病毒-納米金雜合導電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在電化學分析的應(yīng)用

梁曉聲，郭永超，門冬，4，張先恩

（1 中南民族大學生命科學學院，湖北 武漢 430074；2 中國科學院武漢病毒研究所，生物安全大科學研究中心，病毒學國家重點實驗室，湖北 武漢 430071；3 中國科學院生物物理研究所，生物大分子科教融合卓越中心，生物大分子國家重點實驗室，北京 100101；4 中國科學院大學，北京 100049）

基于酶的電流型電化學傳感器目前已廣泛用于生物過程控制及醫(yī)療診斷等領(lǐng)域，近年來相關(guān)行業(yè)對生化過程小分子化合物提出了越來越高的痕量檢測要求。目前，利用納米導電材料（如碳納米管［1］）修飾電極，電子介體修飾電極［2-3］以及直接酶-電極電子傳遞［4-5］等方式均可構(gòu)建靈敏的酶電極，從而實現(xiàn)多種小分子化合物的檢測。

噬菌體展示是一種利用噬菌體研究蛋白/小肽與生物分子相互作用的技術(shù)［6］。噬菌體在衣殼蛋白展示功能肽/蛋白的同時，其基因組內(nèi)包含展示功能肽/蛋白的編碼信息［7-8］。通過這種關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)了基因型和表型在單個病毒顆粒內(nèi)的直接聯(lián)系，從而可以構(gòu)建肽文庫，進行體外生物分子相互作用的篩選及優(yōu)選靶標的放大［9-10］。近年來，這種利用噬菌體相互作用的篩選方式擴展到了材料領(lǐng)域［10-12］，通過噬菌體在材料表面結(jié)合，進而從肽文庫中篩選出材料親和肽，利用親和肽控制材料沉積成核反應(yīng)，從而控制材料的單分散性及形貌的方法得到了充分的發(fā)展。材料親和肽的引入，可以在溫和的仿生條件下進行材料的合成。利用噬菌體展示親和肽的一個成功范例是基于病毒模板制備過渡金屬半導體納米線，該納米線體現(xiàn)出了晶格合成的精密控制、制備條件溫和、生物相容性好等優(yōu)勢［13］。

病毒顆粒或病毒樣顆粒表面改造作為合成生物學的一個重要分支在很多方面取得了積極的進展，絲狀噬菌體、煙草花葉病毒、猴空泡病毒SV40、腸道病毒EV71、口蹄疫病毒、登革熱病毒、豇豆花葉病毒等病毒樣顆粒均作為模板廣泛用于無機功能材料的可控礦化［14-16］，其中以絲狀病毒的噬菌體應(yīng)用最為廣泛［17］。通過噬菌體展示篩選材料結(jié)合肽目前已有較多研究，迄今為止，通過M13 噬菌體gP8 蛋白展示發(fā)現(xiàn)了金、鉑、四氧化三鈷、硫化鋅、聚苯乙烯、噻蟲嗪等材料的結(jié) 合 肽［11-13，18-20］。噬 菌 體 展 示 結(jié) 合 肽 應(yīng) 用 以Belchler 等［12］通過噬菌體展示鉑、四氧化三鈷結(jié)合肽作為鋰離子電池電極材料顯著提高了電池電容量等工作堪稱經(jīng)典。上述研究成功將基于噬菌體展示的蛋白-蛋白相互作用拓展到了蛋白-材料、肽-材料甚至肽-有機小分子的相互作用篩選，提供了一套全新的生物親和材料和生物復合材料的篩選和可控制備方案。然而，基于噬菌體gP8 蛋白展示得到的多為短肽，單個短肽親和力不足限制了其在分析檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用?；谑删w展示材料新結(jié)合肽篩選的研究報道較多，然而各種材料結(jié)合肽的應(yīng)用及其先進性的研究還有待進一步發(fā)展。

本文作者提出了一種通過合成生物學方法對噬菌體進行基因改造，以此構(gòu)建一種高靈敏酶電極平臺的通用方法。首先，通過基因工程手段在噬菌體主要衣殼蛋白上表達金結(jié)合肽。表達了金結(jié)合肽的基因改造噬菌體作為模板使得金更為均質(zhì)地在噬菌體表面發(fā)生沉積，從而形成導電三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（圖1）。為了證實基因改造噬菌體導電材料有利于酶-電極間電子傳遞，本研究將該材料與辣根過氧化物酶共修飾于玻碳電極表面進行過氧化氫檢測，相同底物濃度下顯示出比納米金等納米材料修飾電極高數(shù)倍的信號響應(yīng)。這些結(jié)果表明，納米金-噬菌體復合物構(gòu)建的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的酶-電極間電子傳遞性能，其電極增強效果可在其他酶電極推廣并應(yīng)用?；谫F金屬及碳納米材料修飾電極改善電極性能已有較多報道，然而沉積貴金屬的基因改造噬菌體修飾電極改善了酶-電極間電子傳遞尚未見報道，其獨特的結(jié)構(gòu)特點及生物兼容性在酶電極構(gòu)建方面具有較大優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

