NASH患者肝巨噬細胞在肝纖維化形成過程中的作用及其臨床轉(zhuǎn)化研究進展*

韓冰，涂傳濤

各種病因所致的慢性肝病及其并發(fā)癥仍然是威脅人類健康的重大疾病，造成嚴重的疾病負擔，給人類的健康帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[1,2]。近年，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率急劇增加，已成為我國乃至全球慢性肝病的主要病因[3]。NAFLD是一種與胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應激性肝損傷。NAFLD是一個連續(xù)的肝臟疾病譜，可由單純的肝脂肪變進展至非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)。臨床數(shù)據(jù)顯示，15%～20%NASH相關(guān)纖維化患者可進展為肝硬化、終末期肝病、甚至肝細胞癌(HCC)[3]。肝纖維化是NASH相關(guān)的遠期病死率、肝移植和肝臟相關(guān)的臨床事件最重要的預測因素[2-4]。因此，阻止或逆轉(zhuǎn)NASH及其肝纖維化進展是改善預后的關(guān)鍵，對解決人類健康關(guān)切和降低沉重的疾病負擔具有深遠的戰(zhàn)略意義。然而，因NASH發(fā)病機制尚未完全闡明，目前臨床上仍缺乏有效的治療藥物[2, 3]。因此，重視NASH形成和進展的機制研究，發(fā)掘具有潛在治療價值的新靶點，不僅是本領(lǐng)域研究的熱點，更是臨床轉(zhuǎn)化研究的迫切需求。

1 NASH相關(guān)肝纖維化形成的細胞與分子機制

盡管NASH的病理學形成過程具有復雜性和多變性，但仍存在某些共同的促發(fā)因素?！岸嘀仄叫写驌簟睂W說的提出有助于理解NASH病理學形成過程[5,6]。一般認為，NASH形成和進展是多因素平行作用的結(jié)果，肥胖、2型糖尿病、高脂血癥和不良生活方式等因素伴隨IR導致肝細胞脂質(zhì)沉積為“首次打擊”環(huán)節(jié)。隨后，引起的肝細胞脂肪變性、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和線粒體功能障礙等因素促進肝細胞損傷和死亡，最終觸發(fā)炎癥反應和肝纖維化形成[3-6]。值得注意的是，這些打擊的強度及其后果在不同程度上還取決于個體遺傳背景和表觀遺傳學的改變。肝纖維化是肝臟損傷-修復的動態(tài)過程，是以膠原為主的細胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生超過肝臟的降解能力，導致ECM在肝臟過度沉積形成所謂的纖維“疤痕”?；罨母涡菭罴毎?hepatic stellate cells, HSC)是ECM最主要的來源[3,4]。肝細胞損傷和過度死亡觸發(fā)的炎癥反應是導致NASH及其纖維化形成的關(guān)鍵[4-9]。死亡的肝細胞不僅可直接激活HSC和匯管區(qū)成纖維細胞，而且還可以通過釋放損傷相關(guān)的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)激活天然免疫細胞(主要是巨噬細胞)促進炎癥形成，間接活化HSC；受損的肝細胞產(chǎn)生或激活炎癥介質(zhì)，可調(diào)控NLRP3炎癥小體激活，致下游caspase-1活化，促進分泌IL-1β和IL-18，參與細胞凋亡[3, 9]。肝臟作為機體重要的免疫器官，擁有大量先天性和獲得性免疫細胞，如T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、B細胞、中性粒細胞和樹突細胞[10-12]。肝臟免疫細胞富聚的微環(huán)境無疑在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在NASH等慢性肝病所致的肝纖維化病理學形成過程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9-12]。近年的單細胞轉(zhuǎn)錄組研究進一步揭示，肝臟免疫細胞圖譜很可能通過促進肝臟炎癥微環(huán)境失控，從而加劇肝損傷，導致NASH及其肝纖維化的形成。

