合成生物學(xué)與熒光成像技術(shù)

武偉紅，李煒，張先恩，崔宗強(qiáng)

（1 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，安徽 合肥 230026； 2 中國科學(xué)院武漢病毒研究所，病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071； 3 中國科學(xué)院生物物理研究所，生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

合成生物學(xué)作為新興領(lǐng)域，自概念誕生以來，多個(gè)國家、機(jī)構(gòu)和國際組織將其評(píng)價(jià)為未來的顛覆性技術(shù)［1-2］。合成生物學(xué)技術(shù)是基于生物反應(yīng)本質(zhì)對(duì)生物組件進(jìn)行改造，或者從頭設(shè)計(jì)并構(gòu)建出具有生物活性和特定生理功能的生物元件［3-7］。利用合成生物學(xué)技術(shù)開發(fā)熒光材料，發(fā)展生物分子定點(diǎn)標(biāo)記方法［8-9］，對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定生物分子進(jìn)行高靈敏高分辨成像與示蹤研究，能夠直觀精準(zhǔn)地揭示細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵分子事件及機(jī)制［10-11］。傳統(tǒng)獲得熒光材料的方法依賴于化學(xué)合成，常需要高溫、高壓、電離、有毒溶劑等條件，存在成本高、耗材大、環(huán)境污染等問題。而且，化學(xué)合成的外源熒光材料用于生物分子標(biāo)記與成像，常存在生物相容性差、標(biāo)記效率低、難以精準(zhǔn)控制等問題［12-13］。而通過合成生物學(xué)構(gòu)建細(xì)胞工廠，直接在細(xì)胞內(nèi)合成特定熒光材料或探針［14-15］，不僅可以有效避免傳統(tǒng)合成方法中的劇烈條件和使用易燃易爆原料，還可以賦予這些材料或探針優(yōu)越的生物相容性和穩(wěn)定性［16-18］。通過合成生物學(xué)技術(shù)，也可以高效、精準(zhǔn)和靈活地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因改造，對(duì)蛋白質(zhì)［19］或核酸進(jìn)行定點(diǎn)定量特異性標(biāo)記［20］?；诤铣缮飳W(xué)發(fā)展熒光探針與標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合高靈敏、高分辨成像和實(shí)時(shí)示蹤［21］等手段，高效、精準(zhǔn)成像細(xì)胞和活體內(nèi)生物分子，深入解析生命活動(dòng)過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的生理狀態(tài)檢測(cè)和對(duì)疾病的預(yù)防診斷和治療［13，22-23］。本文將主要總結(jié)近年來合成生物學(xué)技術(shù)在細(xì)胞生物熒光成像方面的應(yīng)用，并對(duì)該領(lǐng)域關(guān)鍵科學(xué)問題進(jìn)行探討和展望。

1 利用合成生物學(xué)技術(shù)合成新型熒光材料

針對(duì)不同的成像目標(biāo)與模型，基于合成生物學(xué)技術(shù)，建立材料生物合成新方法［24］，可以開發(fā)性能優(yōu)良的熒光材料和探針。熒光成像最常見的熒光材料包括有機(jī)熒光染料分子、熒光蛋白和熒光納米材料等［25］。其中，熒光納米材料如量子點(diǎn)等具有優(yōu)異的光學(xué)性能［26-27］，在生物分子標(biāo)記與成像中越來越廣泛被應(yīng)用［28-31］。合成生物學(xué)與納米生物技術(shù)交叉融合，可以在活細(xì)胞中原位合成新型熒光納米材料［32-34］。這些生物合成的新型熒光納米材料具有穩(wěn)定性高、生物相容性好的特點(diǎn)，易于進(jìn)行后續(xù)生物修飾和標(biāo)記。與生物礦化過程不同，生物合成熒光納米材料是利用特定的生化反應(yīng)途徑得到的中間產(chǎn)物為制備無機(jī)晶體所需的前體，轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的空間，實(shí)現(xiàn)無機(jī)納米晶體的成核、生長及自組裝［35］。活細(xì)胞合成納米雜合生物活性材料是利用活細(xì)胞作為反應(yīng)器：將細(xì)胞內(nèi)高效專一的生物化學(xué)反應(yīng)過程應(yīng)用于納米雜合生物活性材料的合成，將不同途徑的合成反應(yīng)過程在細(xì)胞進(jìn)行操作耦合，使得細(xì)胞中不同時(shí)空的反應(yīng)通過精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)按照設(shè)計(jì)目的進(jìn)行。例如：趨磁細(xì)菌［36-38］利用細(xì)胞中的Fe3+部分還原形成Fe2+，并在鐵蛋白中快速生成多種晶型的磁性納米顆粒，用于趨磁細(xì)菌的核磁共振活體示蹤成像和磁熱治療。