圖1 HRP/納米金-噬菌體復合物制備Fig.1 Schematic diagram for developing the enzyme-phage-gold complex

1 材料和方法

1.1 材料

噬菌體M13KE 及宿主大腸桿菌E coliER2738購自New England Biolabs 公司；PrimeSTAR Max DNA 聚 合 酶、DNA Marker、限 制 性DNA 內(nèi) 切 酶購自Takara 公司；胰蛋白胨、酵母粉等購自O(shè)xoid公司；牛血清白蛋白（BSA）及瓊脂粉購自BioFroxx 公司；瓊脂糖購自Gene 公司；質(zhì)粒小提試劑盒，DNA純化回收試劑盒等購自O(shè)mega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷（X-gal），殼聚糖及銀增強試劑購自Sigma 公司；辣根過氧化物酶（HRP）購自武漢天源生物科技有限公司，納米金溶膠（10 nm直徑）購自BBI公司；硼氫化鈉、四氯合金酸、30%雙氧水 溶 液、K3［Fe（CN）6］、K4［Fe（CN）6］、KCl、K2HPO4及KH2PO4購自國藥集團；玻碳電極、Ag/AgCl參比電極及鉑電極購自辰華儀器有限公司；其余藥品均為分析純以上級別，實驗用水為Milli Q純水系統(tǒng)制備超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

2YT 培養(yǎng)基：16 g 胰蛋白胨，10 g 酵母浸粉，5 g氯化鈉溶解調(diào)pH至7.0并定容至1 L（固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)添加2%瓊脂粉，半固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)添加1%瓊脂粉）121 ℃滅菌后使用。

實驗所用引物見表1。

表1 構(gòu)建基因改造噬菌體所用引物Tab.1 Primers for constructing of recombinant phage

1.2 噬菌體M13 衣殼蛋白gP8 的基因工程改造

2YT 固體培養(yǎng)基傾倒較薄固體平板，超凈臺內(nèi)冷卻固化。取適當稀釋的噬菌體M13KE 溶液1 μL，加 入200 μL 生 長 至 早 對 數(shù) 期 的 宿 主 菌ER2738 中，孵育1 min。將上述菌液-噬菌體混合物加入5 mL 2YT 半固培養(yǎng)基的無菌管內(nèi)混勻（半固培養(yǎng)基先預冷至不燙手）。含有菌液-噬菌體的半固培養(yǎng)基倒入預鋪固體培養(yǎng)基的平板內(nèi)，流淌均勻，超凈臺內(nèi)冷卻固化，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，觀察噬菌斑。挑取噬菌斑至2YT 液體培養(yǎng)基中于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，取2 mL 菌液提取質(zhì)粒，即為M13KE 噬菌體基因組DNA 雙鏈狀態(tài)。噬菌體改造首先通過引物6264mS和引物6264dn以M3KE為模板進行PCR 片段擴增，使用Hind Ⅲ和BglⅡ分別對PCR 擴增產(chǎn)物及M3KE 載體雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物后連接載體和片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ER2738，轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌涂布于含40 μg/mL X-gal、24 μg/mL IPTG 的2YT 固體平板上，篩選白色菌落，轉(zhuǎn)接提取質(zhì)粒，使用PstⅠ和BglⅡ?qū)蚋脑觳《净蚪M進行雙酶切，出現(xiàn)一個條帶為陽性克隆，陽性克隆送測序驗證，即可得6264 處突變消除了PstⅠ酶切位點的病毒定點突變株。接著通過重疊延伸PCR 將1372 位點處T突變?yōu)锳，以在該位置產(chǎn)生新的PstⅠ酶切位點，將1381 位點處C 突變?yōu)镚 以產(chǎn)生BamHⅠ酶切位點。上述兩個突變使用1381up、1381S、1381A 及1381dn 4 條引物進行一次重疊延伸PCR 完成。重疊延伸PCR 產(chǎn)物及消除了PstⅠ酶切位點的病毒定點突變株基因組分別用SnabⅠ和PacⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ER2738，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂布于無抗性2YT 固體平板上，挑取菌落，轉(zhuǎn)接提取質(zhì)粒，使用PstⅠ和PacⅠ，BamHⅠ和PacⅠ分別對同一提取病毒基因組進行雙酶切，兩次雙酶切均為兩條帶為酶切陽性克隆，陽性克隆送測序驗證，得到定點突變后于1372及1381位點附近產(chǎn)生了PstⅠ和BamHⅠ雙酶切位點的噬菌體。PstⅠ和BamHⅠ雙酶切位點定點突變的噬菌體基因組使用PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收，引物GbS和GbA 直接混合退火作為片段與酶切后的基因組連接，轉(zhuǎn)化2YT固體平板上，篩選菌落，轉(zhuǎn)接提取質(zhì)粒，使用PstⅠ和PacⅠ，BamHⅠ和PacⅠ分別對同一提取病毒基因組進行雙酶切，PstⅠ和PacⅠ酶切為兩條帶同時BamHⅠ和PacⅠ酶切為一條帶的克隆為陽性克隆，測序驗證即得到金結(jié)合肽（VSGSSPDS）［20］克隆進入噬菌體衣殼蛋白gP8的N 端的基因改造噬菌體?；蚋脑斓膅P8衣殼蛋白含有金結(jié)合肽的噬菌體命名為基因改造噬菌體（GM M13），后續(xù)作為金沉積支架使用。

