Coffin-Siris 綜合征3 例患兒的臨床表型分析和基因診斷研究

吳臣臣 張惠文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

Coffin-Siris 綜合征（Coffin-Siris syndrome，CSS），是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，包括1～11種亞型，分別由ARID1B、ARID1A、SMARCB1、SMARCA4、SMARCE1、ARID2、DPF2、SMARCC2、SOX11、SOX4、SMARCD1基因變異引起，這些基因主要編碼BAF（BRG1-associated factor）染色質(zhì)重塑復(fù)合體[1-3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)SMARCA2、PHF6基因的致病性變異也可能與CSS有關(guān)[4]。

CSS 的臨床表型多樣，典型的臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，特殊面容（面容粗糙、鼻梁低、發(fā)際線毛發(fā)旺盛、濃眉、睫毛長(zhǎng)、唇毛多、嘴唇厚），多毛癥，肌張力低下，第五指/趾發(fā)育不全等，可合并有胼胝體發(fā)育不良[5]，容易誤診為其他遺傳代謝性疾病，如線粒體病和溶酶體貯積病。

臨床上，全外顯子組測(cè)序技術(shù)（whole-exome sequencing，WES）被廣泛應(yīng)用于疾病的基因診斷。據(jù)報(bào)道，家系全外顯子組測(cè)序（trio-WES）的基因診斷率約為40.0%，先證者模式WES的基因診斷率為28.0%，仍有較多罕見(jiàn)疾病未得到確診[6]。全基因組測(cè)序分析（whole-genome sequencing，WGS）是一種基于全基因組分析的測(cè)序技術(shù)，可提高疾病的診斷率[7]。本文擬采用染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）、trio-WES分析、trio-WGS分析、一代測(cè)序等多種基因檢測(cè)方法對(duì)3例基因診斷未明的CSS 患兒進(jìn)行基因診斷研究，明確其致病原因，為臨床診斷和遺傳咨詢提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2018年—2021年就診于上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院兒童罕見(jiàn)病與疑難雜癥門診的3例確診為Coffin-Siris綜合征患兒的臨床資料。

1.2 方法

1.2.1 臨床表型及各項(xiàng)常規(guī)輔助檢查 分析患兒臨床表型，并完善患兒血常規(guī)、尿常規(guī)、血液生化、乳酸、血氨、甲狀腺功能等檢查，完善血氨基酸、脂酰肉堿譜及尿有機(jī)酸檢測(cè)，完善溶酶體酶學(xué)測(cè)定，完善心電圖、腦電圖、腹部及心臟超聲檢查，完善頭顱MRI檢查。

1.2.2 外周血基因組DNA 提取 經(jīng)家長(zhǎng)同意，應(yīng)用EDTA 抗凝管抽取患兒及家長(zhǎng)外周靜脈血2 mL，采用全基因組DNA提取試劑盒（美國(guó)OMEGA公司）提取DNA。

1.2.3 CMA 使用Affymetrix公司標(biāo)記檢測(cè)試劑盒以及推薦的相關(guān)廠家產(chǎn)品，采用Cytoscan?750K芯片檢測(cè)患兒全基因組范圍的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV），芯片產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)使用Affymetrix公司染色體分析套件（ChAs）1.2.2軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 Trio-WES檢測(cè) 樣本中提取的DNA經(jīng)過(guò)片段化及文庫(kù)制備，用探針捕獲目標(biāo)基因的外顯子及鄰近區(qū)域，經(jīng)高通量測(cè)序平臺(tái)HiSeq 2500（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 Trio-WGS 檢測(cè) 對(duì)CMA 和WES 均未找到致病變異的患兒進(jìn)行WGS 分析。從樣本中提取200 ng 基因組DNA，用Covaris S 220 超聲聚焦儀（Covaris，美國(guó)）進(jìn)行剪切，隨后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。建庫(kù)完成后，在MGISEQ-2000平臺(tái)（MGI，武漢）上對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行雙向測(cè)序，最小讀取深度為40X[8]。

