宏基因組耐藥基因的報告與解讀

李永軍，王雅杰

（1.廣州微遠基因科技有限公司，廣東 廣州 510663；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科，北京 100015）

藥物敏感性試驗為臨床對于細菌選擇有效抗生素提供了重要依據(jù)。隨著細菌對抗生素藥物耐藥性的不斷加劇，既往的經(jīng)驗治療方案在臨床應(yīng)用時已經(jīng)顯得能力不足，無法得到預(yù)期的臨床效果。傳統(tǒng)藥敏試驗是基于微生物培養(yǎng)鑒定確認后才進行檢測，通常會耗時3～4 d，對臨床早期精準(zhǔn)抗感染存在一定局限，無法為臨床在早期的治療中提供有效的實驗室證據(jù)。因此，基于標(biāo)本或菌株的耐藥基因單重/多重多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測技術(shù)目前正在應(yīng)用于臨床，為快速診斷提供有力的實驗室證據(jù)支撐。

目前已有商業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用到了臨床，如Unyvero在對呼吸道常見病原體鑒定的同時納入10種耐藥基因為臨床用藥提供指導(dǎo)，有助于提高呼吸機相關(guān)性肺炎（ICU VAP）與醫(yī)院獲得相關(guān)性肺炎（HAP）患者的早期精準(zhǔn)診斷并減少廣譜抗生素的使用[1]；Xpert Carba-R Assay碳青霉烯耐藥基因檢測試劑為感控監(jiān)測提供解決方案，可以1 h內(nèi)對急診患者進行產(chǎn)碳青霉烯酶的細菌進行篩查并指導(dǎo)感控舉措[2]；最新升級的Filmarray的血培養(yǎng)鑒定panel包含了11種常見的耐藥基因，比第一版血培養(yǎng)鑒定panel 檢測更多的細菌與耐藥基因，甚至也拓展至VAP患者肺泡灌洗液檢測[3-4]。但因臨床患者不同病程背景的多元化體現(xiàn)及隨時變化的病情，商業(yè)化產(chǎn)品可能無法滿足臨床醫(yī)生的實際需求，因此這就要求臨床實驗室提供新的解決方案以應(yīng)對臨床的實際需求。

1 現(xiàn)狀

近年來基于NGS的新技術(shù)病原宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing, mNGS）在臨床疑難、危重、特殊感染患者病原體診斷層面發(fā)揮了巨大作用[5]。mNGS因無需培養(yǎng)，無偏好性的特點，不僅覆蓋微生物的基因組，也可覆蓋攜帶耐藥/毒力基因的質(zhì)粒。因此，通過將測序后的大數(shù)據(jù)(去除人源序列后的微生物核酸序列)與耐藥/毒力基因數(shù)據(jù)庫（CARD/ResFinder/ MEGARes/VFDB等）進行比對，可以實現(xiàn)部分入組患者的耐藥/毒力基因分析[6]。在鑒定出耐藥菌的同時，分析耐藥基因?qū)崿F(xiàn)對部分患者診療指導(dǎo)是現(xiàn)階段mNGS臨床應(yīng)用的一個細化方向。

EUCAST（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Test）在2017年公布了兩份文件，文件中對基因組測序技術(shù)在推斷抗微生物藥物敏感性的應(yīng)用中將其描述為“根據(jù)臨床折點評估基因型數(shù)據(jù)是一項更艱巨的挑戰(zhàn)，但如果基于基因組測序的測試要指導(dǎo)臨床決策制定，這將是必要的[7-8]?！辈⒃谖募羞M行了對測序技術(shù)的先進性及局限性進行了描述，從報告中可以看出在當(dāng)時EUCAST就對于測序技術(shù)應(yīng)用到病原微生物耐藥性檢查中應(yīng)用前景有著很大的期待。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI）自2019年發(fā)布的臨床藥物敏感性試驗操作標(biāo)準(zhǔn)（M100 Ed29）中提出了利用分子生物學(xué)方法來預(yù)測細菌的耐藥基因用以幫助臨床進行抗感染治療[9-12]。其中涉及到了多種臨床常見的耐藥菌株的耐藥基因，包括如mecA、PBP2a、vanA、vanB、及碳青霉烯酶等臨床常見耐藥菌株的耐藥基因，同時給出了對每一個耐藥基因的詳細注釋。2020年，魯辛辛等發(fā)布的《高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識》提到mNGS的臨床應(yīng)用的適應(yīng)性，并且提出了不同類型臨床標(biāo)本的前處理方法。在mNGS的整個應(yīng)用全程中提出了11點建議[13]。2021年，王輝等發(fā)布的《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》指出，感染發(fā)生在正常無微生物定植的部位且標(biāo)本采集過程污染概率低時，可以考慮采用mNGS進行物種鑒定的同時檢測耐藥基因，并通過耐藥表型試驗對耐藥基因進行驗證。對有菌種特異性的耐藥基因，在測序深度足夠時，可以考慮應(yīng)用mNGS檢測獲得性的耐藥基因，預(yù)測耐藥表型[14]。雖然在該共識中，對“mNGS檢測耐藥基因的解讀”采用了很謹慎的語句，如“正常無微生物定植的部位”或“有菌種特異性的耐藥基因”，但為mNGS耐藥基因報告提供了指引方向。

