富含半胱氨酸蛋白61對(duì)慢性腎臟病小鼠骨骼肌萎縮的影響

古亮 左一丹 林幼幼 王小妹 蘇震

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率占全球成年人口的10%～15%[1]。CKD除了可致腎臟功能異常外，還可致多種并發(fā)癥，肌肉萎縮就是其中之一[2-3]。CKD患者發(fā)生肌肉萎縮會(huì)使生活質(zhì)量下降，死亡率上升[4]。已有研究表明，CKD引起肌肉萎縮的原因包括炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白合成與分解異常等，這些原因可引起肌肉質(zhì)量和力量的快速下降，導(dǎo)致肌肉功能喪失[5-6]。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich protein 61,CCN1）是一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與細(xì)胞黏附、遷移、趨化、分化、凋亡、衰老及傷口愈合、纖維化等過程[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚傷口愈合過程中，CCN1通過整合素α6β1和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）途徑誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)激活p53蛋白觸發(fā)細(xì)胞衰老；在成纖維細(xì)胞衰老的研究中發(fā)現(xiàn)，CCN1可通過RAC1-NOX1復(fù)合物誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生，激活ERK和p38MAPK，導(dǎo)致p16/Rb上調(diào)[10]。肌肉祖細(xì)胞（muscle progenitor cells,MPCs）加入重組CCN1蛋白后，p53、p16和 Rb蛋白表達(dá)升高，MPCs衰老表型增強(qiáng)。在老年小鼠血清中CCN1表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步說明骨骼肌年齡相關(guān)性衰老可能與CCN1表達(dá)上調(diào)有關(guān)[11]?；诖?，本研究以骨骼肌條件性敲除CCN1小鼠，即條件性基因敲除（conditional knockout,CKO）小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，構(gòu)建CKD小鼠模型，探討CCN1對(duì)CKD小鼠骨骼肌萎縮的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 骨骼肌條件性敲除CCN1的小鼠制備 委托江蘇南京集萃藥康生物科技有限公司通過CRISPR-Cas 9技術(shù)在C57BL/6小鼠（購(gòu)自江蘇南京集萃藥康生物科技有限公司）CCN1基因上下游各插入一段LoxP序列，得到雜合CCN1flox/+小鼠，將其與CCN1+/+小鼠進(jìn)行雜交純化遺傳背景。然后本研究團(tuán)隊(duì)把純化后的CCN1flox/+小鼠交配繁殖得到CCN1flox/flox小鼠。CCN1flox/flox小鼠與CKmm-Cre+/-小鼠（購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室）雜交，繁殖生育得到CKmm-Cre+/-CCN1flox/+小鼠。隨后將異性CKmm-Cre+/-CCN1flox/+與CCN1flox/flox小鼠雜交得到 CKmm-Cre+/-CCN1flox/flox、CKmm-Cre+/-CCN1flox/+、CK－mm-Cre-/-CCN1flox/flox、CKmm-Cre-/-CCN1flox/+4 種基因型小鼠。其中CKmm-Cre+/-CCN1flox/flox為骨骼肌條件性敲除CCN1的小鼠，即CKO小鼠，其中雄性有14只；CKmm-Cre-/-CCN1flox/flox為野生型（wild type,WT）小鼠，其中雄性有15只。將WT小鼠和CKO小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為野生型假手術(shù)組（wild type sham,WOS組）6只、野生型造模組（wild type operation,WOC組）9只、敲除型假手術(shù)組（conditional knockout sham,COS組）8只、敲除型造模組（conditional knockout operation,COC組）6只。小鼠置于自然光、安靜環(huán)境、室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±2）%環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批件號(hào)：wydw2018-0007；動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009]。

1.1.2 主要試劑和儀器 Mouse Tail SuperDirectTMPCR Kit購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；SAKURA Tissue-TekRO.C.T購(gòu)自美國(guó)櫻花公司；抗層粘連蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)biosharp公司；DAPI購(gòu)自北京索萊寶公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京諾唯贊公司；BCA購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；肌酐、尿素氮、CCN1、尿蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所；HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；GAPDH購(gòu)自中國(guó)Affinity公司；CCN1購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；p53購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔 IgG（H+L）購(gòu)自中國(guó)biosharp公司。SpectraMax iD3全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) BIO-RAD公司；RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；LV-150N光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建5/6腎切除小鼠模型 各組小鼠均根據(jù)小鼠體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉。WOC組和COC組小鼠在距左肋脊部約0.5 cm處縱行切開約1.5 cm，暴露左側(cè)腎臟，分離腎臟周圍組織及包膜，切除左腎上極、下極2/3腎組織，并用明膠海綿迅速覆蓋到創(chuàng)面壓迫止血，觀察腎臟切口直至凝血，復(fù)位剩余腎臟，逐層縫合組織；1周后再次用上述方法暴露小鼠右側(cè)腎臟，用手術(shù)縫線結(jié)扎右腎動(dòng)脈，切除整個(gè)右腎，并逐層縫合。WOS組和COS組小鼠假手術(shù)，僅逐層切開暴露腎臟，隨后逐層縫合組織。

