兒童異基因造血干細(xì)胞移植后細(xì)胞免疫重建的臨床研究

宋 娜 孫 鳴 祁閃閃 王 卓 楊 李 盧文婕 吳 旻 夏 維 陳 燕 熊 昊

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院血液腫瘤科（湖北武漢 430016）

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是目前治療兒童惡性/難治性血液病、先天性遺傳代謝性/免疫性疾病及某些實(shí)體瘤的有效方法，已在臨床廣泛應(yīng)用。受者移植后早期免疫重建的缺失或延遲與移植后感染、復(fù)發(fā)以及移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）密切相關(guān)[1-2]。但目前國內(nèi)對兒童allo-HSCT后免疫功能的監(jiān)測報(bào)道甚少。本研究擬通過動態(tài)監(jiān)測患兒接受allo-HSCT后第0、14、21、28、60及100 d淋巴細(xì)胞亞群水平，以了解兒童移植后早期免疫重建的規(guī)律，以及與急性移植物抗宿主?。╝GVHD）發(fā)生的可能相關(guān)性，從而降低移植相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，進(jìn)一步提高接受allo-HSCT患兒的生存質(zhì)量。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019 年7 月至2020 年10 月在武漢兒童醫(yī)院血液腫瘤科接受allo-HSCT 的患兒作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡6 個月～14 歲；②移植后滿100 d；③臨床資料完整；④接受移植的臨床指征均符合國家衛(wèi)建委臨床疾病治療指南[3]，包括各種惡性血液病、重型再生障礙性貧血、β 地中海貧血、遺傳代謝性疾病（黏多糖貯積癥、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良等）、免疫缺陷病（Wiskott-Aldrich 綜合征、X-連鎖高免疫球蛋白血癥等）、難治的噬血細(xì)胞綜合征等。排除標(biāo)準(zhǔn)：移植的臨床指征不符合治療指南。

根據(jù)患兒移植后是否發(fā)生aGVHD 分為nonaGVHD組（26例）和aGVHD組（16例）。

患兒接受移植前均由其家長或法定監(jiān)護(hù)人充分知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理方案 非惡性血液病[再生障礙性貧血（AA）13例，β-地中海貧血2例，Wiskott-Aldrich綜合征（WAS）2例，范可尼貧血（Faconi）1例，黏多糖貯積癥1 例，噬血細(xì)胞綜合征（HLH）1 例，X-連鎖高免疫球蛋白血癥1 例，異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（MLD）1 例]的預(yù)處理方案采用經(jīng)典的白消安/環(huán)磷酰胺+抗胸腺細(xì)胞球蛋白（Bu/Cy+ATG）方案；惡性血液病[急性髓系白血?。ˋML）14 例，骨髓增生異常綜合征（MDS）3 例，幼年型粒-單白血?。↗MML）2 例，急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）1 例]采用親緣單倍型清髓預(yù)處理+后置環(huán)磷酰胺（PTCy）方案。

1.2.2 GVHD及其預(yù)防 aGVHD指發(fā)生在移植后100 d以內(nèi)，主要表現(xiàn)為皮膚、胃腸道和肝臟3個器官的炎性反應(yīng)。aGVHD 的嚴(yán)重程度分度標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)移植后非復(fù)發(fā)相關(guān)死亡的影響程度制定，采用皮膚、胃腸道和肝臟急性GVHD分別積分后再形成總的評分，其中臨床最常采用改良Glucksberg 標(biāo)準(zhǔn)[4]。非惡性血液病預(yù)防aGVHD采用環(huán)孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+短程甲氨蝶呤（MTX）：移植后+1 d，MTX 15 mg/m2；+3、+6 d，MTX 10 mg/m2。預(yù)處理開始使用CsA 1.5 mg/(kg·d)持續(xù)靜滴20 h，移植前－1 d改為3 mg/(kg·d)持續(xù)20 h靜滴，血藥濃度穩(wěn)定后，如胃腸道能耐受改為口服。如患兒無GVHD，移植后6個月起逐漸減量，至移植后9～12個月減停。惡性血液病預(yù)防aGVHD采用PTCy方案：移植后+3、+4 d使用MTX 50 mg/(kg·d)，+5、+6 d使用ATG 1 mg/(kg·d)，+5 d使用CSA 3 mg/(kg·d)持續(xù)20 h靜滴，如病情穩(wěn)定，行外周血標(biāo)本DNA 短串聯(lián)重復(fù)序列分析PCR檢查（short tandem repeat，STR-PCR），為完全植入則改為口服（口服劑量為靜脈劑量的2.5倍），在3～6 個月內(nèi)逐漸減停。MMF 和CsA 同時開始應(yīng)用（或+1 d開始給藥），移植成功或+30 d停用，30 mg/(kg·d)，分2、3次口服。