為了獲得高達1012PFU/mL 濃度的基因改造噬菌體，適量的噬菌體GM M13 感染大腸桿菌宿主菌ER2738，加入四環(huán)素至終濃度為100 μg/mL，37 ℃，250 r/min搖床振蕩過夜。培養(yǎng)物10 000g離心10 min，移取上清，上清加入1/6 體積的PEG/NaCl 溶液并于4 ℃靜置1 h，混合物4 ℃10 000g離心15 min。沉淀用適當無菌水重懸，使用前述方法測定噬菌斑形成單位（PFU）。

1.3 基因改造噬菌體金結(jié)合能力的評估

96 孔微孔板加入100 μL 1011PFU/mL 基因改造噬菌體及野生型噬菌體M13，100 μL 5%BSA 溶液作為陰性對照加入微孔板，4 ℃孵育過夜。傾倒溶液后加入300 μL 含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液，37 ℃孵育2 h，每孔加入150 μL 納米金溶膠37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每孔加入100 μL 銀增強溶液顯色至適當程度于490 nm檢測吸光度值。

1.4 HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖和HRP/納米金顆粒/殼聚糖的制備

取1～10 μL HAuCl4分別加入200 μL 1012PFU/mL基因改造噬菌體中，加入20 μL 甘氨酸-HCl 溶液（pH 2，200 mmol/L） 孵 育30 min， 加 入1 μL 0.5 mol/L NaBH4溶液（溶解于0.1 mol/L NaOH）。產(chǎn)物4000g離心2 min， 沉淀用50 μL 含2%乙酸、1%殼聚糖和3～5 mg/mL HRP 溶液重懸。對照樣品用納米金顆粒制備，步驟如下：取3.2 mL 10 nm納米金顆粒16 000g離心10 min，棄上清，沉淀用50 μL 含2%乙酸、1%殼聚糖和3 mg/mL HRP 溶液重懸。

1.5 基因改造噬菌體金沉積產(chǎn)物的表征

1.5.1 原子力顯微

取10 μL HRP/Au-基因改造噬菌體/殼聚糖復合物滴加到新鮮解理的云母片表面并于空氣中自然干燥。滴加了樣品的干燥云母片用100 μL 超純水洗滌并再次干燥，重復該步驟2 次。使用PicoScan 5 AC 模式進行原子力顯微掃描（Molecular Imaging Corp.，San Diego，CA，United States of America）。使用S1-75 型低頻率硅基懸臂梁于70 kHz 頻率進行非接觸式掃描，掃描使用AC模式。圖像經(jīng)SPIP軟件進行平滑處理。

1.5.2 TEM

樣品滴于parafilm 疏水封口膜上用鑷子夾取覆碳膜銅網(wǎng)于液滴上飄浮10 min，夾取銅網(wǎng)，使用切角濾紙邊緣小心吸去多余液體，銅網(wǎng)放置自然干燥過夜，使用日立H7000 型透射電子顯微鏡觀察吸附樣本的銅網(wǎng)。

1.5.3 ICP-OES

分別取5 μL HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖及5 μL HRP/納米金/殼聚糖溶解于200 μL 王水，超純水洗滌至總體積為5 mL（1000倍稀釋）。兩樣品分別使用ICP-OES Varian700 光譜儀測定波長208.207 nm 和242.794 nm 處吸收，外標為10 μmol/L HAuCl4溶液。

1.6 電極修飾及電化學測定

玻碳電極（3 mm直徑）分別用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm α-氧化鋁漿拋光，拋光完成后分別用超純水清洗干凈。拋光好的電極在超純水、無水乙醇、丙酮及超純水中分別超聲5 min。再將電極浸泡于30%硝酸溶液中以徹底清潔電極表面，電極取出用超純水清洗后再用高純氮氣吹干。再將電極置于0.1 mol/L H2SO4中進行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍?1～1 V，重復掃描直至獲得可重復的曲線，電極用超純水再次洗滌并用高純氮吹干，然后滴涂5 μL HRP/Au-基因改造噬菌體/殼聚糖復合物于電極表面。修飾后的電極于4 ℃放置24 h 自然晾干。對照修飾電極修飾溶液換為5 μL HRP/納米金/殼聚糖復合物，其余操作步驟與實驗電極相同。