1.2.2 肌肉取樣 將造模21個(gè)月后的各組小鼠稱重后麻醉、眼球取血并用頸椎脫臼法處死，立即收集脛骨前肌、腓腸肌組織樣本并稱重。將各組每只小鼠腓腸肌保存于-80℃冰箱，用于real-time PCR和Western blot。將各組每只小鼠脛骨前肌都包埋于OCT中，并浸入液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍，保存于-80℃冰箱，用于laminin免疫熒光檢測(cè)。

1.2.3 血清CCN1、肌酐、尿素氮及尿白蛋白肌酐比值測(cè)定 收集各組小鼠的血液，4℃靜置24 h分層，隨后以3 000 r/min離心得到小鼠血清。小鼠處死前7天內(nèi)，通過動(dòng)物代謝籠收集尿液。血清及尿液標(biāo)本根據(jù)試劑盒說明書中詳細(xì)步驟檢測(cè)得到血清CCN1、肌酐、尿素氮水平及尿白蛋白肌酐比值。

1.2.4 腎臟組織病理學(xué)觀察 每只小鼠處死后立即取出腎臟并切取約2 mm厚腎組織，4%多聚甲醛固定48 h。常規(guī)石蠟包埋，切片。根據(jù)HE染色試劑盒說明書染色。每組隨機(jī)選取3只小鼠各1張腎組織切片，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察小鼠腎臟的病理學(xué)改變。

1.2.5 脛骨前肌肌纖維橫截面觀察 各組小鼠脛骨前肌經(jīng)冷凍切片機(jī)制作7 μm切片，在4%多聚甲醛中固定15 min、5%牛血清白蛋白封閉1 h。加入抗層粘連蛋白抗體（laminin，1∶250）4 ℃過夜。避光加入二抗，室溫孵育1 h。滴加抗熒光衰減的DAPI染液20 μl，室溫避光孵育10 min；封片。使用熒光顯微鏡在相同的曝光時(shí)間后捕獲肌纖維橫截面圖像。使用 Image J軟件在相同條件下處理測(cè)量圖像中的肌纖維面積，獲得各只小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面積（每只小鼠至少統(tǒng)計(jì)6張切片和至少300個(gè)肌纖維）。

1.2.6 腓腸肌組織CCN1、肌肉特異性環(huán)指蛋白1（muscle RING finger 1,MuRF-1）、肌肉萎縮盒F基因（muscle atrophy F-box,MAFbx）mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用TRIzol法提取腓腸肌組織總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBRGeen PCR試劑進(jìn)行real-time PCR。mRNA表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 腓腸肌組織總蛋白提取 切取各組每只小鼠30 mg的腓腸肌，并向各個(gè)組織樣本中加入300 μl RIPA。使用組織勻漿器勻漿提取小鼠腓腸肌中蛋白質(zhì)。使用酶標(biāo)儀測(cè)量蛋白在562 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。根據(jù)BCA法蛋白定量檢測(cè)法測(cè)量勻漿的蛋白質(zhì)樣品濃度。

1.2.8 腓腸肌組織CCN1、p53蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取各組每只小鼠20 μg的腓腸肌組織總蛋白上樣到10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶在室溫下封閉 PVDF膜1 h。在GAPDH、CCN1、p53一抗中 4℃孵育過夜。洗膜后分別加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育PVDF膜1 h。洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。凝膠成像儀觀察并拍照。Image J測(cè)定灰度值并分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值比較 WOC組小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值均高于WOS組小鼠（均P＜0.05），COC組小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值均高于COS組小鼠（均P＜0.05），而COC組小鼠較WOC組小鼠尿白蛋白肌酐比值下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 4組小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值比較（a：肌酐水平比較；b：尿素氮水平比較；c：血清CCN1水平比較；d：尿白蛋白肌酐比值比較）

2.2 4組小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察所見 與WOS組、COS組相比，WOC組、COC組小鼠腎臟組織切片可見明顯的腎間質(zhì)纖維化改變；COC組較WOC組腎間質(zhì)間質(zhì)纖維化程度減輕，見圖2（插頁(yè)）。

圖2 4組小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察所見（HE染色，×200）

2.3 4組小鼠造模后21個(gè)月后體重、脛骨前肌、腓腸肌的重量及脛骨前肌體重比值、腓腸肌體重比值比較WOC組小鼠體重、脛骨前肌、腓腸肌的重量及脛骨前肌體重比值、腓腸肌體重比值均低于WOS組小鼠（均P＜0.05），COC組小鼠體重、脛骨前肌、腓腸肌的重量及脛骨前肌體重比值、腓腸肌體重比值均低于COS組小鼠（均P＜0.05），而COC組小鼠較WOC組小鼠腓腸肌、脛骨前肌的重量及腓腸肌體重比值、脛骨前肌體重比值均升高（均P＜0.05），見表2、圖3。

