以蛋白質(zhì)衣殼為載體的納米反應器研究進展

秦 鈺

（天津大學 藥物科學與技術學院，天津 300072）

在自然界中，蛋白質(zhì)憑著它結(jié)構(gòu)上的多樣性以及由此帶來的在功能上的多樣性，從而成為最基本的生物大分子而出現(xiàn)在各種重要的生命過程中。其中，蛋白質(zhì)衣殼是由蛋白質(zhì)亞基自組裝形成的一種超分子納米籠，具有分布廣、種類多、可再生、單分散、結(jié)構(gòu)高度有序、易制備等特點，并且可以封裝各種類型的納米顆粒。常見的蛋白質(zhì)衣殼包括病毒樣顆粒（Virus-like Particles,VLPs）、細菌中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)衣殼或者通過計算技術設計的蛋白質(zhì)衣殼。在藥物遞送、生物影像標記、免疫學和限域納米催化劑的開發(fā)上具有較大的應用潛力，尤其是限域納米催化劑方面的應用，近年來備受人們的關注[1]。

納米反應器是一種可以將反應限制于納米空間范圍內(nèi)的容器。相對于在本體溶液中發(fā)生反應，限制于特定空間的反應能夠更好地模擬自然界的方式，從而帶來更多的啟發(fā)與理解[2]。其中，限域納米催化劑就是將催化劑裝載于納米載體中，這是最直接與常見的制造納米反應器的方式。由于空間的限制，所裝載的催化劑在大小與種類上要滿足相應的條件是不容易的，而自然界中常用于生物催化的酶（絕大多數(shù)為蛋白質(zhì)）顯然最適合作為限域納米催化劑中的催化劑。

1 包囊在酶活性調(diào)節(jié)中的作用

封裝酶時，有幾個可能會影響酶活性的因素。第一，酶蛋白與衣殼間的相互作用可能會影響其活性位點的構(gòu)型，從而使酶的內(nèi)在動力學參數(shù)改變。第二，衣殼上有限的通道會影響底物擴散進入活性位點以及產(chǎn)物釋放到本體溶液的過程。第三，將連續(xù)反應中出現(xiàn)的多種酶封裝于同一載體中，有助于將中間體捕獲進而進入下一反應階段，特別是在本體溶液中底物濃度低的情況下，這種方法將會提高反應物轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物的效率。

總之，封裝在酶活性調(diào)節(jié)中的作用可能非常復雜。每種情況可能會遇到不同的機制，或者是多種機制共同作用而產(chǎn)生的影響，最終效果會不一樣。

2 自然界中的納米反應器

大自然選擇分區(qū)[3]來減少副產(chǎn)物的形成并提高反應速率。通過構(gòu)建工程化的納米反應器，可以通過研究其產(chǎn)品的獨特特性及其對反應動力學的影響來幫助我們更好地了解自然界的創(chuàng)造[4]。在不同的納米顆粒之間，使用單分散的蛋白質(zhì)衣殼可以幫助研究研究密閉空間中酶促反應[5]。

據(jù)報道，Encapsulin蛋白存在于許多細菌和古細菌基因組中，大多組裝成T=1（60個亞基，20-24nm）或者 T=3（180 個亞基，30～32nm）的二十面體空心衣殼[6,7]，其封裝肽標簽的發(fā)現(xiàn)[8]非常有趣。Encapsulin殼蛋白所裝載的蛋白是通過觀察其高分辨率結(jié)構(gòu)所發(fā)現(xiàn)的，通過T.maritima encapsulin的晶體結(jié)構(gòu)初步了解其封裝機理。在晶體結(jié)構(gòu)中研究者發(fā)現(xiàn)大約有10個氨基酸總是出現(xiàn)在囊蛋白殼的內(nèi)部，這10個左右的氨基酸對應于裝載蛋白的短C-末端序列。生物信息學分析證明這段C末端序列在其他物種的Encapsulin中也得到保留，并且在推斷的操縱子中編碼貨源蛋白與Encapsulin蛋白的基因是相鄰的，于是人們將這段重復出現(xiàn)的序列所編碼的蛋白稱為貨物裝載肽（CLP,cargo loading peptide）。將CLP從貨源蛋白中除去會使得貨源蛋白無法再被Encapsulin蛋白封裝，但是如果把CLP融合在原本不被Encapsulin蛋白封裝的綠色熒光蛋白的C末端上，便足以使得綠色熒光蛋白被封裝，于是人們認為CLP對于貨源蛋白封裝于Encapsulin蛋白中是充分必要的。發(fā)現(xiàn)CLP后，鑒定不同的貨源蛋白家族取得了更多進展。Encapsulin蛋白的大部分貨物都是酶，它們在微生物中關鍵的細胞過程中起著重要作用，而將這些蛋白封裝于Encapsulin蛋白中，不僅可以提升貨源蛋白的穩(wěn)定性以及在發(fā)揮貨源蛋白功能的環(huán)境中提高其半衰期，還能夠隔絕毒性反應。

