雙特異性抗體及納米技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用進(jìn)展

許仕琳，許海燕

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005）

合成生物學(xué)是一種設(shè)計(jì)驅(qū)動(dòng)的科學(xué)，主要通過(guò)對(duì)天然或合成成分的分解、重建及再利用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)人工生物系統(tǒng)的精確控制［1］。近年來(lái)，基于合成生物學(xué)的生物技術(shù)在疫苗研發(fā)、分子診斷和細(xì)胞治療等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。腫瘤免疫治療包括單克隆抗體類(lèi)免疫檢查點(diǎn)抑制劑、治療性抗體、癌癥疫苗和細(xì)胞治療等［2］，其中治療性抗體已經(jīng)成為腫瘤治療的重要研究方向［3］。目前，被批準(zhǔn)用于臨床及處于臨床試驗(yàn)研究階段的治療性抗體大多數(shù)是單特異性的，只能與單個(gè)靶點(diǎn)相互作用［4-5］。然而，復(fù)雜的疾病往往由多因素誘發(fā)，涉及多種配體、受體以及信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的串?dāng)_。例如，腫瘤細(xì)胞通常會(huì)上調(diào)多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的受體的表達(dá)，這些受體能夠通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化干擾細(xì)胞功能［6-7］。因此，僅針對(duì)單一抗原的單特異性抗體治療難以完全摧毀腫瘤細(xì)胞。

雙特異性抗體是一種合成分子，將來(lái)自?xún)蓚€(gè)抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合成一個(gè)單一的結(jié)構(gòu)，可以同時(shí)與不同的抗原或表位結(jié)合［8-9］。雙特異性抗體的生產(chǎn)主要通過(guò)化學(xué)異源結(jié)合、雜交瘤技術(shù)和DNA重組技術(shù)等實(shí)現(xiàn)，這些生物合成方法提高了雙特異性抗體的穩(wěn)定性并降低了免疫原性，具有誘人的臨床應(yīng)用前景［10］。雙特異性抗體在抗腫瘤治療中的主要作用機(jī)制包括以下方面（圖1）［11］：①招募T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞，并將它們重定向至腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力；②同時(shí)阻斷發(fā)病進(jìn)程中兩個(gè)不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮獨(dú)特或重疊的功能，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及存活；③同時(shí)靶向細(xì)胞表面不同的抗原或表位，增強(qiáng)其與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合并直接殺傷腫瘤細(xì)胞。需要強(qiáng)調(diào)的是，雙特異性抗體要實(shí)現(xiàn)有效治療必須有合適的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，這些參數(shù)可通過(guò)對(duì)雙特異性抗體進(jìn)行有針對(duì)性的修飾和改造來(lái)獲得［12］。

圖1 雙特異性抗體在腫瘤免疫治療中的作用機(jī)制Fig.1 Mechanisms underlying tumor immunotherapy with bispecific antibodies

納米醫(yī)學(xué)在克服和跨越生物障礙、有效遞送疏水藥物和生物制劑以及優(yōu)先靶向抗原位點(diǎn)等方面展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢(shì)，納米材料的高效負(fù)載能力和豐富的表面修飾方法為改善藥物的生物相容性和藥代動(dòng)力學(xué)以及藥物的靶向性提供了多種可能性。此外，納米藥物遞送平臺(tái)可同時(shí)裝載多種藥物，將其用于聯(lián)合用藥方案的優(yōu)化可提高藥物療效，減少耐藥的發(fā)生［13-14］。因此，納米技術(shù)有望為雙靶點(diǎn)抗體藥物的研發(fā)提供有力的新工具。本文對(duì)近年來(lái)雙特異性抗體及其與納米技術(shù)相結(jié)合形成的遞送系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用進(jìn)展做分類(lèi)介紹和綜合評(píng)述。

1 雙特異抗體的制備及分類(lèi)

天然抗體都是單特異性的，盡管單特異性抗體在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用較為廣泛，但是它們并未在臨床應(yīng)用中獲得預(yù)期的療效。這是由于單特異性抗體的治療策略還存在諸多弊端，比如大部分患者會(huì)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及患者對(duì)該療法產(chǎn)生耐藥進(jìn)而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)等［15］。鑒于上述原因，人工設(shè)計(jì)的雙特異性抗體近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注和開(kāi)發(fā)，以期克服單特異性抗體治療中出現(xiàn)的問(wèn)題。制備重組抗體方法的發(fā)展可以使雙特異性抗體具有明確的結(jié)構(gòu)、組成成分、生化、功能和藥理特性，在疾病診斷、成像、預(yù)防和治療等方面有廣闊的應(yīng)用潛力，近年來(lái)有大量應(yīng)用研究集中在腫瘤免疫治療方面，如將包括T細(xì)胞在內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞［16］。

雙特異性抗體分子在自然界中并不存在，因此，需采用生物化學(xué)、合成生物學(xué)和基因工程等技術(shù)手段設(shè)計(jì)制備。常用的雙特異性抗體制備方法包括：①將兩個(gè)不同的抗體或抗體片段利用化學(xué)偶聯(lián)劑進(jìn)行連接；②將兩個(gè)產(chǎn)生不同抗體的雜交瘤細(xì)胞融合成雙雜交瘤細(xì)胞株，在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生兩個(gè)不同的重鏈和兩個(gè)不同的輕鏈，組成雙特異性抗體分子；③利用基因工程技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)抗體進(jìn)行多種形式的改造［16］。雙特異性抗體存在多種形式，按其結(jié)構(gòu)可劃分為IgG 樣雙特異性抗體和非IgG 樣雙特異性抗體兩大類(lèi)［17］，前者包含兩個(gè)可結(jié)合不同抗原位點(diǎn)的Fab 片段和一個(gè)Fc 片段，保留了Fc 片段介導(dǎo)的效應(yīng)功能，如抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 （antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用（complementdependent cytotoxicity，CDC）和抗體依賴(lài)性細(xì)胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）［18］；后者由于分子量較大且能夠通過(guò)結(jié)合新生兒Fc 受體（neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）循環(huán)利用，在血清中具有較長(zhǎng)的半衰期。IgG 樣雙特異性抗體的生產(chǎn)工藝較為成熟，其中的Fc 片段也有助于增加抗體純化的溶解度和穩(wěn)定性［19］。IgG樣雙特異性抗體主要有三功能抗體（triomab）、“Knobsinto-holes”杵臼結(jié)構(gòu)、雙可變結(jié)構(gòu)域Ig（dualvariable domains Ig， DVD-Ig）、 IgG 單 鏈 抗 體（IgG-single-chain Fv，scFv）等形式。非IgG 樣雙特異性抗體專(zhuān)門(mén)由Fab 片段組成，不包含F(xiàn)c 片段。相比于IgG 樣雙特異性抗體，它們的分子量較小，在體內(nèi)展現(xiàn)出更快的清除和更好的組織穿透能力。雖然這些非IgG 樣雙特異性抗體分子在結(jié)構(gòu)上大致相似，都是兩個(gè)或多個(gè)抗體Fab片段通過(guò)柔性肽連接，但每個(gè)分子都有獨(dú)特的分子構(gòu)型，這導(dǎo)致了雙特異性抗體在物理化學(xué)性質(zhì)、生物活性以及生產(chǎn)方法等方面的差異［17］。非IgG樣雙特異性抗體主要有雙親和重定向蛋白（dual-affinity re-targeting，DART）、納米抗體（nanobodies）、雙價(jià)和雙特異性抗體（diabody）和雙特異性T 細(xì)胞銜接器（bispecific T cell engager，BiTE）等形式。