2 肝臟巨噬細胞的來源、表型及其功能

巨噬細胞在體內(nèi)分布廣泛并且具有十分活躍的生物學功能。作為天然免疫系統(tǒng)的主要細胞成分，在機體防御和免疫應答活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。巨噬細胞具有明顯的組織器官異質(zhì)性。肝臟巨噬細胞由固有的和浸潤的巨噬細胞共同組成，前者也稱為Kupffer細胞(Kupffer cells, KCs)，后者是未成熟的單核細胞由骨髓釋放至血液循環(huán)，再浸潤至肝臟，最終分化為單核細胞來源的巨噬細胞(monocyte-derived macrophages, MdMs)[10-12]。KCs位于肝竇內(nèi)，占肝內(nèi)細胞總數(shù)的15%，占體內(nèi)固有巨噬細胞總數(shù)的80%～90%，是維持肝臟耐受狀態(tài)的主要細胞成分。固有的巨噬細胞表達F4/80hi和CD11bint等特異性表面標志物，有助于識別。此外，其表面還分布有高密度的清道夫受體(scavenger receptor，SCR)、Fc受體、補體受體、Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)、Nod樣受體和甘露糖受體等。單核細胞或MdMs則表達F4/80int和CD11bhi等特異性表面標志物。巨噬細胞具有較強的攝取抗原并呈遞給活化的T細胞或效應T細胞，在進一步活化T細胞的同時巨噬細胞自身也被激活并發(fā)揮細胞免疫效應。

有關(guān)肝臟固有巨噬細胞的來源問題,近年有新的認識。2013年Yona et al[13]研究認為肝臟KCs在出生前就已經(jīng)形成，并在成年期通過自身增殖維持其種群。在肝臟損傷早期，KCs數(shù)量減少，隨后通過自身增殖補充KCs池，浸潤的MdMs不參與損傷過程中KCs的補充[13-16]。近年幾項重要研究發(fā)現(xiàn)，在NASH過程中胚胎源性巨噬細胞自身更新受損，產(chǎn)生了MdMs[15-17]。細胞命運圖譜研究表明，NASH小鼠單核細胞(TIMneg巨噬細胞)也參與調(diào)配KCs池，且免疫標記研究證實單核細胞來源的KCs位于肝竇內(nèi)，類似胚胎來源的KCs[17, 18]。NASH患者單核細胞來源的KCs產(chǎn)生是對胚胎來源的巨噬細胞死亡增加的應答反應，旨在維持KCs的數(shù)量[16, 18]。巨噬細胞是具有高度異質(zhì)性的細胞群體, 主要表現(xiàn)為其所產(chǎn)生的細胞因子、表面標志物和基因表達譜具有顯著的多樣性[14-18]。深入理解NAFLD形成過程中巨噬細胞異質(zhì)性，對發(fā)掘潛在的治療策略尤其有價值[10, 14]?；罨木奘杉毎只驑O化(polarization)為兩個不同的亞群，即M1型和M2型[10-12]。Th1細胞因子和微生物的代謝產(chǎn)物誘導產(chǎn)生經(jīng)典激活型巨噬細胞，稱為M1型；M2型則由Th2細胞因子誘導產(chǎn)生的替代激活型巨噬細胞。根據(jù)表達的活化標志物不同，通常將M2型巨噬細胞分為三個亞群：由IL-4或IL-13誘導的M2a巨噬細胞；由免疫球蛋白Fc受體和免疫復合物誘導的M2b型巨噬細胞; 由IL-10、TGF-β、糖皮質(zhì)激素誘導的M2c型巨噬細胞[10, 12]。M1型和M2型巨噬細胞不僅在功能和基因表達譜上有顯著的差異, 而且在代謝作用方面也不同。M1型糖酵解增強, 分解精氨酸產(chǎn)生一氧化氮(NO)增加；M2型依賴脂肪酸氧化,通過精氨酸酶分解代謝精氨酸[10]。

感染早期活化的NK細胞和隨后活化的Th1細胞分泌的IFN-γ對巨噬細胞的活化至關(guān)重要。細菌產(chǎn)物，如脂多糖(LPS)、TNF-α和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等也能誘導巨噬細胞向M1型極化。活化后的M1巨噬細胞能夠產(chǎn)生大量的促炎因子、趨化因子，如 CCL2, CXCL10和CXCL11等、反應性氮和氧自由基。此外，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)分解精氨酸生成NO, 直接殺滅細菌和原蟲。M1型巨噬細胞分泌大量的促炎因子，如IL-1、IL-6和IL-23，發(fā)揮重要的防御作用，但同時也可以造成組織損傷。M1的激活途徑受到信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT1、核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶等多重信號通路的調(diào)控。不同亞型的M2型巨噬細胞作用有所不同。M2a型巨噬細胞的主要作用是促進創(chuàng)傷愈合，組織損傷后釋放的IL4可誘導激活M2a并產(chǎn)生IL-4、IL-10、TGF-β、IL-5和IL-13等細胞因子。此外，M2a型巨噬細胞能夠間接地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應；因M2b和M2c都具有免疫調(diào)節(jié)作用而往往被統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)性巨噬細胞，但其誘導和分化的刺激信號和具體功能各不相同。M2b活化后產(chǎn)生高水平的免疫抑制性細胞因子IL-10。M2c具有抑制巨噬細胞介導的宿主防御和炎癥性功能。M2的激活途徑受到STAT6和鋅指轉(zhuǎn)錄因子等信號通路的調(diào)控[12, 13]。