另一個著名的天然納米反應器是細菌微區(qū)室（BMC,bacterial microcompartments）[9]，是一種自組裝的細胞器，這些細菌微區(qū)室的共同結(jié)構(gòu)特點是位于微區(qū)室中心的酶被一種選擇性通透的蛋白質(zhì)外殼包裹。這種微區(qū)室的作用在于可以限制氣體底物，保護細胞免受毒性中間體的侵害并防止副反應的產(chǎn)生。細菌微區(qū)室在60年前第一次被觀測到，但主要是在近幾年才取得更多的研究進展，這些進展中包括理解其代謝多樣性、自組裝的結(jié)構(gòu)基礎以及功能作用，對于促進對細菌代謝的理解及開始將BMC應用于合成生物學起到了極大的推動作用。在所研究的BMC中，特別突出的就是羧酶體（carboxysome），該細胞器對于理解微區(qū)室蛋白外殼如何組裝，以及它如何讓一些化合物通過同時阻擋其他的化合物進入蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)有著重要的意義。羧酶體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為對稱性的多面體殼結(jié)構(gòu)，其蛋白質(zhì)外殼具有選擇性讓分子通過的通透屏障，可以防止CO2的損失。羧酶體的內(nèi)部包含碳酸酐酶（CA）以及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO），碳酸酐酶是催化碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化為CO2（反之亦然）的酶，羧酶體外殼讓碳酸氫鹽透過，包裹于其中的碳酸酐酶催化碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化為CO2，CO2氣體不僅會被羧酶體蛋白外殼限制，并且會被RuBisCO固定下來，該酶是通過催化1,5-二磷酸核酮糖與CO2的羧化反應或與O2的氧化反應來固定住CO2的。RuBisCO分子量約為53kD，由8個大亞基和8個小亞基組成，它在卡爾文循環(huán)里催化第一個主要的碳固定反應。同時將碳酸酐酶與RuBisCO包裹在蛋白質(zhì)外殼中，形成了天然的納米反應。更好地認識與理解該天然納米反應器的結(jié)構(gòu)與功能，有助于開展改善碳固定——更廣泛地說是生物能源的研究，也為研究者們開發(fā)利用這個天然的反應器來達成其他特定效果的人工納米反應器開辟了新的道路。

3 封裝酶的工程化系統(tǒng)

研究者越來越多地使用病毒蛋白外殼，細菌蛋白外殼或通過計算技術發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)衣殼來創(chuàng)建工程化的納米反應器[10-12]。

豇豆褪綠斑駁病毒（CCMV）蛋白質(zhì)衣殼在自然條件下攜帶的RNA大小為28nm，如今通過已建立起來的方法而較好地應用于封裝各種客體酶蛋白。CCMV衣殼因其在pH值為7.5的條件下分解為90個二聚體，但在pH值為5.0時可重新形成衣殼，而用于封裝辣根過氧化物酶（HRP），由HRP以及CCMV蛋白衣殼組成的新型納米反應器，經(jīng)過酶活性的研究測試表明酶活性依舊存在，說明CCMV蛋白質(zhì)衣殼對于底物與產(chǎn)物都是可滲透的[2]。Minten等[13]將帶正電荷的異二聚體卷曲螺旋蛋白附著在衣殼蛋白上，在非共價作用下將貨源蛋白包封于CCMV蛋白衣殼內(nèi)，這種方法的開發(fā)使得CCMV衣殼包封多種蛋白成為可能。Minten等[2]人使用CCMV衣殼包封了被稱作Pseudozyma脂酶B（PalB,Pseudozyma lipase B）的多種功能酶，該實驗表明，封裝的PalB比未封裝的PalB更有效地轉(zhuǎn)換了底物，并顯示了在衣殼的受限空間中進行級聯(lián)反應的潛力。

噬菌體MS2衣殼是二十面體球，由180個相同蛋白質(zhì)單體組成，平均直徑為27nm。在自然條件中噬菌體MS2衣殼是病毒遺傳信息RNA的載體。該蛋白質(zhì)衣殼的單體可以獨立表達，并且可以通過簡單的方法可以去除大腸桿菌中原本裝載的RNA而自組裝成病毒狀的空衣殼[14]?；瘜W修飾的MS2衣殼內(nèi)表面可與想裝載的酶通過共價結(jié)合而行成新的納米反應器系統(tǒng)，最終形成了靛藍生物合成途徑[15]。與體外游離酶相比，體內(nèi)靛藍產(chǎn)量增加且貨物酶的長期穩(wěn)定性增強[15]。