2 雙特異性抗體在惡性血液腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

2.1 急性髓細(xì)胞白血病

急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukaemia，AML）是一種惡性血液腫瘤，其特征是細(xì)胞的分化成熟過(guò)程受到阻滯，在骨髓和外周血中聚集了大量未分化的原始細(xì)胞［20］?，F(xiàn)行的AML 化療方案可使60%～80%的患者獲得完全緩解，但在完全緩解后5 年內(nèi)有超過(guò)50%的患者會(huì)復(fù)發(fā)且預(yù)后較差，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療方法［21］。由于大多數(shù)白血病細(xì)胞與CD123、CD33、CD96、CLL-1 等特異性抗原的陽(yáng)性表達(dá)有關(guān)，而雙特異性抗體可以同時(shí)靶向不同抗原，因此，基于抗體的靶向治療方法有望增強(qiáng)AML 的治療效果并降低化療所產(chǎn)生的毒副作用［22-23］。

Leong 等［24］設(shè) 計(jì) 了 一 種 靶 向CLL-1 的CD3 T 細(xì)胞依賴(lài)的雙特異性全長(zhǎng)人源化IgG1 抗體（Tcell-dependent bispecific，TDB）。該研究表明，CLL-1/CD3 TDB 具有良好的耐受性和清除靶細(xì)胞的能力。AMG330 是一種靶向CD3 和CD33 的雙特異性抗體，能夠招募CD3+T 淋巴細(xì)胞，引導(dǎo)其定向并裂解CD33+AML 原始細(xì)胞［23-24］。臨床前研究結(jié)果表明，AMG330通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用不僅可以有效殺傷AML 原始細(xì)胞，而且對(duì)CD33+骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞具有明顯的殺傷作用［25］。一項(xiàng)針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性AML 患者的臨床Ⅰ期研究（NCT02520427）結(jié)果表明，AMG330 具有明顯的抗白血病活性，藥物劑量達(dá)到720 μg/d時(shí)，患者對(duì)AMG330 的 耐 受 性 良 好［26］。 MGD006， 又 名Flotetuzumab，是一種靶向CD123×CD3 DART?蛋白。MGD006 介導(dǎo)T 細(xì)胞重定向至CD123+AML 細(xì)胞并將其殺傷，在食蟹猴模型中的耐受性良好，在臨床前研究展現(xiàn)出抗白血病活性和可接受的安全性。臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)（NCT02152956）結(jié)果表明，MGD006 在約31%的難治性AML 患者中展現(xiàn)出較好的耐受性和有效性，但在復(fù)發(fā)性AML 患者中 的 療 效 并 未 顯 現(xiàn)［27-28］。XmAb14045 是 一 種CD123×CD3 雙特異性IgG 抗體，臨床前研究結(jié)果表明，XmAb14045 能夠招募并激活T 細(xì)胞，有效殺傷循環(huán)血液及骨髓中的CD123+細(xì)胞［29］。臨床Ⅰ期研究（NCT02730312）的初步結(jié)果顯示，XmAb14045 對(duì)復(fù)發(fā)/難治性AML 患者具有抗白血病作用，但仍需對(duì)藥物最優(yōu)劑量和毒副作用做進(jìn)一 步 評(píng) 估［30］。JNJ-63709178 是Genmab 公 司 利 用DuoBody?技 術(shù) 設(shè) 計(jì) 的 一 種CD123×CD3 人 源 化IgG4 雙特異性抗體，在體內(nèi)、體外水平上均能特異性殺傷CD123+AML 細(xì)胞［31］。但是，在用于治療復(fù)發(fā)/難治性AML 患者的臨床Ⅰ期試驗(yàn)中，由于患者出現(xiàn)3級(jí)以上的細(xì)胞因子釋放綜合征而被擱置（NCT02715011）［32］。

近期有文獻(xiàn)報(bào)道了一類(lèi)新的抗體融合蛋白，稱(chēng)為“三體”（Triplebodies）。這些“三體”中的雙抗體可以結(jié)合同一靶細(xì)胞上兩種不同的腫瘤抗原，通過(guò)這種“雙靶向”模式增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，與此同時(shí)，“三體”中還包含一個(gè)激活效應(yīng)細(xì)胞的觸發(fā)分子，能夠使雙抗體定向到某種效應(yīng)細(xì)胞［33-35］。例如，“三體”［123×ds16×33］是一種單鏈多肽，由抗AML 細(xì)胞上CD123 和CD33 的特異性單鏈抗體片段與抗NKs 和巨噬細(xì)胞上CD16的特異性單鏈抗體片段連接而成。與單靶向制劑［123×ds16×123］相比，雙靶向“三體”［123×ds16×33］對(duì)CD33 和CD123 雙 陽(yáng) 性AML 細(xì)胞 的ADCC 作用顯著增強(qiáng)；對(duì)從來(lái)自7 名AML 患者的外周血或骨髓中的原代白血病細(xì)胞的ADCC 作用也較強(qiáng)［34］。以此為基礎(chǔ)對(duì)雙靶向“三體”［123×ds16×33］進(jìn)行優(yōu)化，將鼠源的單鏈抗體片段替換為人源化且含有穩(wěn)定二硫鍵的單鏈可變區(qū)抗體片段作為抗原結(jié)合位點(diǎn)，并加入了利于其臨床應(yīng)用的突變片段。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的三體（SPM-2）在納摩爾濃度下即可介導(dǎo)NKs 對(duì)來(lái)源于29 例不同AML 亞型患者的原代白血病細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷，而且表現(xiàn)出根除白血病干細(xì)胞的潛力［36］。