量子點(diǎn)作為一種熒光納米材料，在可視化熒光成像研究中的優(yōu)勢(shì)尤為突出［39-41］。量子點(diǎn)具有寬的激發(fā)光譜和窄的發(fā)射光譜，且發(fā)射光譜根據(jù)粒徑大小可控。相對(duì)于有機(jī)染料分子和熒光蛋白，量子點(diǎn)具有光穩(wěn)定性好、不易漂白、表面可以進(jìn)行各種特異性的化學(xué)修飾和偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)。但是，化學(xué)合成的量子點(diǎn)往往生物相容性較差［42-44］，鑒于此，Cui 等［45］在酵母內(nèi)可控合成不同發(fā)光性能的CdSe 量子點(diǎn)（圖1）：其利用在活細(xì)胞反應(yīng)器中或通過耦合不同的生物化學(xué)反應(yīng)途徑構(gòu)建準(zhǔn)生物體系，發(fā)展出“時(shí)-空耦合”調(diào)控新策略，從而合成納米材料，并通過置換參與CdSe 量子點(diǎn)合成的關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了可在活細(xì)胞中對(duì)CdSe 量子點(diǎn)的合成產(chǎn)率進(jìn)行調(diào)節(jié)。但存在的缺點(diǎn)是在其合成過程包含細(xì)胞洗脫、破碎、碎片去除等一系列的操作，過程煩瑣復(fù)雜。2012 年，該團(tuán)隊(duì)［46］基于準(zhǔn)生物合成Ag2Se量子點(diǎn)并用于裸鼠近紅外活體成像。Ag2Se 量子點(diǎn)合成關(guān)鍵步驟在于還原性硒前體和銀前體的制備。研究人員用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）［47-49］監(jiān)測(cè)還原性硒前體的設(shè)計(jì)過程，通過耦合Na2SeO3還原與丙氨酸和銀離子結(jié)合兩個(gè)生化反應(yīng)過程，構(gòu)建準(zhǔn)生物反應(yīng)體系完成水相合成Ag2Se的過程。這種合成策略避免了傳統(tǒng)的高溫、高壓過程，無需由有機(jī)相到水相轉(zhuǎn)移即可應(yīng)用于生物成像。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Ag2Se光穩(wěn)定性好，在體內(nèi)近紅外熒光穿透性可減少組織和血液自身熒光的影響，與傳統(tǒng)量子點(diǎn)相比對(duì)細(xì)胞毒性更小。這種新型小尺寸的熒光納米材料在生物成像方面具有良好的應(yīng)用前景。但目前，對(duì)于量子點(diǎn)生物與準(zhǔn)生物合成，特別是對(duì)于小尺寸的近紅外量子點(diǎn)，其尺寸的精確控制及修飾可操作性還比較低。進(jìn)一步對(duì)生物合成量子點(diǎn)的核形成與生長過程的控制以及對(duì)其表面進(jìn)行修飾研究，將更有利于其在生物成像中的應(yīng)用。

圖1 CdSe在酵母細(xì)胞中的可控合成［45］Fig.1 Controllable CdSe synthesis in yeast cells[45]

此外，H?ckner 等［50］將蚯蚓置于含CdCl2和Na2TeO3的土壤環(huán)境中，利用蚯蚓對(duì)重金屬的解毒能力生產(chǎn)出可產(chǎn)生綠色熒光的量子點(diǎn)。蚯蚓通過金屬依賴性硫蛋白，將重金屬轉(zhuǎn)移到嗜氯細(xì)胞組織合成納米晶體CdTe量子點(diǎn)，并在CdTe量子點(diǎn)表面添加聚乙二醇可進(jìn)一步應(yīng)用于巨噬細(xì)胞成像（圖2）。利用蚯蚓作為反應(yīng)器在嗜氯細(xì)胞中合成CdTe 存在的問題是形成的量子點(diǎn)的成像存在自熒光干擾，在不同種類蚯蚓中背景干擾程度不同，并且生長形成的CdTe 量子點(diǎn)粒徑大小單一不可調(diào)控。Sweeney 等［51］用含氯化鉻和硫化鈉的培養(yǎng)基培育大腸桿菌可高效生產(chǎn)出CdS 納米晶體。該團(tuán)隊(duì)證明納米晶體的合成是在細(xì)菌內(nèi)部，CdS納米晶體主要在靜止期開始合成，在對(duì)數(shù)生長期前中期形成大量的CdS 納米晶體沉淀，而非在外部合成之后運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌內(nèi)部，表明了大腸桿菌具有誘導(dǎo)納米晶體合成的能力，這對(duì)于研究細(xì)菌生長階段對(duì)晶體合成的可控調(diào)節(jié)具有重要作用。其不足是CdS納米晶體合成過程與沉淀積累對(duì)于細(xì)菌的生長階段具有極高依賴性。Bao 等［52］也通過大腸桿菌成功合成CdTe 量子點(diǎn)。與前述生物合成方法不同的是，該CdTe 量子點(diǎn)的合成并不直接依賴于細(xì)菌本身，而是通過細(xì)菌分泌蛋白輔助合成，分泌蛋白與可溶解的納米晶體核結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)小的納米晶體溶解，之后結(jié)合蛋白可以與更大的納米晶體結(jié)合，將CdTe 成分傳遞從而促進(jìn)了納米晶體的成長。這種環(huán)境友好的細(xì)菌胞外合成方法可以在不需要細(xì)胞洗滌與破碎的前提下合成出光穩(wěn)定性較好的量子，可應(yīng)用于體外細(xì)胞成像。