1.2.6 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 針對(duì)SMARCB1、ARID1B基因致病位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表1）并檢測(cè)引物的特異性。目標(biāo)序列PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行正反向測(cè)序，同時(shí)對(duì)父母進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 Coffin-Siris 綜合征SMARCB1和ARID1B基因變異位點(diǎn)引物

1.2.7 致病基因變異位點(diǎn)分析 應(yīng)用dbSNP、ExAC、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD 和PubMed 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢索，判斷是否為新變異。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American college of medical genetics and genomics，ACMG）指南對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析[9]。

1.2.8 外周血建立永生化淋巴細(xì)胞系和蛋白免疫印跡法 為檢測(cè)患兒3ARID 1 B基因第11 號(hào)外顯子（e 11）的部分缺失對(duì)蛋白表達(dá)的影響，采集患兒3 的外周血，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法構(gòu)建EB 病毒感染的永生化淋巴細(xì)胞系[10]。蛋白免疫印跡法用于檢測(cè)ARID 1 B 蛋白的表達(dá)，所用抗體如下：小鼠單克隆抗 ARID1B（Abcam，1:1000）和兔抗 β-actin（碧云天，1:1000）。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床表型及各項(xiàng)常規(guī)輔助檢查結(jié)果

患兒1，男，3 月22 天，因“孕中晚期發(fā)現(xiàn)發(fā)育遲緩至今”于2021年2月19日就診?；純合礕1P1，足月順產(chǎn)，出生身長(zhǎng)47.0 cm，出生體質(zhì)量2.3 kg，Apgar評(píng)分不詳，無(wú)缺氧窒息史。其母否認(rèn)妊娠期間化學(xué)品、毒物和放射線接觸史。孕中晚期外院檢查發(fā)現(xiàn)胎兒較小，胎兒頭顱MRI 示透明隔未見(jiàn)。患兒出生后吃奶尚可，身長(zhǎng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)慢。查體：身長(zhǎng)60.2 cm（-1.9 SDS），體質(zhì)量5.6kg（-2.3 SDS），頭圍41.5 cm，臉小，前囟1.5 cm×1.5 cm，腭裂2度，脊柱無(wú)側(cè)彎，體毛正常，無(wú)蒙古斑。抬頭90度，雙手握拳，雙下肢肌張力稍高?；純焊改笩o(wú)異常，否認(rèn)近親婚配。

患兒2，男，1 歲2 月齡，因“自幼發(fā)育遲緩”于2021年1月25日就診?；純合礕2P1，足月剖腹產(chǎn)，出生身長(zhǎng)50.0 cm，出生體質(zhì)量不詳，Apgar評(píng)分不詳，家長(zhǎng)訴患兒出生時(shí)有缺氧窒息史。其母否認(rèn)妊娠期間化學(xué)品、毒物和放射線接觸史，孕期產(chǎn)檢正常。家長(zhǎng)訴患兒生長(zhǎng)發(fā)育稍落后于同齡兒童，6 個(gè)月會(huì)翻身，現(xiàn)不會(huì)獨(dú)走，可扶走、獨(dú)站片刻。目前有無(wú)意識(shí)發(fā)音，不會(huì)叫人，可認(rèn)物，偶可按指令做簡(jiǎn)單動(dòng)作。查體：身長(zhǎng)77.2 cm（-0.5 SDS），體質(zhì)量9.7 kg（-0.7 SDS），有喉軟骨發(fā)育不良。全身毛發(fā)旺盛，面部雙眼瞼下斜，背部無(wú)蒙古斑，無(wú)脊柱側(cè)凸，肝脾未及明顯腫大。

