肝臟疾病細(xì)胞鐵死亡研究進(jìn)展*

薛 旗，徐琊蕓 綜述，李 婕 審校

慢性肝病是指各種原因?qū)е碌穆愿闻K損傷，其發(fā)病原因較復(fù)雜，乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、代謝紊亂、飲酒等導(dǎo)致的病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)和酒精性肝病及其相關(guān)肝硬化、肝癌是我國(guó)主要的慢性肝病。我國(guó)脂肪性肝病發(fā)病率近30%[1]，病毒性肝炎患病人數(shù)達(dá)9000萬(wàn)人[2]，酒精性肝病病人接近6200萬(wàn)人[3]。因此，慢性肝病發(fā)病率極高，是殃及我國(guó)近5億人的重大公共健康問(wèn)題。但目前關(guān)于慢性肝臟疾病的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。鐵死亡(ferroptosis)是一種鐵依賴(lài)性的，脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的，區(qū)別于細(xì)胞壞死、自噬等細(xì)胞死亡的新型的程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)方式[4]。鐵死亡在多種疾病，包括腫瘤、炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近期越來(lái)越多的研究成果證明鐵死亡在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中亦發(fā)揮著重要作用。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的定義 鐵死亡最早于2012年被正式提出并命名，發(fā)現(xiàn)小分子化合物erastin觸發(fā)了一種獨(dú)特的鐵依賴(lài)性非凋亡性細(xì)胞死亡形式，erastin通過(guò)抑制胱氨酸向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致谷胱甘肽(glutathione，γ-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)降低和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡[5]。

1.2 鐵死亡的特征 鐵死亡時(shí)超微形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞膜斷裂和出泡，線(xiàn)粒體萎縮、線(xiàn)粒體脊減少甚至消失、膜密度增加、細(xì)胞核形態(tài)正常，但缺乏染色質(zhì)凝集；電鏡下觀察到胞內(nèi)線(xiàn)粒體變小、膜密度增高[6]。鐵和活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系統(tǒng)，通過(guò)降低胱氨酸的攝取、耗竭谷胱甘肽，抑制谷氨酸/胱氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/cystine transporter又稱(chēng) Xc antiporter system, system Xc-)和增加還原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，釋放花生四烯酸等介質(zhì)是其主要的生物學(xué)特征[7]。

鐵死亡在基因水平上主要受核糖體蛋白L8(ribosomal protein，RPL8)、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(iron responsive element binding-protein 2，IREB2)、三四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域35(tetratricopeptide repeat domain 35，TTC35)、檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)、酰基輔酶A合成酶家族成員2(acyl-CoA synthetase family member 2，ACSF2)的調(diào)節(jié)，代謝、儲(chǔ)存相關(guān)基因TFRC、ISCU、FTH1、FTL也參與其調(diào)控過(guò)程[5]。

1.3 鐵死亡的機(jī)制 在二價(jià)鐵或酯氧合酶的作用下，催化細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，即發(fā)生細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙，脂質(zhì)活性氧堆積，細(xì)胞抗氧化能力減弱，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；此外，還表現(xiàn)為抗氧化體系(主要是谷胱甘肽系統(tǒng))的調(diào)控核心酶GPX4的降低。GPX4和systemXc-被認(rèn)為是介導(dǎo)鐵死亡通路的關(guān)鍵因子。具體調(diào)節(jié)機(jī)制表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：①抑制GPX4從而誘導(dǎo)鐵死亡：GPX4能降解小分子過(guò)氧化物和某些脂質(zhì)過(guò)氧化物，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。研究發(fā)現(xiàn)，若細(xì)胞中GPX4表達(dá)下調(diào)則會(huì)對(duì)鐵死亡更敏感；相反，若上調(diào)GPX4的表達(dá)，則會(huì)產(chǎn)生對(duì)鐵死亡的耐受。因此，將GPX4抑制后將誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[8]。②抑制systemXc-從而誘導(dǎo)鐵死亡：system Xc-主要介導(dǎo)谷氨酸與胱氨酸以1:1比例交換，胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)排出細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸；隨后，胱氨酸可以轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，用于內(nèi)源性抗氧化劑GSH的合成；最后，GPX4 利用GSH清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS[9]。③鐵離子輸入與鐵離子還原會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡：向細(xì)胞中輸入鐵離子，并且保證鐵離子以二價(jià)鐵的形式大量存在會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡，二價(jià)鐵離子通過(guò)芬頓反應(yīng)可啟動(dòng)脂質(zhì)體過(guò)氧化[5]。