1.2.3 感染預(yù)防 預(yù)處理開始至植入前靜滴棘白霉素類藥物預(yù)防真菌感染，植入后或沒有侵襲性真菌感染改為氟康唑或者泊沙康唑口服至停用免疫抑制劑。預(yù)處理開始至回輸前使用更昔洛韋預(yù)防巨細(xì)胞病毒（CMV）感染10 d，回輸后+1 d開始使用阿昔洛韋預(yù)防病毒感染至停用免疫抑制劑后1 個月。植入后口服磺胺甲惡唑（SMZ）預(yù)防卡氏肺囊蟲感染至停用免疫抑制劑后1個月。

1.2.4 供者外周血造血干細(xì)胞動員、采集及回輸 供者應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）10 μg/(kg·d)，皮下注射，連用5 d，d 5接受G-CSF治療2 h后開始用COM.TEC 血細(xì)胞分離機(jī)（費(fèi)森尤斯）進(jìn)行供者外周血造血干細(xì)胞采集，通常采集1次，必要時于d 6再采集1次直到采集單個核細(xì)胞數(shù)達(dá)到預(yù)期量為止。采用Bu/Cy方案者單個核細(xì)胞數(shù)控制在（6～10）×108個/kg，CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞2×106個/kg；采用PTCy方案者單個核細(xì)胞數(shù)＞10×108個/kg，CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10×106個/kg。造血干細(xì)胞均經(jīng)中心靜脈回輸給患兒。

1.2.5 淋巴細(xì)胞亞群檢測 檢測患兒移植前，移植當(dāng)天，移植后14、21、28、60及100天外周血淋巴細(xì)胞亞群［CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD16+CD56+自然殺傷（NK）細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞］的絕對計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒（BD MultiTEST IMK Kit）和FACS Canto II型流式細(xì)胞儀均購自美國（Becton Dickinson and Company，BD Bioscience）。采集患兒外周靜脈血 3～4 mL經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀（EDTA -K2）抗凝后備用。取兩支絕對計(jì)數(shù)管，1管用于檢測T 細(xì)胞，加入CD 3-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD 8-藻紅蛋白（PE）、CD 4-別藻青蛋白（APC）、CD 45-多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）混合抗體10 μL；另1 管用于檢測B 細(xì)胞及NK 細(xì)胞，加入CD 3-FITC、CD16CD56-PE、CD45-PerCP、CD19-APC混合抗體10 μL，再分別對應(yīng)加入抗凝全血50 μL，震蕩3 s左右混勻，室溫避光孵育15 min，然后各管分別加入1:10稀釋的溶血素450 μL，震蕩混勻，室溫避光孵育10 min后上機(jī)檢測。

1.2.6 移植物植入及造血重建判斷 造血干細(xì)胞移植后粒系植入標(biāo)準(zhǔn)：中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（ANC）植入連續(xù) 3 d ≥ 0.5×109/L的第1 天為植入日期；血小板（PLT）植入標(biāo)準(zhǔn)：血小板脫離輸注情況下連續(xù)7 d ≥ 20×109/L的第1 天為植入日期。在患兒出倉前行外周血標(biāo)本DNA STR-PCR 以判斷基因型轉(zhuǎn)變及植入成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8.0.1棱鏡科研繪圖工具作圖。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用Wilcoxon或Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植效果及移植并發(fā)癥

共75例接受allo-HSCT患兒，其中移植后滿100 d，臨床資料完整的42例納入本研究，男20例、女22例，中位年齡5.4（2.8～9.3）歲。

全部患兒移植后均獲造血重建，中性粒細(xì)胞≥0.5×109/L和血小板≥20×109/L 的中位時間分別為10.0（7.0～16.0）d和13.0（7.0～31.0）d。預(yù)處理期間無多器官衰竭、顱內(nèi)出血、肝靜脈閉塞綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。移植后CMV 感染15 例，EB 病毒（EBV）感染7例，肝靜脈阻塞5例，出血性膀胱炎6例。

