等多個病理學環(huán)節(jié)[6]。miR-148b可影響細胞增殖，在多種腫瘤組織呈現(xiàn)低表達[7]。本研究檢測了CHB患者血清miR-21和miR-148b水平，分析其在不同肝組織炎癥和纖維化程度患者的異同，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年7月～2021年6月我院診治的CHB患者134例，男75例，女59例；年齡為21～63歲，平均年齡為(32.4±8.3)歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》的標準[8]，納入患者血清HBsAg持續(xù)陽性超過6個月以上，血清HBV DNA大于或等于1×105copies / mL，血清天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平大于或等于60 U/L，丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平大于或等于60 U / L。排除標準：合并肝癌或嚴重的心、腦、肺、腎功能障礙；合并自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精性肝炎；入組前3個月進行過抗病毒或免疫調節(jié)劑治療；感染、外傷等應激狀態(tài)；妊娠或哺乳期婦女；重疊其他肝炎病毒感染?；颊吆炇鹬橥鈺?，本研究經我院醫(yī)學倫理委員會審核、通過。

1.2 肝穿刺活檢術 在彩色超聲引導下，使用美國Bard Magnum 型穿刺槍，以16 G 活檢針進行快速肝穿刺活檢，取肝組織約為1.5～2.5 cm，即刻置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經常規(guī)脫水和石蠟包埋處理，行4 μm 連續(xù)切片，依次行HE、Masson和嗜銀網狀纖維染色。于多功能彩色病理學圖像分析儀下由同一名病理科醫(yī)生讀片。鏡下至少包括 6個匯管區(qū)，參照《病毒性肝炎防治方案》標準[9]評判肝組織病理學炎癥分級和纖維化分期。

1.3 血清miR-21和miR-148b定量檢測 無菌取新鮮血液4 mL，離心后分離血清，置于EP管，-70℃ 保存。在檢測時，取出血清，迅速置于37℃條件下水浴2 min，使用美國Invitrogen 公司Trizol 試劑提取血漿 RNA，保存于-80℃。檢測RNA完整性，采用 Nano Drop 分光光度計檢測 RNA濃度和純度。按照Takara公司逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，在冰上預冷的 RNase free EP 管中加入RNA模板6 μL，加入2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μL、0.1%BSA 2 μL、mi RNA Prime Script RT Enzyme Mix 2 μL，共20μL。在37℃條件下孵育 60 min，在Poly A加尾與反轉錄，向RT反應液中加入RNAase Free H2O 至100 μL，取2μL，定量檢測。使用 SYBR Green和 Stepone Plus定量 PCR儀檢測miR-21和miR-148b水平，以U6為內參行相對定量分析，定量反應體系按SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL， PCR Primer(miR-21 1 μL：Forward primer:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′，reverse primer：5′-GCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3′；miR-148b：Forward primer:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，reverse primer：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；引物U6：Forward primer:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，reverse primer：5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT- 3′)，模板2μL，加dd H2O 8.5μL，共25 μL。每個樣品設 3 個平行孔。擴增程序：預變性94℃ 30 s；持續(xù)40 個循環(huán)：94℃ 5 s，62℃ 20 s。采用2-ΔΔCt法計算miR-21和miR-148b 相對水平。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 結果

2.1 不同肝組織炎癥分級患者血清miR-21和miR-148b水平比較 經肝組織學檢查，134例CHB患者肝組織炎癥活動度G1級23例、G2級39例、G3級47例和G4級25例；不同肝組織炎癥分級患者血清miR-21和miR-148b水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 不同炎癥分級患者血清miR-21和miR-148b水平比較

2.2 血清miR-21和miR-148b水平預測肝組織炎癥分級的效能分析情況 以血清miR-21和miR-148b水平聯(lián)合檢測評估肝組織炎癥分級大于或等于G2的ROC曲線下面積(AUC)顯著大于兩項指標單獨評估(P<0.05，表2、圖1)。