電化學交流阻抗譜測試用于電極的電化學表征，表征使用BAS-Zahner IM6e 型電化學工作站（Zahner-Elektrik， Kronach， Germany）于三電極系統(tǒng)中進行。玻碳電極及修飾的玻碳電極（3 mm直徑）作為工作電極，Ag/AgCl 電極作為參比電極，鉑電極作為對電極。交流阻抗測試于含0.1 mol/L KCl 及1 mmol/L K4［Fe（CN）6］/K3［Fe（CN）6］（1∶1）的10 mmol/L、pH 7.0 的PBS 溶液中進行，K4［Fe（CN）6］/K3［Fe（CN）6］在溶液中做為氧化還原探針。于開路電位0.2 V 進行交流阻抗掃描，掃描頻率100 kHz 到0.1 Hz，偏振電壓為5 mV，數(shù)據(jù)采集設(shè)定每10 倍頻率范圍內(nèi)測試5 個點。循環(huán)伏安法測試使用三電極系統(tǒng)于不攪拌的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中進行，掃描速率20 mV/s 掃描范圍為?0.3～0.6 V。電化學測定前溶液先充分通氬氣以排出溶解氧。

2 結(jié)果與討論

2.1 展示金結(jié)合肽噬菌體M13 的構(gòu)建

按1.2 節(jié)的方法構(gòu)建展示金結(jié)合肽噬菌體M13KE 基因組，構(gòu)建過程中將病毒基因組6264 處插入堿基G 消除原有的PstⅠ酶切位點，1372 位點處T 突變?yōu)锳 產(chǎn)生新的PstⅠ酶切位點，1381 位點處C 突變?yōu)镚 產(chǎn)生新的BamHⅠ酶切位點，再通過PstⅠ和BamHⅠ酶切位點插入金結(jié)合肽序列，為了便于鑒定，金結(jié)合肽插入時通過插入段堿基的改變消除了BamHⅠ酶切位點。各步驟均進行了雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示。病毒基因組6264處插入堿基G 消除原有的PstI 酶切位點后，使用PstⅠ和BglⅡ?qū)?264 處進行移碼突變的病毒基因組進行雙酶切，PstⅠ通過點突變消除后的基因組雙酶切僅能產(chǎn)生1條線性化條帶。病毒基因組1372及1381位點處突變后，產(chǎn)生了新的PstⅠ和BamHⅠ酶切位點，使用PacⅠ和上述兩個新產(chǎn)生的酶切位點的內(nèi)切酶對突變后的基因組進行雙酶切，病毒基因組被切割為兩個片段，其中小片段分別為2764 bp 和2755 bp。插入金結(jié)合肽序列后消除了BamHⅠ酶切位點，此時再繼續(xù)使用PstⅠ、PacⅠ和BamHⅠ、PacⅠ分別對基因組進行雙酶切，PstⅠ和PacⅠ可將基因組切割為2個條帶而BamHⅠ和PacⅠ僅能將基因組線性化為1個條帶。插入了金結(jié)合肽序列的病毒基因組使用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ER2738，在宿主菌中擴增后組裝出gP8 展示金結(jié)合肽的重組病毒。因本實驗為主要衣殼蛋白從基因組水平上的修改，如酶切及測序正確并且轉(zhuǎn)化病毒基因組后能觀察到病毒噬菌斑，則能證明修改后的衣殼蛋白在病毒上發(fā)生了表達并成功組裝出病毒顆粒。

圖2 展示金結(jié)合肽噬菌體的構(gòu)建與鑒定M為takara DL15000 DNA ladder，（a）1泳道為使用PstⅠ和BglⅡ?qū)?264處移碼突變的病毒基因組進行雙酶切；（b）1泳道為使用PstⅠ和PacⅠ，2泳道為使用BamHⅠ和PacⅠ分別對1372及1381處突變的病毒基因組進行雙酶切；（c）1泳道為使用PstⅠ和PacⅠ對gp8基因插入了金結(jié)合肽序列的病毒基因組進行雙酶切，2泳道為使用BamHⅠ和PacⅠ對gp8基因插入了金結(jié)合肽序列的病毒基因組進行雙酶切Fig.2 Construction of gold-binding peptide displaying phage and its verificationM—Takara DL15000 DNA ladder.Lane(a)1—Site 6264 mutated phage genome digested by PstⅠand BglⅡ.Lane(b)1—Sites 1372 and 1381 mutated phage genome digested by PstⅠand PacⅠ;2—Sites 1372 and 1381 mutated phage genome digested by BamHⅠand PacⅠ.Lane(c)1—Gold-binding peptide sequence inserted phage genome digested by PstⅠand PacⅠ;2—Gold-binding peptide sequence inserted phage genome digested by BamHⅠand PacⅠ