3 肝巨噬細胞在NASH及其肝纖維化形成過程中的作用和分子機制

肝臟巨噬細胞在肝臟疾病進程的不同階段，比如炎癥、纖維生成和纖維降解調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮不同甚至相反的作用[10]。在NASH形成過程中，來源不同的巨噬細胞的功能有所差異。MdMs抑制肝臟甘油三酯沉積，但與胚胎來源的KCs相比，更大程度上能促進肝損傷。此外，巨噬細胞還具有誘導肝細胞凋亡的特性。在NASH患者和小鼠發(fā)現(xiàn)巨噬細胞通常在肝臟中成簇或聚集，尤其是在大泡性脂肪變性區(qū)域，這些細胞聚集被稱為肝花環(huán)樣結(jié)構(gòu)(hepatic crown-like structures, hCLSs)或脂肪肉芽腫(lipogranuloma)，可促進單純脂肪肝向NASH轉(zhuǎn)化進展[10, 18]。研究還強調(diào)，NASH形成過程中巨噬細胞穩(wěn)態(tài)明顯被破壞，從而發(fā)揮破壞作用[11, 19, 20]。

3.1 肝巨噬細胞在NASH相關(guān)肝纖維化形成和進展過程中的作用在NAFLD病理學發(fā)展過程中，作為肝細胞損傷的應答反應細胞，Kupffer細胞被激活、表達細胞因子和信號分子[10-12, 14]，主要包括炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6，趨化因子CCL2及其受體CCR2途徑，參與招募中性粒細胞和循環(huán)單核細胞。單核細胞分化為促炎型巨噬細胞，進一步放大肝臟炎癥反應，并通過TGF-β1刺激激活周圍的HSCs，促進膠原為主ECM的生成[21-23]。此外，活化的KCs還呈現(xiàn)不同的表型，這種極化表型主要取決于其所接受的周圍環(huán)境信號，M1型和M2型巨噬細胞的平衡是調(diào)控肝臟炎癥的關(guān)鍵[10-13]。KCs的活化和極化的主要途徑是需要由腸道進入門脈循環(huán)的營養(yǎng)素和腸道源性細菌產(chǎn)物，如細菌LPS激活TLRs而發(fā)揮作用[10, 19, 20]。肝細胞損傷相關(guān)的分子途徑，如富組氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein, HRG)和DAMPs[9, 10]。游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)途徑，主要經(jīng)由脂肪組織的TLRs和脂肪因子，如瘦素通過瘦素受體作用。通過膽固醇及其代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)由CD36和巨噬細胞清道夫受體1作用。腸道微生態(tài)是“腸-肝軸”學說的重要基礎(chǔ)和紐帶，在NAFLD發(fā)病過程中起著重要作用[3, 20, 23]。在NAFLD患者和動物模型均證實，腸道微生物群的改變、小腸細菌過度生長和腸道通透性增加，導致通過門脈系統(tǒng)進入肝臟的LPS增加, 激活肝臟固有的KCs，而肝臟固有巨噬細胞表達的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)可能具有抑制NAFLD炎癥反應和纖維化的作用?；谀c道微生態(tài)的宏基因組標簽可將NAFLD患者輕、中度肝纖維化與進展期纖維化進行鑒別。甘油三酯和LPS的結(jié)合更易誘導促炎細胞因子的釋放，并招募更多的T細胞和B淋巴細胞。LPS誘導的炎癥依賴于ROS介導的X-盒結(jié)合蛋白1 (X-box binding protein 1, XBP1)的激活[10]。LPS-TLR4信號通路在腸道和肝臟之間的“互作”中起著核心作用，在NASH患者肝內(nèi)TLR4表達增加，TLR4+巨噬細胞也顯著增加[20]。