脫靶效應(yīng)造成的細(xì)胞毒性是導(dǎo)致AML 免疫治療藥物研發(fā)緩慢的重要因素之一［32］。目前，許多針對(duì)AML 治療的新型雙特異性抗體在實(shí)驗(yàn)室階段研究中展現(xiàn)出了良好的抗白血病效果，但在臨床試驗(yàn)階段的治療效果尚未達(dá)到預(yù)期。若將雙特異性抗體與其他形式的免疫治療方法相結(jié)合，如靶向共刺激信號(hào)通路和免疫逃逸機(jī)制，或可進(jìn)一步提高AML的療效和臨床效益。

2.2 B細(xì)胞惡性血液腫瘤

B 細(xì)胞惡性血液腫瘤通常起源于生發(fā)中心中的B細(xì)胞，這些細(xì)胞具有較高的增殖速率，易發(fā)生染色體易位或染色體畸變（形成超二倍體或亞二倍體），可誘發(fā)白血病的形成［37］。為改善患者經(jīng)化療后產(chǎn)生的明顯毒性并降低疾病復(fù)發(fā)，激酶抑制劑和治療性抗體已逐漸成為治療B細(xì)胞惡性血液腫瘤的重點(diǎn)研究方向［38-39］。

CD19 是一種在B 細(xì)胞惡性血液腫瘤中廣泛表達(dá)的表面標(biāo)記物。研究人員設(shè)計(jì)了一種靶向CD47和CD19 的全人源化的雙特異性抗體NI-1701，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均可顯著殺傷B細(xì)胞惡性血液腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抑制小鼠異種移植模型中腫瘤的生長(zhǎng)。該研究表明，NI-1701 通過(guò)與淋巴瘤細(xì)胞上CD47/CD19 的結(jié)合，誘導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），有效清除靶細(xì)胞［40］。HD37×T5.16 是一種由四源雜交瘤細(xì)胞分泌得到的雙特異性抗體，可同時(shí)靶向CD19 和CD5。研究結(jié)果顯示，HD37×T5.16 能夠增強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK）對(duì)CD19+B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的殺傷［41］。

MGD011，又名Blinatumomab，是一種CD19×CD3 DART，旨在重定向T 淋巴細(xì)胞，以消除CD19+B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞。臨床前研究結(jié)果表明，MGD011 可介導(dǎo)人或食蟹猴的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）對(duì)人的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞有效殺傷；MGD011對(duì)小鼠移植性淋巴瘤模型具有良好的抗腫瘤作用；食蟹猴對(duì)MGD011 有良好的耐受性，沒(méi)有出現(xiàn)化合物毒性作用及病理改變［42］。2014年12月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)將MGD011 用于治療復(fù)發(fā)/難治性急性B 淋巴細(xì)胞白血病患者［43］。在評(píng)估MGD011 對(duì)NHL 患者治療效果的初步報(bào)告中，4 例患者獲得完全緩解，7例患者獲得部分緩解［44］。臨床Ⅰ期劑量遞增試驗(yàn)（NCT02454270）結(jié)果表明，逐步增加給藥劑量至患者的最大耐受劑量可讓NHL 患者獲得更為持久的緩解［45］；MGD011 對(duì)復(fù)發(fā)/難治性彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）患者療效及安全性評(píng)估的臨床Ⅰ/Ⅱ期研究結(jié)果也得到了相似的結(jié)果［46］，即MGD011 單獨(dú)治療復(fù)發(fā)/難治性NHL或DLBCL患者均表現(xiàn)出良好的抗淋巴瘤作用。由于MGD011 在患者體內(nèi)的半衰期（約2 h）較短，對(duì)MGD011 進(jìn)行優(yōu)化，如AFM11、AMG562 和HLE-BiTEs 等［47-49］，盡 管未 影 響其 療效，但這些雙特異性抗體會(huì)引起較強(qiáng)的神經(jīng)毒性或細(xì)胞因子釋放綜合征，因此臨床試驗(yàn)一再擱置。

靶向CD20 的治療策略對(duì)CD20+前體B 細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。╬recursor B-cell lymphoblastic leukemia，BCP-ALL）患者以及CD19 抗原陰性復(fù)發(fā)患者的治療較有前景［50-51］。幾種靶向CD20 和CD3 的雙特異性抗體（如FBTA05、REGN1979、Mosunetuzumab 和XmAb13676）正處于臨床Ⅰ/Ⅱ期研究階段［52-54］。初步結(jié)果表明，這些CD20×CD3雙特異性抗體單獨(dú)或與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、化療聯(lián)合治療CD20+B細(xì)胞惡性血液腫瘤患者具有令人滿意的安全性和有效性［55-56］。

信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）是一種在吞噬細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀 細(xì) 胞） 上 表 達(dá) 的 蛋 白［57］。 SIRPα 的 配體為CD47，在B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，NHL）、AML 和多種實(shí)體瘤細(xì)胞上均過(guò)度表達(dá)［58］。SIRPα 與CD47 結(jié)合后可啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路傳遞“不要吃我”的信號(hào)，使腫瘤細(xì)胞逃避吞噬細(xì)胞的吞噬［59］。由于CD47在正常組織細(xì)胞上也普遍表達(dá)，抗CD47 的單特異性抗體很難在體內(nèi)精準(zhǔn)靶向腫瘤細(xì)胞。解決這一問(wèn)題的一種治療策略是設(shè)計(jì)雙特異性抗體，降低對(duì)CD47 的親和力并保留阻斷CD47-SIRPα 相互作用的能力，加入抗腫瘤其他抗原的抗體片段以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的高親和力。Piccione 等［60］研發(fā)了一種同時(shí)靶向CD47 和CD20 的雙特異性抗體CD20-CD47SL，這是具有雙重可變結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白（dual-variable-domain immunoglobulin，DVD-Ig）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)淋巴瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞（CD47 高表達(dá)）共培養(yǎng)時(shí)，CD20-CD47SL 能選擇性地結(jié)合CD47+CD20+淋巴瘤細(xì)胞；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD20-CD47SL 能減輕小鼠的淋巴瘤負(fù)擔(dān)，顯著延長(zhǎng)生存期。