患兒3，女，2 歲8 月齡，因“自幼發(fā)育遲緩”于2018年4月16日就診。患兒系G1P1，足月順產(chǎn)，出生身長(zhǎng)50.0cm，出生體質(zhì)量4.0kg，否認(rèn)出生時(shí)缺氧窒息史。其母否認(rèn)妊娠期間化學(xué)品、毒物和放射線接觸史，孕期產(chǎn)檢正常?；純撼錾笊L(zhǎng)發(fā)育落后于同齡兒童，1歲時(shí)Gesell評(píng)分68～75分，不能獨(dú)站。目前尚不會(huì)說(shuō)話，走路不穩(wěn)。無(wú)癲癇發(fā)作，視力和聽(tīng)力可。查體：身長(zhǎng)91.0 cm（-0.6 SDS），體質(zhì)量15.0 kg（+1.1 SDS）；面容眉毛重，睫毛長(zhǎng)，嘴唇厚，舌偏大，雙眼瞼下斜，雙手第五指稍彎曲，指墊明顯。四肢和背部毛發(fā)旺盛。皮膚無(wú)色素沉著，心肺腹部無(wú)異常，外生殖器無(wú)異常。

患兒2胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）43.1 ng/mL，低于正常值低限（51～303ng/mL）。3例患兒實(shí)驗(yàn)室檢查與臨床特點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 3例患兒實(shí)驗(yàn)室檢查及臨床特點(diǎn)

2.2 CMA分析結(jié)果

未檢測(cè)到明確的致病性微缺失或微重復(fù)。

2.3 Trio-WES和Sanger測(cè)序明確患兒1和患兒2致病變異

Trio-WES 提示患兒1 攜帶1 個(gè)SMARCB 1基因（NM_003073.3）雜合剪切變異c.363-3C＞G。對(duì)該患兒及其父母目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)該患兒SMARCB1基因存在該變異，父母均不攜帶該變異，為新發(fā)變異?；純?ARID1B基因（NM_020732）存在一個(gè)雜合剪切變異c.3550+1(IVS 13)G＞A，同樣經(jīng)過(guò)對(duì)患兒2及其父母目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger驗(yàn)證，結(jié)果顯示該患兒ARID 1 B基因存在該變異，父母均為野生型，屬于新發(fā)變異。兩例患兒及其父母Sanger測(cè)序峰圖見(jiàn)圖1。

圖1 患兒1、2 及其父母Sanger 測(cè)序圖

2.4 Trio-WGS分析和Sanger測(cè)序明確患兒3致病變異

WGS提示患兒3ARID1B基因（NM_020732.3）存在雜合性e11部分（chr6:157495236-157495405）缺失。對(duì)患兒及其父母目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示該患兒ARID1B基因存在該片段缺失，父母均不攜帶該變異，屬于新發(fā)變異（圖2A）。

圖2 患兒3 Sanger 測(cè)序圖和蛋白免疫印跡結(jié)果

2.5 變異致病性分析

根據(jù)ACMG 遺傳變異分類指南評(píng)級(jí)規(guī)則，對(duì)3例患兒進(jìn)行變異致病性分析。

患兒1SMARCB 1基因變異位點(diǎn)c.363-3 C＞G分析：①為新發(fā)突變（強(qiáng)致病性證據(jù)PS2，父母驗(yàn)證為野生型）；②比對(duì)千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD等未見(jiàn)變異報(bào)道和收錄（中等致病性證據(jù)PM2）；③多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)為有害（支持性證據(jù)，PP3）。此變異評(píng)定為“可疑致病”（PS2+PM2+PP3）。

患兒2ARID1B基因變異位點(diǎn)c.3550+1(IVS13)G＞A 分析：①LOF 變異導(dǎo)致基因功能可能喪失（超強(qiáng)致病證據(jù)PVS 1）；②新發(fā)變異（強(qiáng)致病性證據(jù)PS 2，該變異經(jīng)雙親驗(yàn)證為新生變異）；③比對(duì)千人數(shù)據(jù)庫(kù)、EXAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異（中等致病性證據(jù)PM2）；④多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)為有害（支持性證據(jù)，PP3）。此變異評(píng)定為“致病”（PVS1+PS2+PM2+PP3）。