2.2 基因改造噬菌體金結(jié)合能力的評估

通過將金結(jié)合肽序列VSGSSPDS 克隆至噬菌體M13基因組的gP8衣殼蛋白N端，獲得了具有金結(jié)合能力的噬菌體。利用銀增強噬菌體ELISA 確認噬菌體組裝體上有金結(jié)合肽并且有金結(jié)合功能。金納米顆粒結(jié)合到噬菌體表面經(jīng)銀增強反應(yīng)進行信號放大后，于490 nm 波長進行定量，結(jié)果（圖3）表明，基因改造噬菌體的金結(jié)合能力顯著高于野生型噬菌體，并且其吸光度與噬菌體滴度呈正比關(guān)系。

圖3 銀增強噬菌體ELISA實驗結(jié)果（1010 GM M13 and 109 GM M13指滴度為1010 PFU/mL及109 PFU/mL基因改造的噬菌體M13；1010 Wild type M13 and 109 Wild type M13指滴度為1010 PFU/mL及109 PFU/mL野生型M13；陰性對照為未加噬菌體直接脫脂奶粉封阻后結(jié)合納米金再進行銀增強）Fig.3 Evaluation of gold-binding ability for GM M13 with silver enhancement(1010 GM M13 and 109 GM M13 refer to the genetically modified M13 with the titer of 1010 PFU and 109 PFU,respectively,and the silver enhancement GM M13 without gold nanoparticles is used as the control.)

2.3 金結(jié)合噬菌體的表征

金-噬菌體復合物通過硼氫化鈉還原金離子并沉積到基因改造噬菌體表面。通過AFM 和TEM 對該復合物進行了表征。金-噬菌體復合物外觀呈紫紅色。盡管金結(jié)合肽已經(jīng)通過基工程的手段展示在噬菌體主要衣殼蛋白的每一個拷貝上，AFM 表明，當硼氫化鈉于溫和條件下還原金離子時，復合物線狀結(jié)構(gòu)上仍然存在部分不連續(xù)區(qū)域，與此同時，病毒模板之外也有少量金納米顆粒形成［圖4（a）］，這可能是因為在噬菌體處理及金沉積的過程中少量噬菌體發(fā)生了解體，其上的衣殼蛋白游離于噬菌體周圍并與金離子結(jié)合繼而發(fā)生還原。當金離子還原的過程中HAuCl4增加以后，還原復合物上不連續(xù)的區(qū)域消失［圖4（b）］，納米線之間發(fā)生了沉積物的聯(lián)結(jié)，形成了三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨著還原過程中金離子濃度的進一步增加，AFM表征顯示，產(chǎn)生了更多的聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)，并且產(chǎn)生了具有放射狀結(jié)構(gòu)的超級“結(jié)”狀結(jié)構(gòu)［圖4（c）］。同時，TEM 結(jié)果顯示，連續(xù)的噬菌體表面金沉積形成均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此外，還觀察到金包被噬菌體的更多細節(jié)：沉積于噬菌體表面的金呈現(xiàn)納米尺度的微點狀，形狀不規(guī)則，表面較粗糙［圖4（d）］。

圖4 不同反應(yīng)條件下納米金-噬菌體復合物的AFM及TEM圖（a）0.25 mmol/L HAuCl4、1012 PFU/mL基因改造噬菌體、20 mmol/L Gly-Cl?及2.5 mmol/L NaBH4沉積條件下，AFM掃描圖；（b）0.375 mmol/L HAuCl4、1012 PFU/mL基因改造噬菌體、20 mmol/L Gly-Cl?及2.5 mmol/L NaBH4沉積條件下，AFM掃描圖；（c）0.5 mmol/L HAuCl4、1012 PFU/mL基因改造噬菌體、20 mmol/L Gly-Cl?及2.5 mmol/L NaBH4沉積條件下，AFM掃描圖；（d）納米金-噬菌體復合物TEM顯微成像圖，復合物形成條件：0.5 mmol/L HAuCl4、1012 PFU/mL基因改造噬菌體、20 mmol/L Gly-Cl?及2.5 mmol/L NaBH4 Fig.4 AFM and TEM images for the Au-GM M13 complex formed under different reaction conditions(a)AFM images for 0.25 mmol/L HAuCl4,1012 PFU/mL GM M13,20 mmol/L Gly-Cl-and 2.5 mmol/L NaBH4;(b)AFM images for 0.375 mmol/L HAuCl4,1012 PFU/mL GM M13,20 mmol/L Gly-Cl-and 2.5 mmol/L NaBH4;(c)AFM images for 0.5 mmol/L HAuCl4,1012 PFU/mL GM M13,20 mmol/L Gly-Cl-and 2.5 mmol/L NaBH4;(d)TEM image for the Au-GM M13 complex.Complex forming conditions:0.5 mmol/L HAuCl4,1012 PFU/mL GM M13,20 mmol/L Gly-Cl-and 2.5 mmol/L NaBH4