然而，現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報告標(biāo)準(zhǔn)不一，對耐藥基因不加篩選，一份報告許多種耐藥基因提示臨床幾乎所有可選用的藥物都耐藥，或者在沒有患者詳細基礎(chǔ)信息的情況下，直接指導(dǎo)臨床藥物選擇，對mNGS規(guī)范化臨床應(yīng)用產(chǎn)生誤導(dǎo)。面對mNGS分析比對后檢出諸多耐藥基因如何報告及如何解讀的問題，筆者綜合現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報告現(xiàn)狀及臨床實踐，從報告和解讀層面提出了以下要點，供臨床醫(yī)生參考。

2 報告要點

①通過與耐藥數(shù)據(jù)庫比對，應(yīng)用mNGS可以對下機數(shù)據(jù)中是否存在耐藥基因進行分析。建議需要依據(jù)耐藥基因臨床重要性進行選擇性報告，不建議對mNGS檢出的耐藥基因不加篩選和分析，報告多種甚至數(shù)百種耐藥基因。耐藥基因應(yīng)在充分調(diào)研現(xiàn)有分子耐藥檢測產(chǎn)品、征詢臨床意見、大數(shù)據(jù)分析（如判斷是否背景來源）等多維情況進行選擇與報告。

以耐藥基因數(shù)據(jù)庫CARD為例，其涵蓋數(shù)千個耐藥基因。然而，數(shù)千個耐藥基因的臨床意義有限，耐藥機制未明或臨床意義未明的耐藥基因占比絕大部分，比如數(shù)年前某項研究報道北京一次霧霾天的14份空氣樣本中檢測出60余種耐藥基因，引起公眾恐慌。而略知臨床微生物知識學(xué)者都明白，抗性基因顯然與人體對某種耐藥微生物感染是不能直接掛鉤[15]。因此，耐藥基因檢測需要關(guān)注臨床重要耐藥菌，尤其關(guān)注包括“ESKAPE”在內(nèi)的常見耐藥菌及其對應(yīng)的有菌種特異性的耐藥基因，其它病原體諸如百日咳桿菌、軍團菌、支原體等耐藥情況相對少見，并不需要或現(xiàn)階段并不需要開展耐藥基因檢測[16]。

②因宏基因組方法廣覆蓋的特點，來自臨床的原始樣本如肺泡灌洗液常檢出多種病原體。檢出耐藥基因的來源判斷存在挑戰(zhàn)，與已有呼吸道檢測panel耐藥基因報告邏輯相同，建議在耐藥菌檢出的情況下進行耐藥基因報告，沒有目標(biāo)耐藥菌檢出的情況下，不進行耐藥基因報告。同時對于樣本中微生態(tài)菌群、檢測過程、實驗室環(huán)境等方面來源的耐藥基因，需要基于陰性對照樣本及臨床報告陰性的大數(shù)據(jù)樣本建立耐藥基因報告閾值。

