不同控制水平哮喘兒童的腸道菌群分析

鄒羽彤 黃林生 鐘 慧 楊 蓉 谷 麗

1.安徽理工大學(xué)上海十院臨床學(xué)院（安徽淮南 232001）；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院（上海 200072）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童時期最常見的慢性氣道疾病之一。近20余年來，我國兒童哮喘的患病率呈明顯上升趨勢[1-3]，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。我國在2012 年—2013 年對10 個城市大型醫(yī)院的3 069 例哮喘兒童控制現(xiàn)狀的調(diào)查顯示，即使嚴(yán)格遵循哮喘全球防治創(chuàng)意（GINA）方案治療，仍有28.7%與45.0%的患兒未得到控制或部分控制[4]。因此，如何有效提高哮喘控制水平，對改善哮喘患兒的生活質(zhì)量，減輕其家庭以及社會負(fù)擔(dān)意義重大。目前越來越多的研究致力于探索新的方法來改變哮喘的控制現(xiàn)狀[5-6]。其中，腸道菌群的研究成為熱點領(lǐng)域。腸道菌群作為人體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，除了影響腸道內(nèi)的微環(huán)境外，在人體免疫穩(wěn)態(tài)中也起到重要作用[7]。研究表明腸道菌群失調(diào)與哮喘的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)[8-10]。本文擬通過研究不同控制水平哮喘患兒之間腸道菌群水平的差異，探討腸道菌群對哮喘患兒控制水平的影響，為微生態(tài)制劑在哮喘治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月至2020年12月于上海市第十人民醫(yī)院兒科門診診治并確診為哮喘的患兒為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合我國兒童支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016 年版）[11]；②年齡10～12歲；③患兒具有良好的依從性，堅持規(guī)律治療。隨機(jī)選取同期本院健康體檢兒童為對照組。對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡10～12歲；②體檢未見異常，且無哮喘及其他過敏性疾病史。各組排除標(biāo)準(zhǔn)：①不配合肺功能檢查、糞便檢測者；②近4周服用益生菌；③近4 周有呼吸系統(tǒng)感染及抗生素使用史；④合并除哮喘以外的慢性呼吸道疾病；⑤并發(fā)其他系統(tǒng)疾病如內(nèi)分泌疾病、肝腎功能不全、心血管疾病和自身免疫疾病等。

根據(jù)我國兒童支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，對哮喘患兒近4 周日間癥狀、夜間是否憋醒、應(yīng)急緩解藥使用頻率、活動受限情況，進(jìn)行哮喘控制水平分級評估；存在1 項及以上癥狀歸入未控制/部分控制組，無以上任一癥狀歸入控制組。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（SHSY-IEC-4.0/19-175/01），所有受試者在研究開始前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量等一般臨床資料。

1.2.2 治療 所有患兒均依照我國兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[11]進(jìn)行治療，在入組前均接受沙美特羅替卡松粉霧劑（50ug/100ug）作為長期治療藥物。治療時間為開始規(guī)律用藥至入組當(dāng)天。

1.2.3 樣本采集 所有研究對象均在入組后當(dāng)天留取2g新鮮糞便樣本，置于可室溫保存的一次性大便樣本采集處理器中；在24h內(nèi)轉(zhuǎn)移至凍存管中收存，放入-80℃冰箱保存?zhèn)錅y。

1.2.4 肺功能檢測 所有研究對象入組當(dāng)天，由專業(yè)人員使用Medi-soft 肺功能檢測儀行肺功能檢測，檢測指標(biāo)包括用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）、FEV1/FVC、最大呼氣中段流量（maximal mid-expiratory flow，MMEF）、用力呼氣流速（forced expiratory flow，F(xiàn)EF）的FEF25、FEF50、FEF75。

1.2.5 糞便16 s rRNA 細(xì)菌檢測 ①DNA 提取與擴(kuò)增：按照TIANamp stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便樣本中的DNA，而后行靶向PCR 擴(kuò)增，回收純化PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行熒光定量，而后按照每個樣本的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)的比例混合。②高通量測序與分析：采用Illumina Miseq高通量測序平臺測序，后經(jīng)數(shù)據(jù)拆分、去引物序列、成對末端讀長拼接、序列質(zhì)量及長度過濾和截取以及去嵌合體后獲得最終的有效OTU（operational taxonomic unit）聚類分析數(shù)據(jù)?；贠TU聚類數(shù)據(jù)再對各個分類數(shù)據(jù)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。③Alpha 多樣性指數(shù)：反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中Observed otus指數(shù)是指樣本中實際測定得到的物種數(shù)量，Shannon指數(shù)用于衡量樣品中物種均勻度的指數(shù)，Pielou E指數(shù)的計算考慮到樣品中的分類總數(shù)和每個分類所占的比例，F(xiàn)aith pd指數(shù)基于系統(tǒng)發(fā)生樹來計算的一種多樣性指數(shù)，它用各個樣品中OTU 的代表序列計算出構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的距離，將某一樣品中的所有代表序列的枝長加和，從而得到數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析Veillonella豐度對哮喘控制水平的預(yù)測價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共入組哮喘患兒34例，過程中控制組有1例不配合肺功能檢查，未控制/部分控制組有1例近4周有抗生素使用史，2例不配合糞便采集。共4例患兒脫落，最終納入30例。