2.4 HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極的電化學活性評估

經(jīng)修飾的電極于含鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液中循環(huán)伏安掃描如圖5 所示，結(jié)果顯示裸玻碳電極經(jīng)拋光及電極表面處理后，在鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生一對可逆氧化還原峰，峰電位差為70 mV。電極經(jīng)HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾后，在鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液中循環(huán)伏安掃描氧化還原峰對峰電位差顯著增加至121 mV。此外，修飾后電極氧化及還原峰電流顯著增大。氧化還原電位差增大說明修飾電極表面不再是玻碳電極表面均一潔凈狀態(tài)，氧化還原峰電流增大說明表面修飾材料導電性能良好。由于修飾材料具有較大固液接觸界面，使得更多電化學探針在其表面發(fā)生氧化還原，形成電子傳遞，從而導致電流增大。

圖5 HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極前后循環(huán)伏安圖a—修飾前；b—修飾后［掃描速率50 mV/s；緩沖液含0.1 mol/L KCl及2 mmol/L［F（eCN）6］3?/4?的PBS（10 mmol/L，pH 7.0）溶液］Fig.5 Voltammograms of the HRP/Au-GM M13 electrode without(a)and with chitosan modifications(b)[Scan rate:50 mV/s;buffer:PBS(10 mmol/L,pH 7.0)solution containing 0.1 mol/L KCl and 2 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-.]

HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極的電催化活性測定顯示，隨著過氧化氫的添加產(chǎn)生了很明顯的催化電流，同時無過氧化氫對照在對應(yīng)電位區(qū)域無明顯催化電流產(chǎn)生（圖6、圖7）。本研究通過循環(huán)伏安法［16］對HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極的電化學行為進行了測試。通過電極在含過氧化氫溶液中循環(huán)伏安掃描曲線微分解析，微分曲線呈現(xiàn)線性增加，直至600 mV 處有所緩解，因而，使用循環(huán)伏安600 mV處電流值對底物濃度作標準曲線來量化電極對過氧化氫的響應(yīng)。HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極在連續(xù)加入過氧化氫下循環(huán)伏安響應(yīng)如圖6、圖7 所示。每次過氧化氫添加后待信號穩(wěn)定后進行測試，過氧化氫濃度2.5～640 μmol/L范圍內(nèi)HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極催化過氧化氫降解顯示為一級反應(yīng)動力學行為。該范圍內(nèi)響應(yīng)電流對底物濃度做圖獲得R=0.992（n=9）標準曲線，檢測限為0.32 μmol/L（S/N=3）。

圖6 不同過氧化氫濃度下HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極循環(huán)伏安圖［Ar-飽和PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）中于20 mV/s速率掃描。H2O2濃度范圍2.5~640 μmol/L。內(nèi)插圖為600 mV處峰電流（μA）對濃度（μmol/L）作圖］Fig.6 Voltammograms of the HRP/Au-GM M13 electrode modified with chitosan at different concentrations of hydrogen peroxide[Scan rate:20 mV/s for N2-saturated PBS(0.1 mol/L,pH 7.0).The curve peaks were obtained in response to H2O2 concentrations from 2.5 μmol/L to 640 μmol/L.The embedded image shows the calibration curve derived from the curves.]

該檢測限數(shù)值與碳納米管-HRP 修飾電極相關(guān)研究檢測限數(shù)值相近［21］，比表2 中其他文獻報道的低［21-26］。約640 μmol/L處單位底物的信號響應(yīng)發(fā)生了顯著的衰減。超過該濃度可做另一標準曲線，線性范圍640 μmol/L～60 mmol/L（R=0.9829，n=9），如圖7所示。

圖7 不同過氧化氫濃度下HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極循環(huán)伏安圖［Ar-飽和PBS （0.1 mol/L，pH 7.0）中于20 mV/s速率掃描。H2O2濃度范圍640 μmol/L～60 mmol/L。內(nèi)插圖為600 mV處峰電流（μA）對濃度（mmol/L）作圖］Fig.7 Voltammograms of the HRP/Au-GM M13 electrode modified with chitosan at different concentrations of hydrogen peroxide from 640 μmol/L to 60 mmol/L[Scan rate:20 mV/s for N2-saturated PBS(0.1 mol/L,pH 7.0).The embedded image shows the calibration curve derived from the curves.]

HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極對底物信號響應(yīng)符合Michaelis-Menten 動力學方程。表觀米氏常數(shù)（Kmapp）反映的是酶親和力以及微觀動力學常數(shù)，該參數(shù)可通過電化學Lineweaver-Burke方程獲得［27］：

式中，Iss為過氧化氫添加后的穩(wěn)態(tài)電流；c為底物宏觀濃度；Imax為飽和底物條件下得到的最大電流。HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極Km

app值經(jīng)計算為0.3 mmol/L，低于眾多傳統(tǒng)修飾方法的過氧化氫酶電極［28-30］。電極極低的Kmapp值證明該電極對底物具有高親和性及高靈敏度。

2.5 不同修飾電極的比較

由于絲狀噬菌體主要衣殼蛋白2700 個拷貝上均有金結(jié)合肽，金離子結(jié)合并還原形成微納結(jié)構(gòu)的成核位點在病毒模板上得到了最大化的展示。因而金離子可在病毒表面礦化形成線狀納米結(jié)構(gòu)（表2）。當病毒模板滴度較高時，形成的金屬-病毒復合線狀結(jié)構(gòu)進一步可形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有如下特點：首先，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于更多HRP 等酶分子的包埋和吸附；其次，金網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)導電性能較好，能為酶活性中心到電極表面電子傳遞提供便利。上述特點可增強同等條件下酶電極的響應(yīng)信號，為了驗證由其結(jié)構(gòu)特點得出的推論，研究中比較了4種過氧化氫酶電極（圖8）。結(jié)果表明，HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極在高底物濃度區(qū)域和低濃度區(qū)域均展現(xiàn)了優(yōu)越的信號響應(yīng)，其響應(yīng)電流約為HRP/金納米顆粒/殼聚糖修飾電極和HRP/殼聚糖修飾電極的2～7倍。該實驗中，通過ICP-OES測定了納米金-噬菌體復合物及金納米顆粒的金含量，修飾電極時確保了兩個電極上修飾物中金含量相等。裸玻碳電極在低濃度時未測到對過氧化氫的催化電流，在過氧化氫濃度高達10 mmol/L以上時，顯示了與HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極相同數(shù)量級的催化電流響應(yīng)。這可能是由于溶液高電位高濃度條件下過氧化氫部分水解產(chǎn)生氧氣從而產(chǎn)生的氧化電流。數(shù)十微摩爾濃度的過氧化氫檢測在實際應(yīng)用場景中其實已不具備太大的價值。圖8中也顯示了低濃度的響應(yīng)結(jié)果，HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極較其他修飾電極信號響應(yīng)更為靈敏。同時，沒有金微納結(jié)構(gòu)參與修飾的HRP/殼聚糖修飾電極則對底物信號響應(yīng)最差。上述結(jié)果表明，由于納米金-噬菌體復合物的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使得酶-電極的電子傳遞更為便利，HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極在較大的濃度范圍內(nèi)均有更好的電信號響應(yīng)，此外，響應(yīng)電流在很大范圍內(nèi)與底物濃度呈線性的正比關(guān)系。同為金納米材料的納米金顆粒制備HRP/納米金顆粒/殼聚糖修飾電極則在不同濃度范圍對底物催化電流均與納米金-噬菌體復合物修飾電極的信號有數(shù)倍差異，這是因為納米金顆粒為膠體狀態(tài)，為了維持膠體狀態(tài)穩(wěn)定，顆粒間具有較強靜電斥力，修飾電極時，納米金顆粒間通常因為靜電作用離散分布，電子通過納米金顆粒的傳遞通常為Marcus模型［29］所描述的電子隧穿，傳遞效率較差。與之相較，納米金-噬菌體復合物為連續(xù)金沉積的一維納米材料，在此基礎(chǔ)上加強沉積形成交叉三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提供了更多的有利于電子傳遞的接觸面。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面較為粗糙，為吸附在其表面的酶提供了更多的便于電子傳遞的方向，使得更多不同角度吸附的酶得以在催化條件下成功實現(xiàn)酶-電極間的電子傳遞?？傊鸪练e于基因改造噬菌體而形成的復合物具有一維連續(xù)金屬表面的基本結(jié)構(gòu)，通過超級金屬沉積結(jié)互相連接構(gòu)成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)表面具有眾多形貌各異的金納米顆粒樣亞結(jié)構(gòu)，同時表面粗糙，為不同方向吸附的酶都能提供更為便利的電子傳遞條件，因而表現(xiàn)出優(yōu)異的電響應(yīng)性能。

圖8 隨過氧化氫濃度變化不同修飾電極催化電流變化比較（a）HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極；（b）裸玻碳電極；（c）HRP/金納米顆粒/殼聚糖修飾玻碳電極；（d）HRP殼聚糖包埋修飾玻碳電極Fig.8 Comparison of voltammograms for the electrode responses to increased H2O2 concentrations[The measurement was performed in the PBS without oxygen.HRP/Au-GM M13 electrode with(a)and without(b)chitosan modification,and HRP/Au nanoparticles electrode with(c)and without(d)chitosan modification]

表2 HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極與其他修飾過氧化氫酶電極的比較Tab.2 Comparison of the analytical performance of enzyme-phage-gold modified electrode with other electrochemical biosensors