圖2 在蚯蚓細(xì)胞中CdTe的生物合成［50］Fig.2 CdTe biosynthesis in earthworm cells[50]

這些納米材料的合成新策略能夠提供更多的機(jī)會(huì)調(diào)控納米材料的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米材料性能的控制。目前利用活細(xì)胞及準(zhǔn)生物體系的“時(shí)-空耦合”調(diào)控策略，除了可以合成CdSe［53-54］、CdTe［55］、CdS［56-57］量子點(diǎn)之外，還可控合成出生物相容性好的金納米粒子、金團(tuán)簇、近紅外量子點(diǎn)等熒光納

米材料，并且將此原理擴(kuò)展已成功構(gòu)建了由酶、輔酶、氨基酸、肽等組成的“準(zhǔn)生物體系”［58］。通過該方法得到的近紅外Ⅱ區(qū)［59-61］Ag2S［62-63］、Ag2Se和AgAuSe 量子點(diǎn)［64-65］，具有低毒性、耐光漂白、熒光穿透深等特點(diǎn)，可用于對(duì)病毒感染過程的活體成像等研究。此外，相較于傳統(tǒng)的修飾方法，活細(xì)胞內(nèi)原位合成納米雜合材料的方法依賴于特定的生物學(xué)過程，可以通過基因技術(shù)、生化反應(yīng)等對(duì)活性材料的合成進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。如Park 等［66］利用基因編輯技術(shù)將其他物種的植物螯合肽合成酶和金屬硫蛋白的基因引入大腸桿菌，構(gòu)建了合成金屬納米顆粒的微生物工廠，將各種金屬與大腸桿菌混合培養(yǎng)，合成了多種量子點(diǎn)和其他金屬納米顆粒（圖3），并且通過改變金屬離子濃度能夠?qū){米顆粒大小進(jìn)行可控調(diào)節(jié)。當(dāng)然，雖然已在重組微生物體內(nèi)合成了多種金屬納米顆粒，但是微生物合成金屬鈉米粒子的機(jī)制仍有待深入解析。

圖3 大腸桿菌細(xì)胞中合成CdSeZn、PrGd納米晶體［66］Fig.3 CdSeZn and PrGd nanocrystals synthesized in E.coil cells[66]

2 合成生物學(xué)與生物分子標(biāo)記技術(shù)

胞內(nèi)活性材料的合成和后續(xù)的熒光成像過程都需要生物分子修飾，利用合成生物學(xué)技術(shù)，可以對(duì)特定靶標(biāo)分子進(jìn)行高效、特異或多重標(biāo)記，為分子標(biāo)記提供新的技術(shù)和方法。本文將主要介紹蛋白和核酸分子的熒光標(biāo)記。