控制組16例，男10例、女6例，年齡（12.19±1.11）歲，身高（156.50±9.08）cm，體質(zhì)量（56.7±13.68）kg；未控制/部分控制組14例，男8例、女6例，年齡（12.92±1.59）歲，身高（159.64±14.11）cm，體質(zhì)量（58.46±18.25）kg；控制組中臨床緩解期12例，慢性持續(xù)期4例；未控制/部分控制組中慢性持續(xù)期14例。對照組12例，男6例、女6例，年齡（13.17±1.03）歲，身高（161.48±5.84）cm，體質(zhì)量（52.54±10.29）kg。三組間性別（χ2=0.80，P=0.804）、年齡（F=2.33，P=0.110）、身高（F=0.83，P=0.443）及體質(zhì)量（F=0.56，P=0.579）比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義?？刂平M治療時間為（1.22±0.18）年，未控制/部分控制組為（1.24±0.15）年，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.41，P=0.684）。

2.2 三組主要肺通氣功能檢測結(jié)果比較

三組間FVC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF、FEF25、FEF75絕對值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組間FEF50絕對值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），未控制/部分控制組較低。見表1。

表1 三組通氣功能指標(biāo)（絕對值）比較()

表1 三組通氣功能指標(biāo)（絕對值）比較()

2.3 腸道菌群的物種數(shù)量與Alpha多樣性比較

通過對42個糞便樣本的高通量測序分析，分析得到2 721個OTU，其中三組共有OTU數(shù)目1 289個，對照組特有257 個OTU，未控制/部分控制組特有198個OTU，控制組特有158個OTU（圖1a）。三組之間Alpha多樣性指數(shù)（4個指數(shù)）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組間腸道菌群測序的Alpha多樣性比較()

表2 三組間腸道菌群測序的Alpha多樣性比較()

通過對三組腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)組分分析發(fā)現(xiàn)，三組均主要由25個屬構(gòu)成。兩種菌屬均是腸道菌群的主要菌屬（圖1b），其中擬桿菌屬（Bacteroides）物種相對豐度控制組為29.61（27.13～36.11）%，未控制/部分控制組為30.22（26.88～48.19）%，對照組為27.43（20.82～33.99）%，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（H=3.39，P=0.184）；糞桿菌屬（Faecalibacterium）物種相對豐度控制組為（20.05±10.10）%，未控制/部分控制組為15.55（11.15～21.28）%，對照組為（23.95±8.47）%，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（H=3.36，P=0.186）。

圖1 腸道菌群豐度及物種差異分析

未控制/部分控制組中韋榮球菌屬（Veillonella）物種相對豐度為0.06（0.01～0.25）%，控制組為0.53（0.19～0.92）%，對照組為0.17（0.09～0.82）%，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=9.03，P=0.011）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，未控制/部分控制組中Veillonella豐度較控制組以及對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

LEfSe 分析結(jié)果提示殊異韋榮菌（Veillonella.dispar）是控制組中的特征性菌屬，而戈登副擬桿菌（Parabacteroides.gordonii）是未控制/部分控制組的特征性菌屬（圖1c）。

2.4 Veillonella豐度對哮喘控制水平預(yù)測的ROC曲線分析

行ROC曲線分析可見，Veillonella豐度對哮喘控制水平預(yù)測的曲線下面積為0.82（95%CI：0.66～0.98，P=0.003）。取最佳臨界值點豐度為0.0018時，預(yù)測哮喘控制水平的特異性為28.6%，敏感度為86.7%。見圖2。

圖2 Veillonella 豐度預(yù)測哮喘控制水平的ROC 曲線分析

3 討論

哮喘長期治療方案的制訂及調(diào)整以其控制水平為依據(jù)，可使患兒得到更充分的治療，從而達(dá)到并維持臨床控制[11]。近年來，我國兒童哮喘的規(guī)范化管理模式及治療手段在不斷改進(jìn)，也取得了一定的進(jìn)展，但是仍有不少患兒未能達(dá)到理想的治療目標(biāo)，兒童哮喘的總體控制水平有待進(jìn)一步提高[4,12]。達(dá)到癥狀的良好控制和維持正常肺功能是哮喘治療的主要目標(biāo)。小氣道因其自身細(xì)小且分支多的特點，是呼吸系統(tǒng)疾病中較早且容易被侵犯的部位，也是氣道高反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵部位[13]。有研究表明，較多哮喘患者存在小氣道受損，小氣道功能與氣道高反應(yīng)之間密切相關(guān)，與哮喘控制水平及遠(yuǎn)期預(yù)后都有著十分緊密的聯(lián)系[14-17]。本研究中，三組間通氣功能指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但未控制/部分控制組小氣道指標(biāo)FEF25、FEF50較對照組有下降趨勢，提示小氣道通氣功能障礙可能與哮喘控制不佳有關(guān)。因此，僅根據(jù)臨床癥狀以及肺通氣功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC 而判斷哮喘控制，易忽視患兒小氣道功能障礙的情況，可能導(dǎo)致未來哮喘控制不良，進(jìn)而影響哮喘兒童的遠(yuǎn)期預(yù)后。