表2 血清miR-21和miR-148b水平預測肝組織炎癥分級的效能

圖1 血清miR-21和miR-148b預測顯著肝組織炎癥的效能

2.3 不同肝組織纖維化分期患者血清miR-21和miR-148b水平比較 經肝組織病理學檢查，134例CHB患者肝纖維化為S1期31例、S2期46例、S3期28例和S4期29例；不同肝纖維化分期患者血清miR-21和miR-148b水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 不同肝纖維化分期患者血清miR-21和miR-148b水平比較

2.4 血清miR-21和miR-148b水平預測肝纖維化分期的效能情況 以血清miR-21和miR-148b水平聯(lián)合檢測評估肝纖維化分期大于或等于S2的AUC顯著大于兩項指標單獨評估(P<0.05，表4、圖2)。

表4 血清miR-21和miR-148b水平預測肝纖維化分期的效能

圖2 血清miR-21和miR-148b預測顯著性肝纖維化分期的效能

3 討論

CHB為臨床常見的病毒性疾病。在HBV持續(xù)感染狀態(tài)下導致機體免疫應答，患者肝臟長期處于炎癥狀態(tài)，致使大量肝臟細胞損傷、壞死，發(fā)生肝組織纖維化病變，進一步引發(fā)肝硬化[10]。

miRNAs廣泛存在于組織、血漿或血清或其他體液中，表達穩(wěn)定，不被內源性核糖核酸酶降解，參與機體多種生理和病理學過程[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)[12]，miR-21在幾乎所有腫瘤組織表達上調，參與腫瘤細胞增殖、侵襲和腫瘤新生血管生成等多個環(huán)節(jié)，且miR-21在不同肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化、肝癌組織表達存在顯著差異。miR-148b 基因對啟動細胞增殖具有重要的抑制作用，能促進細胞凋亡。miR-148b蛋白可激活內皮細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和上皮細胞上相應趨化因子受體。miR-148b 水平受甲基化和轉錄因子等的調控，在自身免疫性疾病、炎癥反應、腫瘤發(fā)生等過程中起關鍵的作用[13，14]。

HBV感染患者臨床表現(xiàn)多樣。本研究對不同肝組織炎癥分級患者血清miR-21和miR-148b水平進行分析，結果顯示隨著肝組織炎癥分級增高，血清miR-21水平隨之升高。miR-21高水平可能影響機體全身性炎癥反應，導致白細胞增加，NF-κB上調，最終使血清炎癥因子如TNF-α、IL-6 和IL-8 等過量釋放。炎癥因子浸潤導致肝組織壞死[15]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-148b 水平隨著慢性乙型肝炎患者肝組織炎癥分級加重而降低。miR-148b可通過激活巨噬細胞自噬，降低炎癥因子水平，發(fā)揮免疫保護作用。在miR-148b低水平狀態(tài)下，巨噬細胞自噬水平降低，肝組織炎癥反應增強，進一步導致肝組織損傷加重[16]。血清miR-21和miR-148b水平可在一定程度上反映CHB患者肝組織炎癥分級。

miRNAs在肝纖維化形成和肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，通過作用于信號轉導通路，調節(jié)肝星狀細胞增殖和分化，影響肝纖維化向肝硬化發(fā)展進程[17]。既往研究表明miR-21在肝纖維化組織高表達[18]，針對miR-21靶向干預可用于包括肝臟等在內的器官纖維化的治療。高表達的miR-21靶向TGF-β信號通路，誘導抑制性蛋白Smad 7表達，促進Smad 2/3磷酸化。同時，它可提高通路效應蛋白Smad 2/3水平，通過調控TGF-β信號通路，促進肝星狀細胞活化。此外，miR-21靶向PDCD4蛋白，抑制活化的肝星狀細胞凋亡，導致更多膠原組織積累[19]。相關研究[20]利用化學合成類似物在小鼠體內高表達miR-148b后發(fā)現(xiàn)，這種干預可阻礙四氯化碳誘導的肝纖維化的病理學進程。應用血清miR-21和miR-148b水平預測顯著肝組織炎癥和纖維化具有一定的價值，值得進一步研究。