2.1 合成生物學(xué)應(yīng)用于蛋白分子標(biāo)記

熒光分子或熒光納米材料需要通過特定策略與目標(biāo)蛋白分子進(jìn)行鏈接，從而實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記與成像。這些策略中，鏈接過程主要采用：熒光非天然氨基酸的摻入而合成熒光基團(tuán)、自標(biāo)記酶衍生物與熒光基團(tuán)結(jié)合后與目標(biāo)蛋白融合、利用外源性酶催化小肽連接熒光基團(tuán)與目標(biāo)蛋白融合等［67-69］。非天然氨基酸可以將不同功能基團(tuán)通過遺傳密碼擴(kuò)展而引入到需要標(biāo)記蛋白的特定位置［70］。例如熒光氨基酸：2-氨基酸-3-［5-（二甲氨基）萘-1-磺酰胺］-丙酸，可以利用琥珀色標(biāo)簽密碼子和相應(yīng)的正交tRNA/氨基?；鵷RNA 合成酶對(duì)基因進(jìn)行編碼。Summerer等［71］將這種熒光氨基酸用來標(biāo)記超氧化物歧化酶，用于觀察在鹽酸胍存在下的蛋白質(zhì)折疊過程。這類熒光氨基酸可以直接用于配體-抗體結(jié)合的相互作用，酶催化或調(diào)控中涉及的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾等研究。此外有可能將這種方法擴(kuò)展到熒光量子產(chǎn)率更高或發(fā)射波長更長的氨基酸，并將這種方法直接應(yīng)用于細(xì)胞成像等。病毒蛋白的熒光標(biāo)記也是合成生物學(xué)在蛋白分子標(biāo)記技術(shù)方面的重要組成部分。AP標(biāo)簽是一段由15個(gè)氨基酸GLNDIFEAQKIEWHE組成的短肽，它能夠被生物素連接酶（BirA）催化發(fā)生生物素修飾。Li 等［72］利用鏈霉親和素與生物素間的特異性相互作用將鏈酶親和素偶聯(lián)的QD特異性地結(jié)合到HIV-1 病毒的Vpr 上，實(shí)現(xiàn)了Vpr在胞內(nèi)的量子點(diǎn)偶聯(lián)，獲得了病毒錐形核心內(nèi)包裝量子點(diǎn)的艾滋病毒顆粒。進(jìn)一步，他們還建立了通過細(xì)胞輔助的病毒包裝量子點(diǎn)的新技術(shù)［73］，將基質(zhì)蛋白與BAP 標(biāo)簽融合，用量子點(diǎn)對(duì)病毒基質(zhì)蛋白MA 進(jìn)行了熒光標(biāo)記。利用量子點(diǎn)的高亮度、耐漂白等優(yōu)點(diǎn)（見表1中幾種不同熒光材料的性能參數(shù)比較），可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子或單個(gè)病毒進(jìn)行標(biāo)記和長時(shí)間實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤。2019年，Qin等［77］利用量子點(diǎn)納米材料，結(jié)合合成生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了含有特異識(shí)別病毒基因組或者病毒外殼蛋白標(biāo)簽的熒光量子點(diǎn)，通過生物素鏈霉素親和素反應(yīng)，對(duì)病毒顆粒的遺傳物質(zhì)或者蛋白外殼進(jìn)行定點(diǎn)改造，獲得了量子點(diǎn)標(biāo)記的多色流感病毒顆粒，用于解析單個(gè)流感病毒顆粒IAV的脫殼過程。

表1 不同熒光材料性能參數(shù)［74-76］Tab.1 Properties of different fluorescent materials[74-76]

基于合成生物學(xué)技術(shù)，可以對(duì)熒光蛋白進(jìn)行拆分改造，構(gòu)建新型熒光蛋白分子標(biāo)記技術(shù)：如熒光互補(bǔ)系統(tǒng)［78-79］。該系統(tǒng)是對(duì)熒光蛋白分子在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，之后產(chǎn)生2 個(gè)或3 個(gè)不能發(fā)射熒光的蛋白片段，將此蛋白分子片段分別與不同的目標(biāo)分子連接，如果目標(biāo)分子間能夠發(fā)生相互作用，那么蛋白-蛋白片段在空間上互補(bǔ)發(fā)出熒光。該系統(tǒng)可以在細(xì)胞和活體水平研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸的相互作用過程，包括蛋白質(zhì)寡聚化過程、G 蛋白偶聯(lián)受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及病毒-宿主的相互作用過程等［80］。Outeiro 等［81］利用熒光蛋白GFP，拆分構(gòu)建了雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)他們研究并發(fā)現(xiàn)Hsp70蛋白可以降低α-synuclein寡聚物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。近來，Chen 等［82］用iRFP 構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)用于HIV-1 病毒IN 蛋白和LEDGF/p75 的相互作用。此外，他們還構(gòu)建了熒光蛋白Venus 的三片段互補(bǔ)（TFFC）系統(tǒng)［83］，研究了HIV-1 病毒IN 蛋白、BAF 和LEDGF/p75 的三分子相互作用過程。首先，將可發(fā)光的Venus蛋白切割成3個(gè)不能發(fā)射熒光的片段構(gòu)建質(zhì)粒，分別和NFAT1、bJun 和bFos 編碼序列相連構(gòu)建了三分子互補(bǔ)系統(tǒng)。隨后，用切割的3個(gè)熒光蛋白片段和與HIV-1 病毒侵入細(xì)胞整合相關(guān)的IN、BAF 和LEDGF/p75 相連接形成三元復(fù)合物，通過IN、BAF 和LEDGF/p75 的相互作用可產(chǎn)生黃色熒光在細(xì)胞中定位［圖4（a）］，研究了IN、BAF和LEDGF/p75與宿主染色體相互作用并發(fā)現(xiàn)了BAF 與HIV-1的潛伏期有重要關(guān)系。Chen等［84］還利用具有光激活和光轉(zhuǎn)換特性的mIrisFP 熒光蛋白，成功構(gòu)建了三片段熒光互補(bǔ)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了蛋白-蛋白以及蛋白三聚體亞基間相互作用的超高分辨成像［圖4（b）］，空間分辨率可精確到40 nm，并且實(shí)現(xiàn)了G 蛋白三聚體亞基間相互作用的單分子水平成像，解析了G 蛋白αβγ異源三聚體與βγ異源二聚體在亞衍射細(xì)胞空間的不同分布模式，揭示了霍亂毒素導(dǎo)致αs亞基與βγ 異源二聚體亞基解離的動(dòng)態(tài)過程。當(dāng)然，目前雙/三分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)還存在一些缺點(diǎn)有待改進(jìn)，譬如常需要低溫處理、熒光亮度低信號(hào)弱、熒光互補(bǔ)難以實(shí)時(shí)反映分子間相互作用的動(dòng)態(tài)變化等。