例如Unyvero呼吸道樣本檢測panel對呼吸道樣本如肺泡灌洗液檢測，涵蓋20余種常見的呼吸道感染病原體與10種耐藥基因。在一項多中心的性能評估研究中指出[17]，當(dāng)腸桿菌屬、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌檢測陽性時，報告是否檢出耐藥基因并預(yù)測可能的耐藥類型，例如CTX-M陽性提示腸桿菌屬和或鮑曼不動桿菌和或銅綠假單胞菌桿菌對三代頭孢菌素耐藥。即使有這種情況下，也不排除檢出的耐藥菌與耐藥基因互不相關(guān)，可能來源于檢測panel內(nèi)或外的其它病原體。因此，首先耐藥基因報告需要耐藥菌盡可能的“一對一”，將常見耐藥菌檢出作為第一要素，再去報告耐藥基因，其次，閾值設(shè)定對于TEM等常在陰性對照或臨床報告陰性樣本檢出的樣本至關(guān)重要。

③因耐藥基因拷貝數(shù)與對應(yīng)細菌含量在某種程度相關(guān)聯(lián)，可以基于mNGS大數(shù)據(jù)建立關(guān)聯(lián)模型將細菌與耐藥基因進行對應(yīng)。對于未有較大把握判斷耐藥基因來源、精準(zhǔn)歸類的情況（如銅綠假單胞菌與肺炎克雷伯菌同時檢出，較難判斷KPC來源），尤其對陰性菌相關(guān)的耐藥基因，建議如實呈現(xiàn)，提示臨床參考培養(yǎng)藥敏結(jié)果做出最終判斷。

一般情況下，尤其對于開放性氣道的樣本，檢出的耐藥基因不能充分確認耐藥基因的宿主來源，例如mecA基因可能源自于呼吸道樣本中存在的凝固酶陰性葡萄球菌，而非檢出的金黃色葡萄球菌。面對“宏”視角下的病原體多樣檢出，行業(yè)代表企業(yè)在積累數(shù)千例病原體陽性樣本的宏基因與宏轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)后，采用spearman或pearson模型分析病原體和耐藥基因序列數(shù)相關(guān)性，綜合高斯分布模型和分離株藥敏結(jié)果得出分析病原體和耐藥基因序列數(shù)閾值，并計算出病原體和耐藥基因的關(guān)聯(lián)性強度，以期能夠解決部分非唯一菌種來源的耐藥基因歸屬問題。

④一些試劑盒的測試結(jié)果表明，尤其對于革蘭陰性桿菌相關(guān)的耐藥基因（KPC、NDM、VIM、OXA-48），即使在不能精準(zhǔn)歸類的情況下，檢出的基因型與后續(xù)分離菌株的表型具有很高的一致性，對于疾病盡早診治具有提示。而且評測顯示mecA基因型或表型的一致性也接近80%[17]。

⑤針對檢出的、可報級別的耐藥基因可以預(yù)測并報告對應(yīng)的耐藥藥物。因定植或感染判斷需要綜合臨床多維度信息，不建議檢測單位/檢驗實驗室直接基于耐藥基因進行用藥指導(dǎo)。對于隨著研究深入確認有明確意義的耐藥基因，建議定期進行文獻回顧并及時進行后續(xù)增補與報告。同時建議定期進行大數(shù)據(jù)回顧，統(tǒng)計分析及與臨床專家回顧，對可能有特殊意義或新的耐藥基因進行挖掘。

目前有mNGS檢測單位在報告多種耐藥基因的同時，也會對臨床用藥給出建議。如前述提及，環(huán)境、人體皮膚/呼吸道亦可存在耐藥基因，諸多耐藥基因耐藥機制不明確，并且患者診治個體化差異較大，病史，感染部位，既往抗菌藥物的使用等因素均會影響患者用藥選擇，因此不建議檢測單位尤其第三方檢測單位在不充分了解患者基本情況等信息時對患者用藥給出指導(dǎo)。另外，因mNGS技術(shù)廣覆蓋的特點，建議通過定期的文獻查詢或?qū)＜易稍兊确绞剑瑢δ退帞?shù)據(jù)庫定期更新或數(shù)據(jù)回顧分析，納入臨床逐步明確的耐藥基因如MCR-1并報告也具有重要意義。通過前述的指南文件中對耐藥基因的闡述，基于目前的臨床狀態(tài)及技術(shù)手段，其中推薦了mNGS可報告的耐藥基因，見表1。