患兒3ARID1B基因CNV分析：①LOF變異導(dǎo)致基因功能可能喪失（超強(qiáng)致病證據(jù)PVS 1）；②新發(fā)變異（強(qiáng)致病性證據(jù)PS2，該變異經(jīng)雙親驗(yàn)證為新生變異）；③比對(duì)千人數(shù)據(jù)庫(kù)、EXAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異（中等致病性證據(jù)PM2）。此變異評(píng)定為“致病”（PVS1+PS2+PM2）。

結(jié)合臨床表現(xiàn)和靶向測(cè)序的結(jié)果，3例患兒均診斷為Coffin-Siris綜合征，其基因變異位點(diǎn)和致病性分析見(jiàn)表3。

表3 3例患兒的基因變異及致病性分析

2.6 患兒3 ARID1B蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步證明患兒3 的ARID 1 B基因拷貝數(shù)缺失為致病性變異，通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)ARID1B蛋白的表達(dá)量。如圖2B所示，患者3 外周血淋巴細(xì)胞ARID 1 B 蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照。

3 討論

本文的研究對(duì)象均因“發(fā)育遲緩”來(lái)院就診。詢問(wèn)相關(guān)病史，結(jié)合相關(guān)臨床表現(xiàn)，我們考慮可能為CSS。目前CSS 尚無(wú)明確的發(fā)病率報(bào)道，國(guó)外報(bào)道200余例且發(fā)現(xiàn)男女發(fā)病率無(wú)明顯差異[11]，中國(guó)人群中僅有散在病例報(bào)道[12-14]。CSS臨床表型多樣，尚無(wú)統(tǒng)一的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、特殊面容合并多系統(tǒng)異常表現(xiàn)，對(duì)臨床診斷具有重要價(jià)值，但要明確其致病性變異，需結(jié)合基因診斷的結(jié)果。CSS致病基因的發(fā)現(xiàn)集中在近10年，臨床醫(yī)生可能對(duì)此病認(rèn)識(shí)不足，容易出現(xiàn)延遲診斷和誤診。

CMA 和WES 技術(shù)是近些年進(jìn)行疾病致病基因檢測(cè)的主要工具。CMA 和WES 技術(shù)的陽(yáng)性檢出率都取決于探針的設(shè)計(jì)，因此它們對(duì)新發(fā)和罕見(jiàn)變異位點(diǎn)的檢出率較低[15]。WGS是一種更有應(yīng)用前景的測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)基因外顯子及內(nèi)含子區(qū)變異（包括點(diǎn)變異、20bp以內(nèi)插入缺失）和染色體非整倍體變異，對(duì)CNV、結(jié)構(gòu)變異、線粒體DNA變異、單核苷酸變異和插入缺失的檢出率要高于CMA 和WES，有文獻(xiàn)報(bào)道，WGS陽(yáng)性率可高達(dá)50.0%[7]。本文結(jié)合病例的實(shí)際情況，采用多種基因診斷技術(shù)對(duì)3 例疑似CSS患兒進(jìn)行病因?qū)W研究。

本研究中，3 例患兒CMA 結(jié)果均為陰性。采用trio-WES分析，發(fā)現(xiàn)患兒1為SMARCB1基因新發(fā)剪切變異，患兒2為ARID1B基因新發(fā)剪切變異。通過(guò)CMA和WES檢測(cè)，患兒3仍未找到明確的致病位點(diǎn)，為進(jìn)一步明確基因診斷，對(duì)患兒3 及其家長(zhǎng)進(jìn)行家系WGS。結(jié)果顯示，患兒3的ARID1B基因存在e11的部分缺失，Sanger驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)父母均為野生型。