圖4 Venus-TFFC系統(tǒng)與mIrisFP-TFFC系統(tǒng)成像［83-84］Fig.4 Schematic diagram for imaging of Venus-TFFC(a)and mIrisFP-TFFC systems(b)[83-84]

2.2 合成生物學(xué)應(yīng)用于核酸分子標(biāo)記

2012 年，Paige 等［85］開 發(fā) 了 名 為“Spinach”的RNA-熒光基團(tuán)復(fù)合物用于示蹤細(xì)胞內(nèi)的各種RNA。Spinach 是一類可以與GFP 蛋白媲美的新型熒光工具，它是根據(jù)熒光蛋白的形狀合成化學(xué)分子，通過插入人工RNA 序列構(gòu)建出發(fā)射不同熒光波長的“RNA-熒光基團(tuán)”復(fù)合物。該熒光基團(tuán)復(fù)合物具有熒光強(qiáng)度高、特異性強(qiáng)、無背景熒光干擾且無細(xì)胞毒性等特點(diǎn)。進(jìn)一步，Song 等［86］基于Spinach，開發(fā)出在結(jié)合目標(biāo)蛋白時(shí)可產(chǎn)生熒光的RNA 傳感器：將RNA 代謝物與Spinach 結(jié)合、折疊，在空間上莖鏈接近，折疊后的結(jié)構(gòu)與3，5-二氟-4-羥基苯亞甲基咪唑啉酮（DFHBI）結(jié)合使DFHBI 產(chǎn)生熒光，這種熒光復(fù)合體具有熒光強(qiáng)、可選擇性結(jié)合靶蛋白的能力，用于成像單個(gè)大腸桿菌中蛋白表達(dá)能力變化的動(dòng)態(tài)過程。但是DFHBI 的適配子存在光不穩(wěn)定的問題，會(huì)出現(xiàn)光誘導(dǎo)的異構(gòu)化產(chǎn)生熒光漂白，從而終止熒光反應(yīng)。該團(tuán)隊(duì)［87］在2017 年開發(fā)了新型核酸適配子“Corn”可以與3，5-二氟-4-羥基苯亞甲基咪唑啉酮-2-肟（DFHO）結(jié)合，并且Corn 具有抑制激發(fā)態(tài)DFHO 熒光衰變的能力，產(chǎn)生的熒光具有亮度高且光穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于直接測(cè)量細(xì)胞內(nèi)核糖核酸聚合酶反應(yīng)轉(zhuǎn)錄速率和調(diào)控機(jī)制動(dòng)態(tài)變化。Corn 與DFHO 結(jié)合的熒光基團(tuán)還可用于研究mTOR 抑制劑對(duì)細(xì)胞中RNA 聚合酶Ⅲ的抑制作用（圖5）。但需要注意的是，如果DFHO 濃度過高，會(huì)出現(xiàn)未結(jié)合的DFHO產(chǎn)生背景熒光干擾現(xiàn)象。

圖5 核酸適配子Corn熒光基團(tuán)成像單細(xì)胞中聚合酶活性示意圖［87］（轉(zhuǎn)入報(bào)告質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞加入熒光團(tuán)DFHO可產(chǎn)生黃色熒光，加入RNA聚合酶抑制劑放線菌素D后熒光消失）Fig.5 Schematic diagram for imaging polymerase activity in single cells through aptamer corn fluorophore[87](HEK293T cells transformed with the reporter plasmid could produce yellow fluorescence by adding fluorophore DFHO,but the fluorescence disappears after adding the RNA polymerase inhibitor actinomycin D.)