綜上，在實(shí)驗(yàn)室研究及臨床試驗(yàn)階段的初步結(jié)果表明，雙特異性抗體或可成為治療B細(xì)胞惡性血液腫瘤的一個(gè)較有前景的治療策略。雖然觀察到雙特異性抗體具有一定的抗腫瘤作用，但其臨床轉(zhuǎn)化仍受到毒副作用的限制，如脫靶效應(yīng)、藥理局限性等［61］。因此，需要結(jié)合免疫學(xué)、藥理學(xué)和合成生物學(xué)等專(zhuān)業(yè)知識(shí)來(lái)提高雙特異性抗體在B細(xì)胞惡性血液腫瘤中的治療效果。

3 雙特異性抗體在實(shí)體瘤免疫治療中的應(yīng)用

3.1 乳腺癌

乳腺癌是全球女性中最常見(jiàn)的腫瘤之一，在中國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別位列女性惡性腫瘤的第1 位和第4 位［62］。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一種跨膜蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶家族，在15%～20%的乳腺癌中過(guò)表達(dá)，是一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)［63］。曲妥珠單抗（Trastuzumab）、帕妥珠單抗（Pertuzumab）和拉帕替尼（Lapatinib）等已被廣泛用于HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療［64-66］，但并不是所有患者均能從中獲益，部分患者會(huì)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致死亡。因此，開(kāi)發(fā)新的靶向治療策略十分必要。

厄妥索單抗（Ertumaxomab）是一種靶向HER-2和CD3的三功能雙特異性抗體，可優(yōu)先結(jié)合并激活Fcγ Ⅰ/Ⅲ型受體，在腫瘤細(xì)胞、T 細(xì)胞和輔助細(xì)胞之間形成三細(xì)胞復(fù)合體［66-67］，在曲妥珠單抗耐藥和HER2/neu 抗原密度低的細(xì)胞上表現(xiàn)出了抗腫瘤作用，其臨床Ⅰ期研究結(jié)果表明，厄妥索單抗對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者具有長(zhǎng)期抗腫瘤免疫效應(yīng)［67］。M802 是通過(guò)鹽橋和同二聚體“杵臼結(jié)構(gòu)”（knobsinto-holes）技術(shù)設(shè)計(jì)的一種HER-2/CD3 雙特異性抗體，能重定向CD3+免疫細(xì)胞，對(duì)HER-2 陽(yáng)性、HER-2 陰性和曲妥珠單抗耐藥的細(xì)胞具有比曲妥珠單抗更強(qiáng)的殺傷作用［68］。MM-111 由抗HER-2和抗HER-3 單鏈抗體與經(jīng)修飾的人血清白蛋白相連接而成［69］，可同時(shí)與HER-2 和HER-3 結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，阻斷HER-2 過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)HER-3 和PI3K 信號(hào)通路的傳導(dǎo)［70］。MM-111 與曲妥珠單抗和拉帕替尼聯(lián)合應(yīng)用可有效抑制HER-2陽(yáng)性乳腺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，比AKT和MEK 抑制劑的聯(lián)合治療效果更為顯著［71］。

肝配蛋白受體A10（ephrin receptorA10，EphA10）是一種跨膜受體，被鑒定為新的人乳腺癌生物標(biāo)志物［72］。靶 向EphA10 和CD3 的 雙 特 異 性 抗 體（EphA10/CD3 BsAb）能重定向T 細(xì)胞，有效裂解過(guò)表達(dá)EphA10 的乳腺癌細(xì)胞。二聚體形式的BsAb比單體形式的BsAb對(duì)細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，在小鼠異種移植模型中也表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)［73］。基于抗PD-L1 抗體阿替唑單抗（Atezolizumab）和共有變異體1（CV1）的可變區(qū)可構(gòu)建針對(duì)CD47和PD-L1 的雙靶向融合蛋白IAB［74］，在體外誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞、激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作用。在免疫功能正常的MC38 小鼠模型中，IAB表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。但抗CD8 抗體或氯膦酸鹽脂質(zhì)體均可削弱IAB 的抗腫瘤作用，說(shuō)明該作用需要CD8+T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的參與。此項(xiàng)研究提示IAB 對(duì)CD47 和PD-L1 的雙重阻斷可能成為一種同時(shí)激活天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的協(xié)同治療方法。B7-H4（VTCN1）是一種負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答的免疫檢查點(diǎn)分子，在多種人類(lèi)腫瘤中過(guò)表達(dá)。靶向B7-H4 和CD3 的雙特異性抗體能夠介導(dǎo)人PBMCs 對(duì)乳腺癌細(xì)胞及其他B7-H4+細(xì)胞株的有效殺傷，在小鼠異種移植模型中展現(xiàn)出較強(qiáng)的 抗 腫 瘤 作 用［75］。 催 乳 素 受 體（prolactin receptor，PRLR）是一種Ⅰ型細(xì)胞因子受體，在正常乳腺組織中僅輕度表達(dá)，在腫瘤乳腺組織中高表達(dá)［76］。通過(guò)分裂內(nèi)含蛋白介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)（split intein mediated protein transsplicing，BAPTS）系統(tǒng)技術(shù)研發(fā)的靶向PRLR 和CD3 的雙特異性抗體PRLR-DbsAb 能在體外招募并激活T 細(xì)胞，促進(jìn)T 細(xì)胞分泌IFN-γ 和TNF-α 細(xì)胞因子對(duì)PRLR+乳腺癌細(xì)胞有效殺傷；相比于PRLR 單抗治療組，PRLR-DbsAb 能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠生存期［77］。

3.2 卵巢癌

卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，死亡率在婦科腫瘤中居首位［78］。外科手術(shù)治療與含鉑類(lèi)化療藥物輔助治療相結(jié)合仍然是現(xiàn)階段卵巢癌治療的主要手段，大約有80%的患者會(huì)獲得完全緩解，但其中有超過(guò)60%的患者最終會(huì)復(fù)發(fā)，只有不到40%的患者能長(zhǎng)期存活5年以上，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的卵巢癌治療方法［79-80］。