2 鐵死亡與肝臟疾病的關(guān)系

近年來(lái)研究表明鐵死亡與多種疾病相關(guān)，包括癌癥[10]、神經(jīng)退行性疾病[11]和急性腎損傷[12]。此外，鐵死亡的失調(diào)也與各種肝臟疾病相關(guān)，抑制鐵死亡可以阻止肝臟疾病，如NAFLD的病理生理學(xué)進(jìn)展，加強(qiáng)鐵死亡則可促進(jìn)索拉非尼誘發(fā)的細(xì)胞死亡進(jìn)而為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的聯(lián)合治療提供幫助[13]。

2.1 鐵死亡與NAFLD NAFLD是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)。包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相關(guān)肝硬化。早期單純性脂肪變性通常被認(rèn)為是良性的，而晚期NASH則更具攻擊性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞死亡和進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化和HCC[1]。鐵死亡可能是NASH炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)因素，通過(guò)膽堿缺乏和乙硫氨酸補(bǔ)充(choline-deficient and ethionine-supplemented，CDE)飲食建立NASH小鼠模型，觀察到小鼠在發(fā)展為NASH的起始階段肝細(xì)胞鐵死亡先于細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，并且顯示鐵死亡抑制劑幾乎能夠完全逆轉(zhuǎn)NASH初期的肝細(xì)胞死亡，抑制炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善肝功能[14]。鐵死亡通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及其相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化在NASH的發(fā)生發(fā)展中起主要作用。實(shí)驗(yàn)顯示在用鐵死亡誘導(dǎo)劑處理的甲硫氨酸和膽堿缺乏(methionine/choline-deficient，MCD)飲食喂養(yǎng)的小鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)較高的脂質(zhì)積累[15]。同樣在MCD建立的模型中發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟內(nèi)的花生四烯酸代謝上調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)脂質(zhì)ROS積聚，同時(shí)顯著加速了NASH相關(guān)的病理改變，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和NASH早期的細(xì)胞損傷[16]。

鐵伴侶蛋白多聚(rC)結(jié)合蛋白1(poly rC binding protein 1，PCBP1)可保護(hù)小鼠肝臟免遭脂質(zhì)過(guò)氧化和脂肪變性[17]。作為維持肝臟鐵平衡所必需的物質(zhì)，PCBP1可控制小鼠肝臟中不穩(wěn)定鐵池(labile iron pool，LIP)的反應(yīng)性，從而抑制鐵介導(dǎo)的小鼠脂肪變性、脂質(zhì)過(guò)氧化和肝細(xì)胞死亡。也有研究發(fā)現(xiàn)絲裂素2(mitofusin 2，Mfn2)與IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α，肌醇需求酶1α)的相互作用可促進(jìn)5-HETE的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致砷和鐵誘導(dǎo)的NASH，而使用鐵死亡抑制劑可顯著改善砷引起的鐵超載、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)積聚，使NASH明顯減輕[18]。發(fā)現(xiàn)在高脂肪飲食(high fat diet，HFD)誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，銀杏內(nèi)酯B可能通過(guò)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)信號(hào)通路對(duì)NAFLD脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激引起的鐵死亡有抑制作用，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(GPX4、HO-1、TFR1和FTH1)的表達(dá)而調(diào)節(jié)代謝，抑制氧化應(yīng)激及肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化[19]。

2.2 鐵死亡與病毒性肝炎 有研究發(fā)現(xiàn)血清鐵調(diào)素及其鐵代謝相關(guān)指標(biāo)是評(píng)估慢性乙型肝炎嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[20]，亦有學(xué)者提出血清鐵水平可以作為判斷慢性乙型病毒性肝炎轉(zhuǎn)歸和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[21]。以往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)可通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路使肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活而誘導(dǎo)肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)大黃酚在HBx存在的情況下增加脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物及鐵死亡標(biāo)記物的表達(dá)上調(diào)，表明大黃酚可通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡而顯著誘導(dǎo)HBx轉(zhuǎn)染的HSC死亡，從而抑制HSC增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，以預(yù)防肝纖維化[22]。