Filonov 等［88］開發(fā)了可快速生成熒光RNA 復(fù)合體的方法。利用熒光基團(tuán)選擇合適的適配子，然后將大量適配子在大腸桿菌中表達(dá)，再結(jié)合流式分選技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化合適的適配子。該方法改進(jìn)了傳統(tǒng)方法中需大量誘變和有效折疊的步驟，減少適配子篩選時(shí)間，并且能夠避免核酸熒光復(fù)合物的丟失，可快速鑒定出與細(xì)胞環(huán)境兼容、在細(xì)胞表達(dá)中折疊優(yōu)化的成像適配子。該團(tuán)隊(duì)用SELEX-FACS 方法鑒定出幾種新型高性能的熒光核糖核酸適配子，其中Broccoli具有分子量小、高折疊效率、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)RNA 熒光成像。此外，其折疊過程不依賴tRNA，成像功能不依賴鎂，避免了外源鎂對(duì)成像功能的干擾。但Broccoli 和Spinach 這些RNA 熒光材料不能用于探測(cè)RNA 聚合酶Ⅱ依賴的mRNA 轉(zhuǎn)錄。Braselmann 等［89］開發(fā)了一種新的應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA 成像的方法，以細(xì)菌核糖開關(guān)作為RNA 標(biāo)簽在結(jié)合一系列分子探針時(shí)可產(chǎn)生熒光，利用核糖開關(guān)與其天然配體鈷胺素（CbI）的選擇性和高親和性，與熒光基團(tuán)結(jié)合發(fā)生熒光猝滅的分子標(biāo)記技術(shù)（圖6）。該成像系統(tǒng)核糖核酸分子量小，光穩(wěn)定性較好，并且可以用于不同的核糖核酸分子成像，具有廣泛適用性。

圖6 細(xì)菌核糖開關(guān)原理及結(jié)構(gòu)［89］Fig.6 Diagram for the working principle and structure diagram of bacterial riboswitch[89]

近來，華東理工大學(xué)楊弋團(tuán)隊(duì)［76］基于合成生物學(xué)的基本原理，結(jié)合分子共同定向進(jìn)化技術(shù)，成功構(gòu)建出了一系列穩(wěn)定、亮度較高、背景干擾較低的高性能熒光RNA。這些熒光RNA是僅含40 余個(gè)核苷酸的RNA 分子片段，特異結(jié)合不發(fā)光的合成染料HBC 的一系列類似物，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。它們具有藍(lán)綠色、黃色、橙、紅等不同顏色，與五顏六色的辣椒相似，因此被命名為“Pepper”。通過基因編輯等手段，Pepper 可以插入到不同的天然非編碼RNA 與編碼RNA 分子序列中，進(jìn)而在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)各種RNA 進(jìn)行熒光標(biāo)記和實(shí)時(shí)成像，而不影響它們的轉(zhuǎn)錄、定位、翻譯、降解等正常代謝。利用該技術(shù)他們實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)不同種類RNA 的標(biāo)記和無背景成像（圖7）。

圖7 熒光RNA復(fù)合體在HeLa細(xì)胞成像［76］（合成染料HBC的一系列類似物與Pepper結(jié)合可發(fā)出不同顏色熒光，HBC類似物與Pepper結(jié)合物在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行成像，用空載細(xì)胞做對(duì)比，在共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡下進(jìn)行成像觀察）Fig.7 Schematic diagram for imaging of the fluorescent RNA complex in HeLa cells[76]（A series of analogues of synthetic dye HBC combined with Pepper can emit fluorescence with different colors.HBC analogues were combined with Pepper in HeLa cells and are compared with mock cells.Imaging observation is carried out with confocal microscope and two-photon microscope.）

3 合成生物學(xué)技術(shù)用于病毒熒光成像和示蹤

利用合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒顆粒特定蛋白或核酸進(jìn)行定點(diǎn)、定量標(biāo)記和多色多組分同時(shí)標(biāo)記，可以精細(xì)示蹤病毒顆粒的侵染過程與行為，揭示病毒感染宿主細(xì)胞的機(jī)制。例如，對(duì)于已造成近3300 萬人死亡的艾滋病毒［90］，病毒致病機(jī)制研究和藥物研發(fā)等仍有待突破。為了更好地研究病毒侵染機(jī)制，科研人員結(jié)合合成生物學(xué)與單病毒示蹤技術(shù)［91］，建立了多種病毒熒光標(biāo)記技術(shù)，用于病毒的標(biāo)記和示蹤，從而深入研究和闡明病毒侵染宿主細(xì)胞的時(shí)空動(dòng)態(tài)過程和機(jī)制。2009 年，Miyauchi 等［92］利用有機(jī)染料分子DID 和熒光蛋白GFP 對(duì)艾滋病毒粒子進(jìn)行雙標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)HIV 通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞并釋放遺傳物質(zhì)的過程。2016 年，Ma 等［93］動(dòng)態(tài)追蹤了HIV 病毒顆粒脫殼過程。利用金屬釕有機(jī)配合物（［Ru（phen）2（dppz）］2+）、雙砷染料（FlAsH/ReAsH）和熒光蛋白分別對(duì)病毒的基因組RNA、衣殼蛋白CA和基質(zhì)蛋白MA進(jìn)行熒光標(biāo)記，構(gòu)建了具有良好侵染能力的雙色和三色熒光標(biāo)記病毒顆粒。結(jié)合活細(xì)胞內(nèi)單顆粒示蹤技術(shù)，對(duì)單個(gè)艾滋病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)的解離脫殼過程進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、可視化分析，揭示了艾滋病毒在侵染宿主細(xì)胞后60～120 min，病毒基因組、衣殼蛋白和基質(zhì)蛋白以一個(gè)類似于“火箭升空逐級(jí)分離”的模式動(dòng)態(tài)順序解離。