人上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞（如卵巢癌、胃癌、前列腺癌和乳腺 癌 等） 上 高 表 達(dá)［80-82］。 卡 妥 索 單 抗（Catumaxomab）是一種由抗EpCAM 抗體片段和抗CD3 抗體片段組成的雙特異性抗體，能招募并重定向T細(xì)胞介導(dǎo)ADCC 作用，或激活T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B對(duì)腫瘤細(xì)胞有效殺傷?？ㄍ姿鲉慰挂部梢酝ㄟ^(guò)其完整的Fc 段與輔助細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）上的Fcγ受體結(jié)合，激活過(guò)表達(dá)Fcγ 受體的輔助細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞［83］。臨床Ⅰ/Ⅱ期研究結(jié)果顯示，卡妥索單抗明顯降低卵巢癌患者體內(nèi)腹水的積累，有效殺傷EpCAM+腫瘤細(xì)胞，并具有可接受的安全性［84］。一項(xiàng)多中心、單臂臨床Ⅱ期研究結(jié)果表明，原發(fā)性上皮卵巢癌患者在術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)化療前接受卡妥索單抗治療，獲得了預(yù)期療效，但約有39%的患者出現(xiàn)傷口并發(fā)癥、胸腔積液和感染等毒副作用［85］。AMG110 是由抗EpCAM 單鏈抗體和抗CD3 單鏈抗體組成的雙特異性抗體［86］，能介導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞有效殺傷EpCAM+原發(fā)性子宮癌和卵巢癌肉瘤細(xì)胞［87］，也能顯著抑制原發(fā)性耐藥上皮性卵巢癌細(xì)胞系及來(lái)源于卵巢癌患者體內(nèi)腹水腫瘤細(xì)胞的活性［88］。一項(xiàng)臨床Ⅰ期研究結(jié)果顯示，AMG110 在約95%的EpCAM+難治性實(shí)體瘤患者中出現(xiàn)了劑量限制性毒性（如嚴(yán)重腹瀉、肝酶升高），難以達(dá)到有效發(fā)揮抗腫瘤作用的治療劑量［89］。

通過(guò)化學(xué)編程技術(shù)可將人源化單克隆抗體h38C2 與人源化抗CD3 單克隆抗體v9 制備成h38C2×v9 DART 蛋白，同時(shí)靶向葉酸受體1（folate receptor 1，F(xiàn)OLR1）和CD3。研究結(jié)果表明，h38C2×v9 DART 蛋白能選擇性地與過(guò)表達(dá)FOLR1 的卵巢癌細(xì)胞結(jié)合，招募并激活T 細(xì)胞有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［90］。進(jìn)一步設(shè)計(jì)的不對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體（CD3×FOLR1 biAbs）可介導(dǎo)T 細(xì)胞對(duì)過(guò)表達(dá)FOLR1 的卵巢癌細(xì)胞的殺傷，在小鼠異種移植模型中展現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果［91］。靶向FOLR1 和死亡受體5（death receptor，DR5）的雙特異性細(xì)胞毒性激活劑抗體BaCa 能選擇性地與FOLR+卵巢癌細(xì)胞結(jié)合并錨定在細(xì)胞上，維持高水平的腫瘤特異性細(xì)胞凋亡并在小鼠異種移植模型中展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用，比此前報(bào)道的DR5激動(dòng)劑的抗腫瘤效果更為突出［92］。由人/鼠嵌合的抗Ⅰ型胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（type Ⅰinsulin-like growth factor receptor，IGF-1R）的單克隆抗體m590 和抗HER-2 的曲妥珠單抗組成的雙特異性抗體Bi-Ab可通過(guò)阻斷PI3K/AKT和促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的磷酸化而顯著抑制HER-2+IGF-1R+卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 的增殖。相比于m590、曲妥珠單抗單獨(dú)或兩種抗體聯(lián)合的治療，Bi-Ab 在小鼠異種移植模型中展現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果［93］。

3.3 肺癌和頭頸癌

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的過(guò)度表達(dá)與頭頸癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)［94］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和EGFR 通路相互作用，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及血管生成，因此，同時(shí)靶向EGFR 和VEGF的治療性抗體可能比單特異性抗體的抗腫瘤效果更好［95］。例如，抗EGFR和VEGF的雙特異性抗體DT-IgG［96］可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞A549 和頭頸部鱗狀細(xì)胞 癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細(xì)胞Tu212 的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力與西妥昔單抗（抗EGFR單克隆抗體）相似；盡管DT-IgGs在血清中的半衰期較短，但在肺癌和頭頸癌的小鼠異種移植模型中表現(xiàn)出與貝伐單抗相當(dāng)?shù)寞熜В?7］。MEHD7945A（Duligotuzumab）是一種人源化EGFR/HER-3 雙特異性IgG1 抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合片段均能與EGFR和HER-3具有較高的親和力［98-99］，在抑制EGFR/HER-3信號(hào)傳導(dǎo)通路、腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞周期方面比西妥昔單抗和抗HER-3 抗體聯(lián)合治療的效果更顯著；還能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和控制凋亡細(xì)胞死亡的修復(fù)過(guò)程，限制EGFR抑制劑耐藥細(xì)胞對(duì)輻射的交叉耐藥［100］。MEHD7945A 聯(lián)合放療對(duì)肺癌和頭頸癌細(xì)胞系及小鼠異種移植模型均具有良好的抗腫瘤作用［98］。與抗HER 單特異性抗體相比，MEHD7945A 在多種腫瘤模型中均表現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)，體現(xiàn)了雙靶向抑制EGFR 和HER-3的重要性。目前，MEHD7945 A正在一項(xiàng)用于上皮性實(shí)體腫瘤的臨床研究中，臨床Ⅰ期研究結(jié)果表明，MEHD7945A與順鉑/5-氟胞嘧啶或卡鉑/紫杉醇聯(lián)合治療復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性HNSCC患者展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用，但同時(shí)也增加了對(duì)患者的毒副作用［101］；另一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、開(kāi)放性臨床Ⅱ期研究表明，在針對(duì)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性HNSCC 患者的治療中，MEHD7945A 與西妥昔單抗的療效并無(wú)明顯差異［102］。Croasdale 等［103］報(bào)道了同時(shí)靶向IGF-1R 和EGFR 的雙特異性抗體。結(jié)果顯示，IGF-1R-EGFR 雙特異性抗體能夠阻斷IGF-1R 和EGFR 信號(hào)通路介導(dǎo)的ADCC 作用，有效抑制H322M 和H460M2 腫瘤細(xì)胞的增殖；在BxPC3 和H322M 小鼠皮下移植模型中，IGF-1REGFR雙特異性抗體比抗IGF-1R和EGFR單特異性抗體聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效果更強(qiáng)。