2.3 鐵死亡與藥物性肝損傷 藥物性肝損傷是急性肝功能衰竭的主要病因，由藥物引起的肝細(xì)胞死亡也有多種方式，其中鐵死亡在藥物性肝損傷中的作用機(jī)制吸引眾多研究者的關(guān)注。有實(shí)驗(yàn)表明，在抗結(jié)核藥物的代謝過(guò)程中，大量細(xì)胞內(nèi)GSH和GPX4被耗盡，而活性氧和細(xì)胞鐵含量均增多，補(bǔ)充GSH可顯著降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平和肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，補(bǔ)充鐵則增強(qiáng)異煙肼和利福平誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和肝損傷的程度，證實(shí)在抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的藥物性肝損傷期間出現(xiàn)的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡[23]。APAP誘導(dǎo)的肝毒性、脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡標(biāo)記基因的上調(diào)被Fer-1和鐵螯合劑顯著阻止也證實(shí)該結(jié)論[24,25]。(+)-黃皮酰胺則可通過(guò)抑制肝細(xì)胞鐵死亡來(lái)改善藥物性肝損傷，實(shí)驗(yàn)證明(+)-黃皮酰胺可增加肝細(xì)胞中GPX4的蛋白水平，還能夠激活Keap 1-Nrf 2途徑，抑制藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡[26]。

2.4 鐵死亡與酒精性肝病 對(duì)腸道特異性SIRT1缺失(SIRT1iKO)的基因敲除小鼠和慢性過(guò)量乙醇喂養(yǎng)的小鼠進(jìn)行乙醇喂養(yǎng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇給藥后SIRT1iKO小鼠的肝臟炎癥和肝臟損傷指標(biāo)比對(duì)照小鼠顯著減輕，SIRT1iKO 小鼠的這種保護(hù)作用可能是由于減輕鐵代謝功能障礙而造成，證明腸道SIRT1缺乏通過(guò)減輕鐵死亡從而保護(hù)小鼠免受酒精性肝損傷[27]。還有研究者對(duì)lipin-1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Lpin1-TG)和野生型(WT)小鼠使用慢性過(guò)量乙醇喂養(yǎng)方案，在慢性酒精過(guò)量攻擊后，Lpin1-TG小鼠表現(xiàn)出比WT小鼠更明顯的脂肪變性、炎癥加劇、血清肝酶升高、肝膽損傷和纖維化反應(yīng)，小鼠脂肪組織lipin-1的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)肝臟鐵沉積癥的發(fā)生，后在酒精暴露下誘導(dǎo)小鼠鐵死亡性肝損傷[28]。

2.5 鐵死亡與肝纖維化 當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，HSC被激活，通過(guò)增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)誘導(dǎo)活化的HSC死亡可能是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，細(xì)胞鐵死亡在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。RNA結(jié)合蛋白ELAVL1可通過(guò)激活鐵死亡來(lái)促進(jìn)HSC的死亡，erastin或索拉非尼誘導(dǎo)的ELAVL1上調(diào)通過(guò)與BECN1基因3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的富含AU的元件(AU-rich elements，AREs)結(jié)合而促進(jìn)BECN1/Beclin1的產(chǎn)生，從而觸發(fā)鐵自噬體的生成，促進(jìn)鐵蛋白降解，最終導(dǎo)致鐵超載鐵死亡，進(jìn)而減輕小鼠肝纖維化[29]。血紅素氧合酶1(HO-1)介導(dǎo)的HSC鐵死亡是異甘草酸鎂(magnesium isoglycyr-rhizinate，MgIG)改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化和HSC活化所必需的[30]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在野生型大鼠中注射50%四氯化碳來(lái)建立肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)MgIG治療通過(guò)促進(jìn)鐵和脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累可顯著誘導(dǎo)HSC鐵死亡，而鐵抑制素1(ferrostatin-1，F(xiàn)er-1)對(duì)鐵死亡的抑制完全消除MgIG誘導(dǎo)的抗纖維化作用。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也確定HO-1位于MgIG誘導(dǎo)的HSC鐵死亡信號(hào)通路的上游位置，敲除HO-1可明顯阻斷HSC鐵死亡，進(jìn)而加重肝纖維化。同樣位于HSC鐵死亡信號(hào)通路上游的分子還有腫瘤抑制因子P53，發(fā)現(xiàn)P53依賴(lài)的HSC鐵死亡對(duì)于蒿甲醚(artemether，ART)改善四氯化碳誘導(dǎo)的HSC活化和肝纖維化是必要的。青蒿琥酯也能通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡信號(hào)通路減輕肝纖維化。有研究表明ART的抗肝纖維化作用需要鐵調(diào)節(jié)蛋白2(iron regulatory protein 2，IRP2)的參與，而鐵死亡在此過(guò)程中起著重要作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ART可抑制IRP2與STIP1同源性和含U框蛋白1(STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1)的結(jié)合，減少I(mǎi)RP2的泛素化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IRP2蛋白的積累，從而增加鐵的流入，減少鐵的儲(chǔ)存和輸出，細(xì)胞內(nèi)鐵的積累會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，最終誘導(dǎo)HSC的鐵死亡。