熒光蛋白發(fā)光強(qiáng)弱依賴于蛋白的數(shù)量和其肽鏈的折疊結(jié)構(gòu)，單個(gè)熒光蛋白分子發(fā)光能力較弱，而大量熒光蛋白的摻入也會(huì)影響目標(biāo)分子和病毒的功能。同時(shí)，熒光蛋白也易光漂白，在進(jìn)行長時(shí)間標(biāo)記過程中熒光強(qiáng)度容易發(fā)生變化，且熒光蛋白具有較寬的發(fā)射光譜，不同熒光蛋白間發(fā)射光譜容易重疊，不利于對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行多重?zé)晒鈽?biāo)記。

鑒于此，科研人員通過合成生物學(xué)方法，建立了多種基于量子點(diǎn)納米材料的病毒熒光標(biāo)記技術(shù)，用于病毒顆粒的示蹤和檢測(cè)。Li等［77］對(duì)HIV-1-QDs的結(jié)構(gòu)特征分析表明QDs標(biāo)記的HIV-1 感染性相比于沒有標(biāo)記的HIV-1 感染性并無下降，表明QDs適合用于對(duì)HIV-1進(jìn)行標(biāo)記成像和示蹤。人巨噬細(xì)胞是HIV-1 的主要靶點(diǎn)，Li 等［77］用前述量子點(diǎn)標(biāo)記病毒顆粒的Vpr 蛋白，對(duì)HIV-1 在巨噬細(xì)胞中運(yùn)動(dòng)過程進(jìn)行示蹤，追蹤了病毒顆粒與細(xì)胞內(nèi)體膜融合過程，發(fā)現(xiàn)了HIV-1通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞（圖8），和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架有助于HIV-1病毒在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)過程。為了進(jìn)一步了解HIV-1入侵人巨噬細(xì)胞機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)利用量子點(diǎn)標(biāo)記基質(zhì)蛋白的病毒，實(shí)現(xiàn)在較長時(shí)間內(nèi)對(duì)病毒顆粒進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤，研究了病毒入侵巨噬細(xì)胞，基質(zhì)蛋白與Vpr 蛋白動(dòng)態(tài)解離等過程［74］，研究還發(fā)現(xiàn)病毒感染巨噬細(xì)胞初期促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)線粒體的分裂。Yin 等［94］結(jié)合病毒囊膜以及細(xì)胞組分等多重?zé)晒鈽?biāo)記，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像了單個(gè)HIV-1病毒顆粒膜融合入侵人原代CD4 T 淋巴細(xì)胞和跨越皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白屏障的時(shí)空過程。

圖8 HIV-1通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞［77］Fig.8 Schematic diagram for HIV-1 entering cell through endocytosis[77]

量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)也可以應(yīng)用于流感病毒的示蹤成像，Qin 等［75］首次解析了單個(gè)流感病毒顆粒IAV脫殼過程（圖9）。他們利用不同量子點(diǎn)標(biāo)記的流感病毒，實(shí)時(shí)示蹤病毒入侵細(xì)胞、病毒脫殼以及遺傳物質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)的運(yùn)動(dòng)過程，揭示了流感病毒IAV 的8 個(gè)vRNP 復(fù)合物是通過分開的方式釋放到胞質(zhì)后分別進(jìn)入細(xì)胞核。但是利用量子點(diǎn)標(biāo)記病毒顆粒存在的問題是標(biāo)記效率較低，需要改進(jìn)或發(fā)展新的標(biāo)記技術(shù)提高其標(biāo)記效率。

圖9 流感病毒脫殼過程實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤［75］［QD625在電鏡下又黑又圓，而QD705為三角形。用QD625（紅色）和QD705（綠色）分別標(biāo)記vRNP，結(jié)果顯示在脫殼過程中QD625和QD705分別釋放。IAV釋放的vRNPs經(jīng)過三階段的主動(dòng)運(yùn)輸?shù)竭_(dá)細(xì)胞核，在細(xì)胞核經(jīng)歷兩種擴(kuò)散模式］Fig.9 Real-time dynamic tracking of the influenza virus unpacking process[75][Under electron microscope,QD625 is black and round,while QD705 is triangular.vRNP is labeled with QD625(red)and QD705(green)respectively,and the results showed that QD625 and QD705 are released during the hulling process,respectively.IAV-released vRNPs released from IAV reach the nucleus through a three-stage active transport,where they undergo two diffusion modes.]