神經(jīng)氈蛋白1（neuropilin-1，NRP1）是一種非酪氨酸激酶受體，作為其他細(xì)胞表面受體（如整合素）的輔助受體，在多種實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管生成中起關(guān)鍵作用。此外，NRP1 的過(guò)表達(dá)與NSCLC 的不良預(yù)后相關(guān)［104-106］。Ctx-TPP11 是一種由NRP1 靶向肽TRR11 與西妥昔單抗重鏈的C 末端融合而成的雙特異性抗體，通過(guò)與NRP1 結(jié)合而被細(xì)胞內(nèi)化，抑制與NSCLC 耐藥相關(guān)信號(hào)通路PI3K-Akt 和RalBTBK1 的傳導(dǎo)，有效逆轉(zhuǎn)了西妥昔單抗在NSCLC KRAS 突 變 型 腫 瘤 細(xì) 胞 中 的 耐 藥［107］。RANK（TNFRSF11a）和RANKL（TNFSF11）分別是腫瘤壞死因子受體和配體超家族的成員，與CD40 和CD40L 同源性最高［108］。研究表明，在不同的小鼠腫瘤模型（如肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌等）中，抗RANKL 單克隆抗體與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如抗PD-1、CTLA-4 或PD-L1 的單克隆抗體）聯(lián)合治療可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［109-111］。在腫瘤耐藥微環(huán)境中，靶向RANKL 和PD-1 的雙特異性抗體比單特異性抗體聯(lián)合治療的抗腫瘤效果更為顯著［112］。

3.4 雙特異性抗體在其他腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

常規(guī)化療對(duì)晚期直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者的生存率沒(méi)有明顯改善。由嵌合的抗CD133 單克隆抗體AC133 和人源化OKT3 單鏈組成的非對(duì)稱(chēng)雙特異性抗體MS133 對(duì)CD133 和CD3具有雙重抗原結(jié)合特異性。MS133 對(duì)高表達(dá)CD133 的CRC 細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用，對(duì)低表達(dá)CD133 的CRC 細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用；在非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中，MS133 能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延緩發(fā)病進(jìn)程，且無(wú)明顯的毒副作用［113］。靶向EGFR和IGF-1R 的雙特異性IgG 樣抗體EI-04 能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞EGFR 和IGF-1R 的磷酸化，阻斷AKT和ERK 下游通路的激活，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。在人胰腺癌BxPC3細(xì)胞株的小鼠異種移植模型中，EI-04 表現(xiàn)出比抗EGFR 或抗IGF-1R 單克隆抗體以及兩種單克隆抗體聯(lián)合治療更強(qiáng)的抗腫瘤作用［114］。MM-141（Istiratumab）是一種靶向IGF-1R 和HER-3 的雙特異性抗體，通過(guò)抑制AKT 的磷酸化而促進(jìn)IGF-1R和HER-3 蛋白的降解，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性［115］。一項(xiàng)多中心、隨機(jī)雙盲、安慰劑對(duì)照Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究表明，相比于白蛋白結(jié)合型紫杉醇和吉西他濱的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，MM-141與標(biāo)準(zhǔn)化療方案聯(lián)合對(duì)轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的治療效果并未有明顯改善［116］。

目前，大多數(shù)針對(duì)于實(shí)體瘤治療的雙特異性抗體在臨床前研究階段已取得良好的抗腫瘤效果，但在臨床試驗(yàn)階段的治療效果尚未達(dá)到預(yù)期。簡(jiǎn)化雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)和制備流程，利用合成生物學(xué)等方法對(duì)雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整和改進(jìn)，建立一個(gè)強(qiáng)大的雙特異性抗體設(shè)計(jì)及生產(chǎn)制作平臺(tái)，或可成為增強(qiáng)雙特異性抗體在腫瘤免疫治療中的療效，以及改善藥物對(duì)患者的毒副作用的關(guān)鍵。

4 基于納米技術(shù)設(shè)計(jì)的雙特異性抗體在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

近年來(lái)，納米技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注。納米治療技術(shù)可將特異性單克隆抗體、治療性藥物或顯影劑物理包埋或化學(xué)偶聯(lián)到納米載體上，形成功能化的納米顆粒，其優(yōu)勢(shì)在于：①納米顆粒具有較長(zhǎng)的循環(huán)能力，將蛋白質(zhì)的小分子片段連接到納米顆粒表面可以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，減少給藥頻率；②納米顆粒具有柔性的表面修飾能力，為表面偶聯(lián)多價(jià)抗體或多型抗體提供了平臺(tái)；③載有治療性藥物的納米顆?？梢栽鰪?qiáng)殺傷細(xì)胞的能力，展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用［117］。因此，在腫瘤免疫治療中應(yīng)用納米技術(shù)具有重要的意義。

目前，甲氧基聚乙二醇化納米顆粒（methoxy PEGylated nanoparticles，mPEG-NPs）越來(lái)越多地應(yīng)用于腫瘤成像和治療。有研究報(bào)道一種同時(shí)靶向mPEG 分子和EGFR 或HER2 分子的人源化雙特異性抗體（BsAbs）［118］，BsAbs 由人源化抗mPEG抗體的Fab 段與抗EGFR 或HER2 單鏈抗體融合而成。研究表明，BsAbs 與mPEG-NPs 簡(jiǎn)單混合后，在生理環(huán)境下，可有效介導(dǎo)多種mPEG-NPs 與EGFR+或HER+腫瘤細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合；當(dāng)mPEG-NPs負(fù)載阿霉素后，能顯著增強(qiáng)阿霉素對(duì)EGFR+或HER+腫瘤細(xì)胞的殺傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BsAbs 修飾的mPEG-NPs 在小鼠腫瘤中的積累量明顯增加，也顯著提高了載藥NPs對(duì)EGFR+的小鼠異種移植模型的抗腫瘤活性。在此基礎(chǔ)上研發(fā)的一種人源化雙特異性抗體（mPEG×HER2）可用于修飾脂質(zhì)體阿霉素（PEGylated liposomal doxorubicin，PLD），組成HER2 靶向脂質(zhì)體αHER2/PLD，增強(qiáng)PLD 對(duì)過(guò)表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞的特異性、細(xì)胞內(nèi)化和抗腫瘤活性［119］。結(jié)果顯示，αHER2/PLD 對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞株有顯著的細(xì)胞毒作用；在荷瘤小鼠中，與無(wú)靶向PLD 相比，αHER2/PLD 在小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞核中有效積累阿霉素，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。該團(tuán)隊(duì)也利用mPEG×HER2 雙特異性抗體修飾多種納米探針（如超順磁性氧化鐵納米顆粒、量子點(diǎn)和膠體金納米粒子等），用于增強(qiáng)HER2+腫瘤多模成像的靈敏度和對(duì)比度強(qiáng)度［120］。對(duì)HER2+乳腺癌小鼠模型的成像結(jié)果表明，相比于無(wú)靶向的納米探針，經(jīng)雙特異性抗體修飾后的脂質(zhì)體納米探針（αHER2/Lipo-DiR）和超順磁性氧化鐵納米顆粒（αHER2/SPIO）能有效靶向HER+腫瘤，并增加納米探針在腫瘤中的積累。