2.6 鐵死亡與HCC 手術(shù)是HCC最主要的治療手段，但是患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，分子靶向藥物索拉非尼提供的生存益處也有限，因此，進(jìn)一步了解HCC中調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulated cell death，RCD)的分子機(jī)制已成為開(kāi)發(fā)克服索拉非尼耐藥性的新療法的重要一步。與正常生理狀態(tài)肝細(xì)胞相比，HCC細(xì)胞中RAS致癌基因的高表達(dá)、鐵離子含量增加，脂質(zhì)ROS的累積，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明鐵死亡在HCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)是產(chǎn)生NADPH的主要酶，而NADPH是線(xiàn)粒體GSH合成的重要來(lái)源，這啟發(fā)了研究者探索IDH2敲除對(duì)體外培養(yǎng)的人HT1080纖維肉瘤和鼠Hepa1-6肝癌細(xì)胞以及裸鼠同種異體移植Hepa1-6細(xì)胞體內(nèi)模型中鐵死亡的影響。IDH2基因的下調(diào)可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性而促進(jìn)鐵死亡。研究表明，IDH2敲除導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減少是由于GPX4抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。精氨酸修飾的囊泡狀硅酸錳納米顆粒(arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs)可以作為腫瘤靶向治療的鐵死亡誘導(dǎo)劑，細(xì)胞水平結(jié)果顯示AMSNs可以高效地消耗細(xì)胞內(nèi)的GSH，從而抑制細(xì)胞內(nèi)GPX4的活性，引起細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化脂質(zhì)的堆積，最終通過(guò)鐵死亡的途徑引起腫瘤細(xì)胞死亡。也有研究[30]發(fā)現(xiàn)p62-Keap1-NRF2抗氧化信號(hào)通路是參與HCC細(xì)胞ROS和鐵死亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，結(jié)果表明，p62介導(dǎo)的Keap1降解導(dǎo)致鐵死亡中NRF2活化，NRF2調(diào)節(jié)基因NQO1、HO1和FTH1通過(guò)改變鐵代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化而抑制鐵死亡。泛素樣修飾因子激活酶1(ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1)也通過(guò)NRF2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)調(diào)節(jié)Huh7表型和鐵死亡參與了HCC的發(fā)展[31]。另外，Sigma-1受體(S1R)[32]也被證明是人類(lèi)HCC細(xì)胞中鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它調(diào)節(jié)許多參與活性氧和鐵代謝的靶位，以及最關(guān)鍵的鐵死亡靶位GPX4。HIC1-HBA1和HNF4A-STMN1軸通過(guò)谷胱甘肽合成中的關(guān)鍵酶PSAT1反向調(diào)節(jié)GSH的產(chǎn)生[33]。在肝癌，鐵死亡由轉(zhuǎn)錄的差異調(diào)節(jié)控制。研究鑒定了兩類(lèi)基因：鐵死亡上調(diào)因子(ferroptosis up-regulated factors，F(xiàn)UF)和鐵死亡下調(diào)因子(ferroptosis down-regulated factors，F(xiàn)DF)，它們通過(guò)影響GSH的合成來(lái)促進(jìn)和抑制鐵死亡，HBA1和STMN1為FUF和FDF的代表因子。FUF由轉(zhuǎn)錄因子HIC1控制，而FDF由轉(zhuǎn)錄因子HNF4A控制。賴(lài)氨酸-乙酰轉(zhuǎn)移酶2B(lysineacetyl transferase 2B，KAT2B)通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的乙酰化水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在促進(jìn)鐵死亡時(shí)，KAT2B的解離阻止HNF4A結(jié)合到FDF啟動(dòng)子，這種效應(yīng)發(fā)生在KAT2B募集到FUF啟動(dòng)子之前，有助于HIC1結(jié)合轉(zhuǎn)錄FUF。破壞HIC1和HNF4A之間的平衡是用erastin處理后誘發(fā)鐵死亡的先決條件，刺激HIC1的同時(shí)抑制HNF4A 11可能有助于肝癌的治療。

3 小結(jié)與展望

鐵死亡參與多種肝病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。鐵死亡在慢性肝臟疾病發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制研究非常重要，其在治療領(lǐng)域的臨床意義也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。目前，人們對(duì)鐵死亡的研究還有許多機(jī)制不明，尤其關(guān)于鐵死亡與慢性肝病的臨床研究相對(duì)較少，對(duì)于兩者之間的關(guān)系知之甚少，例如通過(guò)抑制鐵死亡治療慢性肝病是否具有臨床可行性，鐵死亡在慢性肝病的疾病演變階段，如從炎癥階段、纖維化階段進(jìn)展到肝硬化或肝癌階段是否發(fā)揮作用等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床研究的突破。