為了進一步研究這種新復合材料的電化學行為，研究中使用交流阻抗譜測試了上述不同修飾的電極（圖9）。阻抗譜Nyquist 圖在系列電極表征中基本由半圓弧和線性部分構(gòu)成，半圓弧部分對應(yīng)電子傳遞限制過程而線性部分則對應(yīng)電化學過程中的擴散限制步驟［30-31］。半圓弧半徑（Ret）可以評估電子傳遞的阻力大小，修飾層性能不同，氧化還原探針在電極表面電子傳遞動力學行為不同，因而半圓弧半徑可以用來評估電極界面處的性質(zhì)。圖9顯示玻碳電極Ret接近無窮小，其對電子探針在其表面?zhèn)鬟f和氧化還原阻力很小，探針在其表面氧化還原過程主要為擴散控制。HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極后Ret迅速增加，過程轉(zhuǎn)為電子傳遞限制（圖9），同時提示，在低底物濃度范圍內(nèi)，擴散對整個過程的影響幾乎可以忽略。雖然HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極和HRP/納米金顆粒/殼聚糖修飾電極具有同樣的金含量，HRP/納米金顆粒/殼聚糖修飾電極比HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極具有更大的Ret，表明通過納米金顆粒電子傳遞阻力較大。另外，納米金溶膠結(jié)構(gòu)表面電荷分布也對［Fe（CN）6］3?/4?等電化學探針有較強靜電排斥作用。納米金-噬菌體復合物則為硼氫化鈉直接還原所得，表面檸檬酸根等負電荷基團很少，也有利于帶電荷探針通過其修飾層的傳遞。此處結(jié)果也同樣解釋了圖8中兩種修飾催化電流顯著差異的原因。

圖9 交流阻抗Nyquist圖（Z"vs Z'）測試溶液：含0.1 mol/L KCl及2 mmol/L［F（eCN）6］3?/4?的PBS（10 mmol/L，pH 7.0）溶液a—HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾玻碳電極；b—HRP/金納米顆粒/殼聚糖修飾玻碳電極；c—HRP殼聚糖包埋修飾玻碳電極；d—裸玻碳電極Fig.9 Nyquist diagram(Z"vs Z')for Faradaic impedance spectra in the PBS(10 mmol/L,pH 7.0)containing 0.1 mol/L KCl and 2 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-a—HRP/Au-GM M13 electrode modified with chitosan;b—HRP/Au nanoparticles electrode modified with chitosan modified electrode;c—HRP electrode modified with chitosan;d—the glass-carbon electrode without the modification

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了主要衣殼蛋白gP8展示金結(jié)合肽（VSGSSPDS）的M13 噬菌體，以基因改造噬菌體作為成核模板，將金還原礦化到噬菌體表面，通過礦化條件的調(diào)節(jié)，獲得了三維導電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)為網(wǎng)絡(luò)狀，表面分布有點狀納米亞結(jié)構(gòu)且有均勻的金屬礦化，表面較為粗糙，具有較好的導電能力及酶吸附能力。利用該金-基因改造噬菌體復合物修飾電極制備過氧化氫酶電極，獲得良好的性能。電極對過氧化氫響應(yīng)線性范圍2.5 μmol/L～60 mmol/L，檢測限為0.32 μmol/L（S/N=3）。金-基因改造噬菌體復合物修飾電極與其他納米材料相比具有較大優(yōu)勢，表現(xiàn)為：

①HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極檢測限為0.32 μmol/L，檢測限低于同類酶與其他納米材料共修飾的酶電極：脂質(zhì)體/納米金/離子液體修飾、硅-羥基磷灰石修飾、銅載體功能化納米金修飾、納米金修飾ITO 電極及脂質(zhì)體修飾等；與碳納米管修飾過氧化氫酶電極檢測限接近。

②HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極對底物信號響應(yīng)符合Michaelis-Menten 動力學方程。表觀米氏常數(shù)（Kmapp）值為0.3 mmol/L，低于眾多傳統(tǒng)方法修飾的過氧化氫酶電極。

③HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極在高底物濃度區(qū)域和低濃度區(qū)域均展現(xiàn)了優(yōu)越的信號響應(yīng)，其響應(yīng)電流約為HRP/金納米顆粒/殼聚糖修飾電極和HRP/殼聚糖修飾電極的2～7 倍。

④HRP/納米金-噬菌體復合物/殼聚糖修飾電極交流阻抗測試Ret值顯著小于HRP/金納米顆粒/殼聚糖修飾電極和HRP/殼聚糖修飾電極。

上述結(jié)果說明通過噬菌體M13 主要衣殼蛋白展示金結(jié)合肽，并以之為模板進行金的礦化，由于每個噬菌體上產(chǎn)生了多達2700 個拷貝的成核位點，有利于形成導電一維材料，并進一步形成三維導電網(wǎng)絡(luò)。礦化后金-基因改造噬菌體復合物表面較為粗糙有利于酶的吸附，并易于在酶的各個方向形成酶-電極的導電通路，從而提高酶電極的靈敏度及信號響應(yīng)強度。本研究將為噬菌體展示材料結(jié)合肽的實際應(yīng)用提供有益基礎(chǔ)。