眾所周知，所有IgG 抗體中Fc 段的結(jié)構(gòu)高度一致，且抗IgG（Fc 段特異性）抗體［anti-IgG（Fc specific） antibody，αFc］能夠通過(guò)非共價(jià)相互作用特異性識(shí)別并結(jié)合任何包含F(xiàn)c 段的單克隆抗體［121-122］。據(jù)此，有研究組將αFc 偶聯(lián)到納米載體的表面，構(gòu)筑了一種通用的“抗體固定平臺(tái)”（αFc-NP）。研究證實(shí)，αFc-NP 可以方便有效地固定兩種類(lèi)型的單克隆抗體，經(jīng)簡(jiǎn)單物理混合制備出新型雙特異性納米抗體，但不會(huì)損害原來(lái)的單克隆抗體的抗原結(jié)合能力，命名為“免疫調(diào)節(jié)納米 適 配 子”（immunomodulating nano-adaptors，imNAs）［123］。研究人員以免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗PD1抗體αPD1 和抗PDL1 抗體αPDL1 為模型制備了一種納米適配子imNAsαPD1&αPDL1。研究結(jié)果表明，與αPD1 和αPDL1 單克隆抗體相比，imNAsαPD1&αPDL1能有效促進(jìn)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。不同于復(fù)雜的分子設(shè)計(jì)和基因工程，該研究為雙/多特異性抗體的設(shè)計(jì)提供了一種新的更為簡(jiǎn)便的方法。

將生物素標(biāo)記的抗CD20和抗CD3單克隆抗體偶聯(lián)到鏈霉親和素修飾的超小Fe3O4納米顆粒表面，可構(gòu)建一種水合動(dòng)力學(xué)尺寸為30 nm 的雙特異性納米平臺(tái)（bi-specific nanoplatform，BSNP）［124］。研究表明，相比于臨床應(yīng)用的釓（Gd）對(duì)比劑，所合成的BSNP 具有更好的磁共振成像能力。在細(xì)胞水平上，BSNP 可以靶向CD20+的人Burkitt 淋巴瘤細(xì)胞Raji，同時(shí)招募并重定向T 細(xì)胞，增強(qiáng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的體外細(xì)胞殺傷作用；在動(dòng)物水平上，BSNP能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)NHL小鼠異種移植瘤模型的生存期。模塊化設(shè)計(jì)的BSNP提供了一種潛在、有效的腫瘤免疫治療策略，后續(xù)可通過(guò)結(jié)合不同的單克隆抗體構(gòu)建多種雙/多特異性納米平臺(tái)，以期增強(qiáng)腫瘤治療效果。Ding等［125］設(shè)計(jì)了一種靶向EGFR1 和HER2 的雙功能抗體MaAbNA。研究結(jié)果顯示，MaAbNA 可顯著抑制過(guò)表達(dá)EGFR1 和HER2 的乳腺癌細(xì)胞增殖，且對(duì)低表達(dá)EGFR1 和HER2 的細(xì)胞具有較弱的毒性。為了增強(qiáng)MaAbNA 的抗腫瘤作用，該團(tuán)隊(duì)利用聚乙二醇接枝共聚物（PEG2000）將MaAbNA 和阿霉素（Adriamycin，ADM）偶聯(lián)形成復(fù)合抗癌藥物MaAbNA-PEG2000-ADM，該復(fù)合藥物具有比單獨(dú)ADM 或MaAbNA以及西妥昔單抗或曲妥珠單抗更強(qiáng)的抗腫瘤效果。MaAbNA 及其衍生物MaAbNA-PEG2000-ADM 的抗腫瘤效果在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。Xu 等［126］研發(fā)了一種以PEG 化的中空介孔釕納米顆粒（hollow mesoporous ruthenium nanoparticles，HMRu NPs）為載體，負(fù)載抗腫瘤熒光復(fù)合物（［Ru（bpy）2（tip）］2+，RBT）和抗CD16 和抗癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA） 的雙特異性抗體SS-Fc 形成偶聯(lián)物HMRu@RBT-SS-Fc。結(jié)果表明，HMRu@RBT-SSFc 能有效靶向并殺傷過(guò)表達(dá)的癌胚抗原的結(jié)直腸癌細(xì)胞；在CT26-CEA結(jié)直腸癌小鼠皮下移植瘤模型中，HMRu@RBT-SS-Fc 通過(guò)在腫瘤部位的大量積累和重定向免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有效殺傷。