噬菌體Qβ與MS2類似，也是二十面體病毒樣顆粒（VLPs,virus-like particles），由稱為外殼蛋白（CP,coat protein）的 180個亞基組成[16]。Fiedler等[16]利用在RNA基因組中發(fā)現(xiàn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與CP的內(nèi)部殘基之間的高親和力相互作用特性，將與發(fā)夾結(jié)構(gòu)融合的不同酶靶向到Qβ衣殼上，從而提供一種簡單的方法將想要的貨源酶裝載于Qβ衣殼中，以更好地利用不穩(wěn)定的或難以純化的酶。其中裝載成功的肽酶E（PepE,peptidase E）和熒光素酶（@（RevLuc）4）在游離與裝載狀態(tài)下的酶活性被測量出來而歸納于下面的表格（表1）中。

噬菌體P22通過控制自組裝的進程來封裝活性氫和耐氧[NiFe]-氫化酶而被設計成制氫工廠[17]。通過對具有紅外光譜特征的新型生物反應器進行表征并測量其催化活性，發(fā)現(xiàn)封裝的氫化酶的活性比純化的游離酶高近100倍，并且P22衣殼避免其貨物因加熱和被蛋白酶水解而帶來的影響[17]。

存在于許多生命中的鐵蛋白也是蛋白質(zhì)衣殼，被生命體用于貯存鐵，并且通常比用于封裝蛋白質(zhì)的其他蛋白質(zhì)容器小，例如P22，CCMV和工程化的核黃素合酶變體。鐵蛋白的外徑為12nm，內(nèi)徑為8nm。鐵蛋白已被用于包裹金屬離子或酶來產(chǎn)生不同的納米反應器[18，19]。Stephan Tetter和 Donald Hilvert[20]使用內(nèi)部帶負電的古細菌古球菌（AfFtn）的工程鐵蛋白來包封3種不同的酶，與帶正電的綠色熒光蛋白融合的不同種類的酶。他們通過比較這些酶裝載前后的活性，證明衣殼能夠保持酶的催化活性，并防止裝載酶被蛋白酶水解以及避免加熱帶來的影響[20]。

對于這些工程系統(tǒng)，裝載前后的酶活性已歸納于下表中（表1）。由此可以看出，不同衣殼對于酶的影響不一樣，或是使酶活性降低，或是保持不變，但使酶活性升高的衣殼較少出現(xiàn)。

表1 不同蛋白質(zhì)衣殼對貨源酶活性的影響Tab.1 Influence of different capsids to their cargo enzyme activity

4 結(jié)論與展望

以表1中Qβ蛋白外殼裝載肽酶E和熒光素酶的系統(tǒng)為例，比較裝載前后酶活性的數(shù)據(jù)來計算得到的結(jié)果進行分析，裝載肽酶（PepE）的Km相比游離酶來說略微上升，而kcat的值變?yōu)橛坞x酶的一半左右，于是kcat與Km的比值也下降了一倍多，由此可見，裝載的肽酶的酶活性是降低的，這可能是由于酶蛋白和發(fā)夾結(jié)構(gòu)融合后對該酶內(nèi)在動力學參數(shù)有影響，使其催化效率降低。而裝載的熒光素酶的情況與上者有相似又有些不同，它們相似的地方在于裝載的熒光素酶的kcat的值也變?yōu)橛坞x酶的一半左右，不同在于裝載的熒光素酶的Km值竟然達到了游離酶的18倍左右，由此推測，熒光素酶裝載后，蛋白質(zhì)外殼會成為反應底物擴散進入被裝載酶活性位點的阻礙，或許是熒光素酶的反應底物相比肽酶的反應底物來說更難以進入Qβ衣殼之中，而相似的kcat值上的改變，說明與酶蛋白融合的發(fā)夾結(jié)構(gòu)也會影響熒光素酶的酶活性，降低其催化效率，或許這是由于該結(jié)構(gòu)普遍存在的對酶蛋白的影響。這些推測仍然需要被驗證，但可以得到的較為確定的結(jié)論是，同一個蛋白質(zhì)外殼對不同酶存在的影響是不同的，而這其中影響酶活性的原因存在多種可能性，是一個復雜的過程，或許深入研究一種有潛力的蛋白質(zhì)外殼，掌握其影響酶活性的機理，對于更好地利用該種載體在更多的場景下的包載具有很大幫助。

總結(jié)來說，蛋白質(zhì)衣殼對于貨運酶的影響是由復雜的機理控制，具體情況仍然需具體分析；而將酶裝載于不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)衣殼中，對于將酶投入工程化使用、改變酶本身的性質(zhì)等都是很有潛力的研究。