當Kupffer細胞衰竭時，出現(xiàn)門靜脈LPS升高，導致脂肪變性和壞死性炎癥，肝組織TNF-α、TGFβ1和膠原表達增加。然而，TLR4信號傳導并不局限于Kupffer細胞，肝細胞TLR4信號通路可能在很大程度上也促進了肥胖相關(guān)的代謝異常。脂毒性被認為是NAFLD進展的關(guān)鍵機制之一，表現(xiàn)為NAFLD患者脂肪組織分解代謝增強，導致FFAs流入肝臟的量增加。肝臟新生脂肪的增加使整個代謝向?qū)е赂螕p傷轉(zhuǎn)變。肝細胞脂質(zhì)沉積過度勢必激活肝巨噬細胞促進NASH的形成和進展[19, 23]。不同的FFAs對巨噬細胞的影響方式不同，其中涉及了TLR4-NF-κB、MyD88-PI3K- AKT和NLRP3 炎性小體等信號途徑的作用[9, 10, 22]。此外，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，如氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)等修飾脂蛋白也都能夠直接促進炎癥性巨噬細胞的激活，并增加巨噬細胞對LPS誘導激活的敏感性。普遍存在快餐里的氧化脂質(zhì)可誘導肝臟的促炎狀態(tài)，可誘導肝臟巨噬細胞數(shù)量增加和炎癥介質(zhì)表達，如TNF-α、iNOS和COX2等。棕櫚酸、LPS和oxLDL可刺激巨噬細胞產(chǎn)生ROS和促炎細胞因子。高膽固醇也是NAFLD和NASH形成潛在的致病因素之一。在NASH小鼠模型和患者發(fā)現(xiàn)，在壞死肝細胞殘余脂滴周圍形成的hCLS中含有膽固醇晶體。同時，還發(fā)現(xiàn)游離膽固醇積聚在活化的KCs轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，類似與粥樣斑塊中的巨噬細胞[10, 14]。脂滴中的膽固醇結(jié)晶參與巨噬細胞NLRP3炎癥小體的激活，從而在肝臟炎癥和NASH形成過程中發(fā)揮作用。在NAFLD病程中，肝細胞損傷和死亡相關(guān)的分子可以進一步觸發(fā)巨噬細胞的激活[2-4, 23]。凋亡小體可能通過肝臟的凋亡細胞或細胞碎片上的氧化特異性表位作為危險相關(guān)的分子模式，通過TLRs等模式識別受體，激活KCs。NASH患者肝細胞富含HRG，HRG高表達與疾病分期以及鄰近的促炎巨噬細胞相關(guān)。體外研究也證實，HRG可誘導骨髓來源的巨噬細胞向促炎型巨噬細胞激化[10]。脂毒性肝細胞釋放包含CXCL10和TNF相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)細胞外囊泡，在NAFLD進展過程中促進巨噬細胞的募聚和炎癥激活。細胞外囊泡也可能被巨噬細胞內(nèi)化，導致NLRP3和IL-1β釋放上調(diào)。ROS可以直接誘導Kuffer細胞產(chǎn)生TNF-α，并增加KCs對內(nèi)毒素的敏感性。鐵超載可以促進氧化損傷，促炎細胞因子釋放。由肝細胞、KCs和其他非實質(zhì)細胞釋放的TNF可能以旁分泌和自分泌的方式激活肝巨噬細胞。在NASH小鼠，發(fā)現(xiàn)單核細胞來源的巨噬細胞在肝臟聚集組成脂質(zhì)相關(guān)的巨噬細胞(lipid-associated macrophages, LAMs)[14, 18, 19]，類似于纖維化患者肝內(nèi)TREM2+CD+疤痕相關(guān)的巨噬細胞[11]，可出現(xiàn)在肥胖的白色脂肪組織。肝臟LAMs多分布在纖維化區(qū)域，也稱為NASH相關(guān)的巨噬細胞[18,19]。單核細胞來源的巨噬細胞和LAMs位于纖維化組織區(qū)域，在活化的HSC側(cè)緣，高表達編碼骨橋蛋白的SPP1基因，從而促進肝纖維化的形成。