表1 推薦mNGS可報告的部分耐藥基因

3 解讀要點

當(dāng)檢測單位能夠按照如上原則出具規(guī)范化的mNGS耐藥基因報告，將報告發(fā)放至臨床后，臨床如何準(zhǔn)確解讀至關(guān)重要。因此，除外規(guī)范化報告要點外，在臨床解讀中也同樣需要注意以下幾點：

①一般情況下，菌量含量較高的樣本如肺泡灌洗液更容易檢測到耐藥基因，無菌體液雖耐藥基因應(yīng)用價值高，但受限于方法學(xué)檢測限度較難覆蓋耐藥基因。臨床樣本尤其無菌體液沒有檢測到耐藥基因不表示檢出的細菌不耐藥。技術(shù)優(yōu)化層面可以通過去宿主反向富集和或設(shè)計探針、正向富集的方式捕獲耐藥基因，進而提高耐藥基因檢出比例。

質(zhì)粒或染色體來源的耐藥基因是基因組組成的一小部分，理論上無偏性的mNGS可以在覆蓋到耐藥基因。但受限于人源背景、物種基因組大小與檢測靈敏度等因素，臨床樣本尤其無菌體液未檢測出目標(biāo)耐藥基因不表示檢出的細菌不耐藥，因此現(xiàn)階段僅作為mNGS的重要附加分析。魯辛辛等發(fā)表的mNGS共識指出如果需要對耐藥基因或毒力基因進行分析，可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或者結(jié)合耐藥相關(guān)基因或毒力基因進行靶向捕獲富集后進行[7]。對于臨床常見重要耐藥菌相關(guān)的耐藥基因，如CTX-M、KPC、NDM、MecA等，可以通過探針捕獲富集技術(shù)提高檢測靈敏度，已有捕獲技術(shù)用于腸道耐藥組檢測，研究指出相比于常規(guī)mNGS，耐藥基因的檢出比例與覆蓋度均顯著提高[18]。

②與其它基于核酸的耐藥基因分子檢測相同，耐藥基因是否可以真正表現(xiàn)耐藥，即基因型與功能表型是否一致，需要深入的數(shù)據(jù)支持。呼吸道或全血病原菌和耐藥基因多重PCR檢測技術(shù)可以為mNGS耐藥基因表型判斷提供參考。根據(jù)EUCAST與CLSI標(biāo)準(zhǔn)，更可靠的耐藥結(jié)果以表型實驗為金標(biāo)準(zhǔn)。即使在判斷耐藥提示準(zhǔn)確的情況下，仍需要已經(jīng)患者病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)等多維度數(shù)據(jù)判讀感染與否。因此，建議臨床在解讀mNGS耐藥基因結(jié)果時知曉上述情況，并依據(jù)來自于文獻、流行病學(xué)等多方位信息做出診療決策。

關(guān)于mNGS臨床重要耐藥基因檢出表型與一致性的數(shù)據(jù)，暫未有明確發(fā)表的數(shù)據(jù)，行業(yè)代表企業(yè)的自研數(shù)據(jù)表明，在現(xiàn)有疑難危重特殊感染患者的群體選擇下，常見重要耐藥基因的基因型與表型一致性可以超過90%，如通過耐藥基因-耐藥菌關(guān)聯(lián)模型判斷CTX-M來自于肺炎克雷伯菌的樣本，與同一份臨床培養(yǎng)陽性樣本藥敏試驗的一致性為96.67%，判斷mecA來自于金黃色葡萄球菌的樣本，與同一份臨床培養(yǎng)陽性樣本藥敏試驗的一致性為95.83%(未發(fā)表)。T2 Biosystems開發(fā)的針對全血進行耐藥基因檢測的產(chǎn)品性能評估（2021微生物和感染學(xué)會（ECCMID）摘要內(nèi)容）可以為mNGS重要耐藥基因檢出的表型判斷提供一定的參考。

4 結(jié)語

耐藥基因檢測作為mNGS的應(yīng)用深化方向之一，未來在臨床應(yīng)用層面具有較大的想象空間。面對現(xiàn)階段mNGS耐藥基因報告的一些亂像，通過深入的調(diào)研及專家咨詢，本研究提出了mNGS耐藥基因報告與解讀要點，希望對于行業(yè)規(guī)范化發(fā)展有所裨益。