Alhallak 等［127］設(shè)計(jì)了一類(lèi)基于納米顆粒的雙特異性T 細(xì)胞銜接器（nanoparticle-based bispecific T-cell engagers，nanoBiTEs），即在脂質(zhì)體上偶聯(lián)靶向T 細(xì)胞的抗CD3 單克隆抗體和靶向腫瘤抗原（如CD20、BSMA、CS1 和CD38）的單克隆抗體。研究人員也開(kāi)發(fā)了一種基于納米顆粒的多特異性T細(xì)胞銜接器（CD3/BCMA/CS1/CD38 nanoMuTEs），即在脂質(zhì)體上同時(shí)偶聯(lián)靶向T細(xì)胞的抗CD3單克隆抗體和靶向不同腫瘤抗原的多種單克隆抗體。研究結(jié)果表明，nanoBiTEs和nanoMuTEs的半衰期均在60 h 左右，因此不需要連續(xù)注射，1 周注射1 次即可在體內(nèi)外維持較好的治療效果；而且相比于nanoBiTEs，靶向多種腫瘤抗原的nanoMuTEs 在細(xì)胞和動(dòng)物水平中對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷效果更為顯著，其優(yōu)勢(shì)在于nanoMuTEs 不會(huì)導(dǎo)致單個(gè)腫瘤抗原的下調(diào)（或丟失），能有效防止因抗原丟失的腫瘤逃逸過(guò)程。細(xì)胞核蛋白Ki-67 在快速增殖的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，它也是在腫瘤患者的活組織檢查中一種確定的可評(píng)估細(xì)胞增殖活性的預(yù)后指標(biāo)［128］。利用納米技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子過(guò)程進(jìn)行光學(xué)控制，具有較高的空間和時(shí)間精度，也能同時(shí)結(jié)合靶向和有效殺傷細(xì)胞的機(jī)制，有望為腫瘤靶向治療提供新的思路和方法。Wang 等［129］設(shè)計(jì)了一種針對(duì)細(xì)胞表面蛋白EGFR 和細(xì)胞核蛋白Ki-67 的雙重靶向策略，該策略能選擇性地靶向過(guò)表達(dá)EGFR 和Ki-67 的腫瘤細(xì)胞并利用光控有效殺傷細(xì)胞?？笶GFR 抗體西妥昔單抗與經(jīng)聚乙二醇修飾后的脂質(zhì)體通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成靶向EGFR 的免疫脂質(zhì)體，在690 nm 光照下，與細(xì)胞共孵育的光敏劑卟啉衍生物（benzoporphyrin derivative，BPD）能觸發(fā)免疫脂質(zhì)體和細(xì)胞核內(nèi)體膜的破壞，即免疫脂質(zhì)體能被EGFR+細(xì)胞有效攝取，釋放異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗Ki-67抗體TuBB-9；之后在490 nm 光照下，激活FITC標(biāo)記的TuBB-9，導(dǎo)致Ki-67 蛋白失活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，該雙重靶向策略對(duì)過(guò)表達(dá)EGFR和Ki-67 的腫瘤細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞HeLa 和人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-5）具有高度選擇性，能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，且對(duì)正常人成纖維細(xì)胞沒(méi)有選擇特異性。間皮素（mesothelin，MSLN）是一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，在正常細(xì)胞上弱表達(dá)，在三陰性乳腺癌中高表達(dá)，因此成為一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)［130］。研究人員設(shè)計(jì)了一種抗MSLN 的納米抗體（nanobody）和抗CD16 的納米抗體組成的與Fab段結(jié)構(gòu)相似的雙特異性抗體MesobsFab［131］。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MesobsFab 能有效招募NK 細(xì)胞定向到MSLN+三陰性乳腺癌細(xì)胞系中，介導(dǎo)ADCC作用有效殺傷細(xì)胞并降低細(xì)胞的侵襲性。在三陰性乳腺癌小鼠異種移植模型中，MesobsFab 能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上，基于納米顆粒的雙特異性抗體制劑可以更靈活地構(gòu)建多價(jià)或多臂結(jié)構(gòu)，在維持良好的抗腫瘤作用的同時(shí)有效延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。因此，納米技術(shù)在提高療效、增加轉(zhuǎn)化潛能甚至在現(xiàn)有腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新的治療策略等方面均發(fā)揮著獨(dú)特的作用。

5 總結(jié)和展望

臨床中雖然可以根據(jù)疾病的發(fā)病部位將患者統(tǒng)一歸類(lèi)，但在患有同一類(lèi)型腫瘤患者的體內(nèi)所檢測(cè)到的腫瘤特異性標(biāo)志物的表達(dá)可能存在較大差異，因此，設(shè)計(jì)個(gè)性化/精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療方案是解決腫瘤異質(zhì)性的有效方法。近年來(lái)，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，成為許多實(shí)體腫瘤和惡性血液腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療手段。雙特異性抗體作為新一代的腫瘤治療策略，因其獨(dú)特的作用機(jī)制而備受關(guān)注。一般來(lái)說(shuō)，雙特異性抗體比單特異性抗體聯(lián)合的治療效果更好，主要是因?yàn)殡p特異性抗體在與腫瘤細(xì)胞高度結(jié)合的同時(shí)能夠招募并重定向免疫效應(yīng)細(xì)胞，選擇性攻擊并裂解腫瘤細(xì)胞。經(jīng)人工設(shè)計(jì)的雙特異性抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向更為精準(zhǔn)，有望降低與治療相關(guān)的不良反應(yīng)。

雖然目前僅有少數(shù)雙特異性抗體獲得了上市批準(zhǔn)，但有若干新的雙特異性抗體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并取得了令人鼓舞的初步結(jié)果，它們不僅應(yīng)用于腫瘤免疫治療，而且還可用于治療其他疾?。?1，132］。雙特異性抗體的設(shè)計(jì)具有多種形式，如BiTEs、DART、同二聚體“杵臼結(jié)構(gòu)”抗體和三功能性雙特異性抗體等。未來(lái)對(duì)雙特異性抗體的設(shè)計(jì)和形式可能會(huì)整合多種功能，以靶向兩個(gè)或更多的腫瘤抗原，同時(shí)連接T細(xì)胞和輔助細(xì)胞形成人工免疫突觸。然而，在雙特異性抗體設(shè)計(jì)及構(gòu)建中仍存在諸多挑戰(zhàn)，比如提高特異性、敏感性和穩(wěn)定性、增加其半衰期以及選擇合適的靶抗原以限制腫瘤外毒性等［133-134］。盡管利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)在制備重組的雙特異性抗體方面已進(jìn)行了較大優(yōu)化，但在雙特異性抗體制備的過(guò)程中想要同時(shí)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)和低成本的目標(biāo)仍需更多努力。為了解決上述問(wèn)題，研究人員可綜合多種方法（如藥物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、合成生物學(xué)、生物化學(xué)和計(jì)算化學(xué)等）來(lái)探索復(fù)雜的、相互關(guān)聯(lián)的分子信號(hào)通路，這將有助于設(shè)計(jì)雙特異性抗體，從而有效阻斷致癌途徑。同時(shí)，將系統(tǒng)生物學(xué)和在全基因組范圍內(nèi)研究藥物作用的系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)合使用，能夠促進(jìn)更多新型雙特異性抗體的研發(fā)。

此外，納米技術(shù)介導(dǎo)的靶向治療策略在腫瘤治療中的應(yīng)用也已經(jīng)成為一大研究熱點(diǎn)，將多種形式的雙特異性抗體與納米載體通過(guò)簡(jiǎn)單的混合即可形成功能化的納米顆粒，可以在一定程度上克服傳統(tǒng)的全長(zhǎng)單克隆抗體與納米藥物偶聯(lián)物的不穩(wěn)定性及非特異性結(jié)合，改善療效并延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間等［135］。

綜上所述，雙/多特異性抗體可能在不久的將來(lái)成為一類(lèi)有效且廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療性藥物，也可以進(jìn)一步地與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、IDO通路抑制劑（indoleamine 2，3-dioxygenase，吲哚胺2，3-雙加氧酶）或疫苗等其他療法聯(lián)合應(yīng)用。