SMARCB1基因變異與CSS3型（MIM:614608）有關(guān)，該病主要臨床表現(xiàn)為宮內(nèi)發(fā)育遲緩，矮小，小頭畸形，長(zhǎng)睫毛，脊柱側(cè)凸，末節(jié)指（趾）骨發(fā)育不良或缺失，多毛，智力障礙，發(fā)育落后，胼胝體異常等[16]，患兒1的臨床表現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的臨床表現(xiàn)相符，主要出現(xiàn)了孕中晚期的發(fā)育遲緩，腦發(fā)育不良以及出生后發(fā)育遲緩。另外，該患兒有雙下肢肌張力的異常表現(xiàn)，臨床要注意定期隨訪，及早進(jìn)行康復(fù)治療干預(yù)。本研究中該患兒SMARCB 1基因的新生剪切變異c.363-3C＞G，為國(guó)際上未報(bào)道的變異位點(diǎn)，豐富了SMARCB1基因突變譜。

ARID 1 B基因變異是CSS 患者中變異頻率最高的基因，與CSS1型（MIM:135900）有關(guān)，主要臨床表現(xiàn)為面容粗，鼻尖鈍，瞼裂下斜，睫毛長(zhǎng)，眉毛濃密，多毛癥，手指墊突顯，智力障礙，發(fā)育遲緩，身材矮小，語(yǔ)言發(fā)育落后，胼胝體發(fā)育不全，合并反復(fù)呼吸道感染，第五手指遠(yuǎn)端指骨短小等[17]?；純? 和患兒3 均出現(xiàn)了發(fā)育落后，多毛癥及面部雙眼瞼下斜的異常體征?；純? 的獨(dú)特表現(xiàn)為反復(fù)上呼吸道感染，患兒3的獨(dú)特表現(xiàn)為面部和手指的異常體征，以及語(yǔ)言發(fā)育落后，兩例患兒均未出現(xiàn)頭顱MRI 的異常，與文獻(xiàn)報(bào)道的ARID 1 B基因變異臨床表現(xiàn)基本相符[17]。本研究中，患兒2ARID1B基因存在新生剪切變異c.3550+1(IVS13)G＞A，患兒3ARID1B基因存在新生CNV（e11del），兩個(gè)位點(diǎn)均為未報(bào)道的變異位點(diǎn)，豐富了ARID1B基因變異譜。有報(bào)道指出ARID1B基因的微缺失在其疾病譜中起著重要的作用，占比高達(dá)10%，對(duì)ARID 1 B基因進(jìn)行CNV 檢測(cè)和分析可提高該基因變異的檢出率和CSS陽(yáng)性確診率[18]?；純? 的基因診斷經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的過(guò)程，最終通過(guò)trio-WGS分析確定了其致病基因變異位點(diǎn)，為WGS在CSS診斷中的作用提供了科學(xué)依據(jù)。此外，還有研究表明，ARID 1 B基因變異是導(dǎo)致智力落后的重要原因之一，約占0.9%[19]，因此，當(dāng)臨床上有不明原因智力落后的患兒就診時(shí)，臨床醫(yī)生需要考慮到該基因的變異，如遇到CMA 和WES 均無(wú)法確診時(shí)，應(yīng)考慮WGS的盡早應(yīng)用。

目前，CSS患者尚無(wú)有效的治療方法，主要是對(duì)癥支持治療，如康復(fù)治療、生長(zhǎng)激素治療，同時(shí)預(yù)防心臟、胃腸、神經(jīng)等系統(tǒng)的并發(fā)癥[20]。本組報(bào)道的3例患兒基因變異均為未報(bào)道過(guò)的新發(fā)變異，進(jìn)一步擴(kuò)展了CSS 的遺傳譜。由于本研究?jī)H報(bào)道3 例CSS患兒，存在一定的局限性。當(dāng)臨床工作中遇到存在疑似CSS臨床表型患兒，建議盡早行WES以明確診斷，如果診斷仍未明，可行WGS 以明確基因診斷，為后續(xù)治療及遺傳咨詢提供確診性依據(jù)。