圖3 4組小鼠脛骨前肌體重比值、腓腸肌體重比值比較（a：腓腸肌體重比值比較；b：脛骨前肌體重比值比較）

表2 4組小鼠造模后21個(gè)月后體重、脛骨前肌、腓腸肌的重量比較

2.4 4組小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面積比較 WOC組小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面積小于WOS組小鼠（P＜0.05），COC組小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面積小于COS組小鼠（P＜0.05），而COC組小鼠較WOC組小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面積大（均P＜0.05），見圖4。

圖4 4組小鼠脛骨前肌肌纖維橫截面觀察比較（a：肌纖維橫截面鏡下觀察所見，laminin熒光染色，×200；b:肌纖維橫截面積頻率分布）

2.5 4組小鼠腓腸肌組織CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表達(dá)水平比較 WOC組小鼠腓腸肌組織CCN1、MuRF-1、MAFbxmRNA表達(dá)水平均高于WOS組小鼠（均P＜0.05），COC組小鼠腓腸肌組織CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表達(dá)水平均高于COS組小鼠（均P＜0.05），而COC組小鼠較WOC組小鼠CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖5。

圖5 4組小鼠腓腸肌組織CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表達(dá)水平比較（a：CCN1 mRNA表達(dá)水平比較；b：MuRF1 mRNA表達(dá)水平比較；c：MARbx mRNA表達(dá)水平比較）

2.6 4組小鼠腓腸肌組織CCN1、p53蛋白表達(dá)水平比較 WOC組小鼠腓腸肌組織CCN1、p53蛋白表達(dá)水平均高于WOS組小鼠（均P＜0.05），COC組小鼠腓腸肌組織CCN1蛋白表達(dá)水平高于COS組小鼠（P＜0.05），而COC組小鼠較WOC組小鼠腓腸肌組織CCN1、p53蛋白表達(dá)水平下降（均P＜0.05），見圖6。

圖6 4組小鼠腓腸肌組織CCN1、p53蛋白表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b:CCN1蛋白表達(dá)水平比較；c：p53蛋白表達(dá)水平比較）

3 討論

CKD的分解代謝環(huán)境（包括炎癥、激素、代謝性酸中毒和胰島素抵抗等因素）可激活蛋白質(zhì)降解，并抑制蛋白質(zhì)合成，肌肉再生受損導(dǎo)致肌肉萎縮加速[12]。肌肉萎縮在CKD早期即可發(fā)生，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。細(xì)胞外基質(zhì)在肌肉生長(zhǎng)、發(fā)育和再生過程中，促進(jìn)骨骼肌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[13]。CCN1由多種類型的細(xì)胞分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CCN1參與老年小鼠骨骼肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[14]。本研究通過5/6腎切除手術(shù)建立CKD小鼠模型，研究CCN1對(duì)CKD小鼠骨骼肌萎縮的影響。本研究結(jié)果顯示CKD造模21個(gè)月后的小鼠骨骼肌確實(shí)發(fā)生明顯萎縮。COC組小鼠較WOC組血清CCN1和尿白蛋白肌酐比值均明顯下降；肌纖維橫截面積、脛骨前肌體重比值、腓腸肌體重比值升高；這些結(jié)果表明CKD造模后可導(dǎo)致CCN1升高，肌肉萎縮加劇，而敲除CCN1可以延緩骨骼肌的萎縮。然而，在CKD造模后COC組較WOC組尿白蛋白肌酐比值明顯下降，腎間質(zhì)纖維化程度減輕，提示肌肉敲除CCN1后對(duì)腎臟功能可能具有保護(hù)作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步分析CKD小鼠腎臟予以驗(yàn)證。

肌肉蛋白的過度降解是肌肉萎縮的主要原因之一[12]。泛素蛋白酶體途徑會(huì)在多種分解代謝情況下被激活，其中MuRF1和MAFbx是這一過程的經(jīng)典標(biāo)志物[15]。本研究結(jié)果顯示CKD造模小鼠較假手術(shù)小鼠MuRF1和MAFbx明顯升高，而COC組較WOC組明顯下降。這表明骨骼肌敲除CCN1后可以改善CKD分解狀態(tài)下的骨骼肌萎縮。CCN1可通過p53、p21、p16誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的衰老[10，16-17]，參與調(diào)節(jié)年齡相關(guān)性肌萎縮[11]。Fox等[18]研究發(fā)現(xiàn)，固定肢體后抑制p53可部分抵抗肌肉萎縮。在惡性腫瘤導(dǎo)致的肌肉萎縮中，肌肉組織p53蛋白表達(dá)也明顯升高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在21個(gè)月CKD小鼠腓腸肌CCN1、p53蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)小鼠升高，而COC組較WOC組明顯下降。這表明CKD可以通過CCN1和p53的上調(diào)導(dǎo)致骨骼肌萎縮增強(qiáng)；骨骼肌敲除CCN1后可以部分延緩p53蛋白對(duì)肌肉的萎縮作用。

綜上所述，本研究通過骨骼肌敲除CCN1的小鼠CKD模型，驗(yàn)證了CCN1對(duì)CKD骨骼肌萎縮中的影響。CCN1可能通過p53途徑促進(jìn)CKD小鼠骨骼肌衰老和蛋白降解途徑加重骨骼肌萎縮。本研究或能為治療CKD骨骼肌萎縮提供參考。