3.2 肝巨噬細胞在NASH相關(guān)炎癥消退和肝纖維化降解過程中的作用炎癥的消退不再是炎癥介質(zhì)的稀釋和消散的被動現(xiàn)象，而是一個暫時性精細調(diào)控和相繼分泌促消炎分子信號的主動過程[23, 24]。在肝臟損傷階段，KCs活化會募聚更多的免疫細胞，包括中性粒細胞和淋巴細胞抗原6C-high (LY6Chi)炎癥性單核細胞，它們可以進一步分化為CD11b+F4/80+經(jīng)典激活M1型巨噬細胞。該表型的巨噬細胞具有吞噬活性并分泌促炎細胞因子，如IL-12和ROS，能夠殺傷微生物和腫瘤細胞。在急性炎癥發(fā)作期，M1占主導的巨噬細胞也可以通過釋放抗纖維化或纖維溶解因子(如MMPs)抑制成纖維細胞的纖維化活性，從而誘導細胞外基質(zhì)降解或纖維溶解[10, 11]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，典型的M1型肝巨噬細胞的激活可導致MMP7和MMP9高表達，這兩種表達在膠原瘢痕中可能是清除膠原纖維所必需的纖維溶解因子。近年來，MMP13也被認為是M1型巨噬細胞在肝臟纖維降解過程中所產(chǎn)生的。相反，在肝臟急性炎癥之后的修復期，肝臟巨噬細胞可以選擇性地激活具有免疫抑制但促纖維化表型的M2型巨噬細胞，這些細胞分泌高水平的IL-13、血小板源性生長因子(PDGF)-BB 、TGFβ1等促纖維化因子，并與纖維生成、組織重塑和血管生成增加相關(guān)，導致纖維化。M2巨噬細胞也與抗纖維化有關(guān)，可能與存在不同M2亞型和重疊有關(guān)。M2型巨噬細胞也可表達MMPs，尤其以MMP12最顯著，被認為是胞葬和吞噬基質(zhì)碎片的重要細胞。

在肝纖維化患者和小鼠肝組織，M1型和M2型巨噬細胞共存，這兩種細胞在纖維化反應中都是必要的[10-12]。具備結(jié)合M1型和M2型特征的“恢復性”或“促降解”的巨噬細胞仍不清楚，但這個亞群的巨噬細胞具有抗炎和抗纖維化的特性。這類細胞可在肝纖維化的自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程中出現(xiàn)，并以上調(diào)MMP表達和LY6ClowF4/80+表型為特征[10，23]。

4 基于肝巨噬細胞調(diào)控的治療策略及其臨床轉(zhuǎn)化研究憧憬

糖皮質(zhì)激素受體可以調(diào)節(jié)Kupffer細胞產(chǎn)生的炎癥。通過CD163受體用地塞米松直接靶向巨噬細胞可以降低TNF水平，從而減輕肝臟炎癥和纖維化。巨噬細胞半乳糖凝集素3高表達。半乳糖凝集素3抑制劑GR-MD-02可以改善纖維化評分和肝硬化程度。NASH患者KCs表達MSR1上調(diào)，阻斷MSR1信號途徑也能有效抑制脂質(zhì)誘導的KCs激活，從而改善NASH及其肝纖維化[22]。鞘氨醇-1-磷酸受體4抑制劑SLB736可通過抑制NLRP3炎癥小體激活減輕NASH相關(guān)的炎癥和纖維化[22]。單核細胞募集是NAFLD進展的重要步驟。CCR2-CCR5雙拮抗劑Cenicriviroc可以通過抑制趨化因子受體阻止單核細胞向肝臟的募聚，也可直接作用于HSC，從而改善肝纖維化。吡格列酮通過激活PPARγ，在體外可以減輕肝臟炎癥和單核細胞或巨噬細胞浸潤，并下調(diào)巨噬細胞的促炎功能。法尼酸X受體(farnesoid X receptor, FXR)，如奧貝膽酸可以下調(diào)肝糖和脂質(zhì)代謝，發(fā)揮抗炎和抗纖維化作用。通過精細調(diào)控M1/M2型巨噬細胞的平衡是治療NASH及其肝纖維化的有效策略之一[12, 23, 25]。胰高血糖素樣肽-1受體(GLP1R)激動劑有許多作用靶點，可減少巨噬細胞的浸潤，并使巨噬細胞極化向抗炎表型傾斜，從而促進NASH逆轉(zhuǎn)。Elafibranor是一種雙PPARα和PPARδ激動劑，可通過調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織代謝穩(wěn)態(tài)和炎癥，減少巨噬細胞浸潤和向抗炎巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變。楊梅酮可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞激化減輕肝臟炎癥反應和氧化應激[25]。凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1 (ASK1)Selonsertib可抑制包括巨噬細胞在內(nèi)的許多細胞從而減少炎性激活。MaR1作為一種特殊促消炎介質(zhì)(specialized pro-resolving mediators, SPM)，可通過巨噬細胞重編程使其向抗炎表型轉(zhuǎn)化，促進NASH相關(guān)炎癥的消退[24, 26]。在NASH患者肝組織，CAR-T細胞靶向并消除uPAR+肝星狀細胞和巨噬細胞，從而減輕纖維化[11]。