42例患兒中發(fā)生aGVHD 16例，男8例、女8例，aGVHD 發(fā)生的中位時間為20.0（6.0～36.0）d。初始疾病為急性髓細(xì)胞性白血病（AML）7例，JMML 2例，MDS 2例，WAS、Faconi、AA、MLD、HLH各1例。移植方式：親緣半相合11例、非親緣5例。預(yù)處理方式：PTCY 10例、Bu/Cy+ATG 4例、Bu/Cy 1例、氟達(dá)拉濱（Flu）+ATG+CTX 1 例。發(fā)病部位及分度：皮膚Ⅰ～Ⅱ度1例、Ⅱ度2例、Ⅱ～Ⅲ度1例、Ⅲ度4例，胃腸道Ⅱ～Ⅲ度1例、Ⅲ度1例，腸道Ⅳ度2例，皮膚、腸道Ⅰ度1例、Ⅲ度1例、Ⅳ度1例，皮膚Ⅱ度、胃腸道Ⅲ度1 例。因Ⅳ度aGVHD（腸道Ⅳ度）死亡1 例，其余隨訪至2020年10月仍存活。

2.2 移植前后早期淋巴細(xì)胞亞群變化

移植前后不同時間點(diǎn)患兒 CD3+T細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD 8+T 細(xì)胞、CD 16+CD 56+NK 細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平以及D4+/CD8+比值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=99.15～188.10，P＜0.05）。

其中CD16+CD56+NK細(xì)胞恢復(fù)最快，在移植后21 d基本可以達(dá)到移植前水平，28 d后超過移植前水平。CD3+T細(xì)胞在移植后60 d基本可以達(dá)到移植前水平，CD8+T 細(xì)胞恢復(fù)早于CD4+T 細(xì)胞，到移植后60 d已超過移植前水平，而CD4+T 細(xì)胞恢復(fù)表現(xiàn)出明顯延遲，到移植后100 d尚未恢復(fù)到移植前水平，與之對應(yīng)CD4+/CD8+比值到移植后21 d開始持續(xù)倒置。CD19+B細(xì)胞恢復(fù)速度較慢，在移植后100 d接近移植前水平。CD4+CD25+Treg細(xì)胞恢復(fù)最慢，到移植后100 d尚未達(dá)到移植前水平。淋巴細(xì)胞亞群變化趨勢見圖1。

圖1 患兒移植后外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)變化

2.3 non-aGVHD 組與aGVHD組淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)比較

移植后28 d 和60 d，aGVHD 組CD 16+D 56+NK細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)低于non-aGVHD 組；移植后60 d，aGVHD 組的CD4+CD25+Treg細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)低于non-aGVHD 組；移植后100 d，aGVHD 組CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)低于non-aGVHD 組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 aGVHD 組和non-aGVHD 組移植前后CD16+ CD56+ NK、CD3+T、CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)比較

表2 aGVHD 組和non-aGVHD 組移植前后CD8+ T、CD19+ B、CD4+CD25+ Treg細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)比較 （個/μL）

3 討論

隨著移植技術(shù)不斷改進(jìn)，非復(fù)發(fā)死亡率/移植相關(guān)死亡率不斷下降，allo-HSCT在兒科已成為治療復(fù)發(fā)難治性惡性血液病、先天性免疫缺陷/遺傳代謝性疾病的重要方法。雖然移植后中性粒細(xì)胞和血小板容易獲得成功植入，但是移植后免疫活性細(xì)胞的重建遲于造血重建，且過程復(fù)雜，受到受者年齡、干細(xì)胞來源、移植預(yù)處理方案等多重因素的影響[5]。移植后非特異性免疫細(xì)胞恢復(fù)最早，依次為單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞[6-7]，而特異性免疫細(xì)胞，包括T、B 淋巴細(xì)胞重建相對滯后，存在發(fā)生感染和腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。移植后的免疫重建是患兒長期生存的關(guān)鍵因素，因此對移植后患兒免疫細(xì)胞恢復(fù)的監(jiān)測十分必要。

NK細(xì)胞屬于機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，具有早期識別并清除病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的功能，同時也是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。本研究中NK細(xì)胞是兒童allo-HSCT后最早恢復(fù)的細(xì)胞，從移植后14 d開始恢復(fù)，21 d就可達(dá)到移植前水平。這可能與NK 細(xì)胞的發(fā)育成熟依賴骨髓微環(huán)境而不是胸腺有關(guān)[8]。NK細(xì)胞移植后早期恢復(fù)有利于鞏固移植物的植入，減少GVHD，并發(fā)揮移植物抗白血?。℅VL）作用[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，接受allo-HSCT的兒童患者中，移植32 d NK細(xì)胞數(shù)量＞120/μL的患兒有較高的3年無病生存率、較低的3年復(fù)發(fā)率和移植相關(guān)死亡率[10]。