腸道菌群作為腸道免疫系統(tǒng)的重要刺激因素，通過機(jī)體局部或全身免疫應(yīng)答反應(yīng)等多種途徑調(diào)節(jié)免疫平衡，促進(jìn)腸黏膜相關(guān)淋巴組織的成熟，增強(qiáng)腸黏膜的屏障功能。腸道菌群的構(gòu)成與過敏性疾病的發(fā)生有關(guān)，腸道菌群的改變可引起肺部免疫和肺部疾病的變化[18]。腸道微生物群可通過產(chǎn)生細(xì)菌配體、細(xì)菌代謝物和能夠通過血液循環(huán)到達(dá)肺部的免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)肺免疫[19-20]。一些研究顯示，成人哮喘患者與健康人群的腸道菌群之間雖沒有顯著差異，但存在一些產(chǎn)丁酸鹽的特異性菌屬，可能在癥狀早期控制中發(fā)揮作用[21]。

人體的腸道主要菌群是擬桿菌門與厚壁菌門，本研究中哮喘控制組的特征菌屬Veillonella是一類以利用有機(jī)酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生乙酸鹽、丙酸鹽為主的革蘭陰性厭氧微小球菌，屬于厚壁菌門，參與構(gòu)成人和動物的口腔、泌尿生殖器、呼吸道及腸道內(nèi)的正常菌群。一項來自加拿大的縱向研究顯示，哮喘高風(fēng)險的嬰兒腸道中韋榮球菌（Veillonella）、糞腸球菌（Faecalis）、毛螺菌（Lachnospira）、羅氏菌（Rothia）的相對豐度顯著降低[9]。在進(jìn)一步的動物實驗中，這四種菌的腸道定植也明顯改善了無菌小鼠的氣道炎癥[22]，但哮喘的高危兒童是否可通過早期補充這些益生菌來改善哮喘的控制水平，仍有待臨床證實。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)1 歲時糞便中丁酸鹽和丙酸含量高的兒童在3～6歲患哮喘的可能性也較小，而在小鼠哮喘模型中補充短鏈脂肪酸可減輕其氣道炎癥反應(yīng)[23-25]。有研究表明，在出生后第一年補充特定的微生物制劑對哮喘高危兒童來說具有一定益處[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，補充益生菌輔助治療支氣管哮喘，可調(diào)節(jié)患兒免疫功能，降低哮喘復(fù)發(fā)率[26]。值得注意的是，目前多為腸道菌群與哮喘發(fā)病機(jī)制之間的相關(guān)性研究，而腸道菌群對哮喘控制水平影響的研究較少。近年來多項研究表明，單一或復(fù)合益生菌（如鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、副乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等）在哮喘的防治中具有一定的輔助效果[27-29]，雖然其機(jī)制尚不明確，但是提示腸道菌群可能在一定程度上可影響哮喘患者的控制水平。本研究提示控制不佳的哮喘患兒腸道菌群特征性菌屬Veillonella豐度明顯減少，可能與哮喘控制水平具有一定的相關(guān)性。但具體影響途徑，是通過減少對有機(jī)酸的分解轉(zhuǎn)化或是腸道菌群紊亂促進(jìn)促炎因子轉(zhuǎn)錄[30]亦或是其他通路，現(xiàn)有研究并無法確定。該研究為哮喘兒童的長期控制治療可能提供了一種新思路，通過補充優(yōu)勢菌群的微生物制劑或進(jìn)行優(yōu)勢菌群移植來調(diào)節(jié)或改善哮喘患兒的腸道菌群紊亂，以達(dá)到控制哮喘水平的目的；為哮喘的臨床治療提供了可能性，但仍需對腸道菌群與哮喘發(fā)病機(jī)制的影響進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，控制不佳的哮喘兒童腸道菌群中Veillonella豐度明顯減少，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究深入。本研究仍存在一定的不足之處，首先納入的樣本量較少，入組患兒均未處于急性發(fā)作期，主要通氣功能結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，可能存在單中心偏倚，試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步增加樣本量來論證；其次，本研究采用16 s rRNA 的檢測方式，對未控制/部分控制組的特征性菌屬并沒有更深入的分析，使用更精確的檢測技術(shù)分析或許會得到更好的結(jié)果；第三，本研究僅檢測了單節(jié)點的患兒腸道菌群，還需對臨床入組人群進(jìn)行腸道菌群動態(tài)追蹤和分析，或哮喘規(guī)范治療前后腸道菌群比較。也期待大樣本、多中心的臨床研究做進(jìn)一步的論證，為臨床兒童哮喘的防治提供新的思路。