本研究中，CD3+T細(xì)胞在移植后60 d左右基本可達(dá)到移植前水平，其中殺傷性T細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）恢復(fù)早，輔助性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）恢復(fù)則顯著延遲。而CD4+/CD8+T細(xì)胞比值倒置是T細(xì)胞重建的最早特征之一[11]。CD8+T細(xì)胞早期恢復(fù)有利于形成針對如EBV、CMV 等病毒的特異性免疫，減少移植后此類病毒的再激活。因此如果監(jiān)測到早期CD8+T細(xì)胞延遲恢復(fù)可能預(yù)示移植后感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)會大大增加。由于移植前后胸腺損傷，導(dǎo)致移植后很長一段時間CD4+T細(xì)胞持續(xù)缺乏，這種發(fā)生較晚的T細(xì)胞重建，由供者來源的淋巴祖細(xì)胞或造血干細(xì)胞在受者胸腺發(fā)育，經(jīng)歷免疫耐受誘導(dǎo)最終形成的T淋巴細(xì)胞不僅對受者自身組織耐受（發(fā)生GVHD 風(fēng)險(xiǎn)低），而且具有較強(qiáng)的GVL 效應(yīng)[12]，實(shí)現(xiàn)持久穩(wěn)定的細(xì)胞免疫重建，所以改善和促進(jìn)胸腺功能的恢復(fù)是加速T淋巴細(xì)胞重建的一個重要策略[13]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg細(xì)胞）的免疫抑制功能是免疫耐受機(jī)制中的重要組成部分，它能抑制各淋巴細(xì)胞亞群的增殖以及各種細(xì)胞因子的分泌，從而維系自身耐受和免疫應(yīng)答的平衡穩(wěn)態(tài)[14]。本研究中CD4+CD25+Treg細(xì)胞恢復(fù)相對較晚，可能與積極使用CD25單抗預(yù)防GVHD有關(guān)。

在成人，移植后B淋巴細(xì)胞的恢復(fù)較慢，直到移植后1～2年才會完全重建[15]。B細(xì)胞的延遲恢復(fù)影響抗體的產(chǎn)生，低水平的免疫球蛋白也是原發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)及并發(fā)其他腫瘤的重要因素。因此，移植后應(yīng)積極補(bǔ)充丙種球蛋白以減少體液免疫的不足，預(yù)防相關(guān)感染。本研究中B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量在移植后100 d恢復(fù)到移植前水平，比成人早，這一結(jié)論還需要后續(xù)更大的樣本量來證明。

aGVHD 是造血干細(xì)胞移植后在受者體內(nèi)植活的供者淋巴細(xì)胞對宿主器官發(fā)生的以免疫性損傷為主要特征的免疫性疾病，是造血干細(xì)胞移植后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。目前，aGVHD的診斷仍主要依賴臨床表現(xiàn)，在臨床上有時很難將皮膚和腸道aGVHD與藥物性皮疹、炎癥性腸病等臨床表現(xiàn)與aGVHD相似的疾病區(qū)分開，往往需要進(jìn)行有創(chuàng)性的病理活組織檢查以輔助診斷，因此，臨床上需要找到能夠早期診斷或者預(yù)示aGVHD 發(fā)生的指標(biāo)以便及時采取相應(yīng)的防治措施[16]。

本研究中，aGVHD 組NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)低于nonaGVHD組，且從移植后28 d開始兩組存在顯著差異，提示早期NK細(xì)胞延遲恢復(fù)可能與aGVHD發(fā)生密切相關(guān)。有學(xué)者監(jiān)測70例白血病患者在allo-HSCT后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，發(fā)現(xiàn)移植后30 d NK細(xì)胞與Ⅱ-Ⅳ度aGVHD 發(fā)生率和總生存率有關(guān)，低水平NK 細(xì)胞預(yù)示更高的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD發(fā)生率和更低的總生存率[17-18]。allo-HSCT過程中供者來源NK細(xì)胞與配體結(jié)合，在受者體內(nèi)異源性激活，活化信號占主導(dǎo)時，通過殺傷受者來源的抗原呈遞細(xì)胞阻斷aGVHD 關(guān)鍵性啟動環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮抗aGVHD作用[19-20]。

目前，對allo-HSCT后免疫重建的研究主要在成人病例，兒童比較少見，特別是國內(nèi)甚少報(bào)道。本研究42例兒童allo-HSCT后淋巴細(xì)胞重建順序依次為CD16+CD56+NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞。其中NK細(xì)胞重建與aGVHD的發(fā)生密切相關(guān)，移植后動態(tài)監(jiān)測NK細(xì)胞可作為早期診斷或者預(yù)示aGVHD發(fā)生的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。對于進(jìn)一步細(xì)化NK細(xì)胞預(yù)測aGVHD發(fā)生的閾值，早期監(jiān)測到NK細(xì)胞低下的患兒；提升NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性，是否能有效預(yù)防aGVHD 尚需要進(jìn)一步開展多中心大樣本的臨床研究。