2017年，Ma等［95］通過設(shè)計(jì)篩選了特異性識(shí)別HIV-1 前病毒基因的TALE 識(shí)別元件，基于反式環(huán)辛烯與四嗪的生物正交反應(yīng)，建立活細(xì)胞內(nèi)針對(duì)TALEs 的量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)。通過時(shí)-空耦合設(shè)計(jì)，采用不同類型的生物正交反應(yīng)，獲得不同顏色量子點(diǎn)標(biāo)記的TALE 探針。量子點(diǎn)-TALE 探針特異性標(biāo)記整合在染色體上的HIV 前病毒DNA，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)單拷貝整合態(tài)前病毒DNA 原位標(biāo)記與成像（圖10）。在整合HIV 前病毒DNA 的潛伏感染細(xì)胞中，可以對(duì)HIV 前病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤和3D 定位分析，并測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)整合態(tài)前病毒的數(shù)目。但TALEs 探針的優(yōu)化篩選和操作過程比較煩瑣復(fù)雜，靶向效率稍低。之后，他們又設(shè)計(jì)了特異識(shí)別病毒基因組的CRISPR 識(shí)別體系，通過與兩種顏色量子點(diǎn)結(jié)合形成雙色CRISPR 探針對(duì)HIV-1 進(jìn)行標(biāo)記成像，與TALEs 探針相比，CRISPR 設(shè)計(jì)更簡單方便，并獲得了高效靶向標(biāo)記效果［96］。

圖10 量子點(diǎn)標(biāo)記的TALEs用于基因組成像［95］Fig.10 TALEs labeled with quantum dots are used for gene composition imaging[95]

通過構(gòu)建一端修飾CdTe：Zn2+量子點(diǎn)［97］，另一端修飾猝滅基團(tuán)的發(fā)夾型DNA 信標(biāo)探針，實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)表面DNA 分子個(gè)數(shù)（價(jià)態(tài)）的精準(zhǔn)控制。研究發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)表面只偶聯(lián)一條DNA 的納米信標(biāo)與靶標(biāo)結(jié)合后，熒光恢復(fù)效果最好、信噪比高、可用于單個(gè)RNA 的標(biāo)記與檢測(cè)。該探針用于活細(xì)胞內(nèi)HIV-1 潛伏-激活研究，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)RNA 的熒光成像與檢測(cè)。該技術(shù)還可用于其他核酸序列的熒光標(biāo)記與檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)低濃度核酸的高靈敏檢測(cè)和活細(xì)胞內(nèi)核酸標(biāo)記與成像分析。

生物發(fā)光和熒光成像技術(shù)也可以用于病毒顆?；铙w成像研究，例如，Wang 等［98］將Nluc基因插入寨卡病毒C 基因編碼區(qū)構(gòu)建了寨卡病毒-Nluc報(bào)告病毒，實(shí)現(xiàn)了對(duì)寨卡病毒侵染小鼠活體動(dòng)物運(yùn)動(dòng)過程的實(shí)時(shí)示蹤成像。除了對(duì)病毒進(jìn)行熒光動(dòng)態(tài)示蹤研究，利用特異性標(biāo)記和合成改造病毒，還可以將其應(yīng)用于活體成像和疾病篩查：猴病毒40（SV40）主要衣殼蛋白VP1 在體外可自組裝形成多態(tài)性的結(jié)構(gòu)，這種多態(tài)性為SV40 病毒納米顆粒作為合成生物學(xué)多功能納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建平臺(tái)提供了多種可能性。Li 等［99］通過將SV40 包裝近紅外二區(qū)熒光Ag2S 量子點(diǎn)，顯著提高了活體成像的穿透深度，實(shí)現(xiàn)了SV40 病毒樣顆?；铙w行為的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤。另外，Sun 等［100］利用SV40 病毒樣顆粒的組裝和負(fù)載能力等優(yōu)點(diǎn)，包裹QDs 形成多功能納米顆粒，通過可控組裝設(shè)計(jì)構(gòu)建了裝載治療藥物的可靶向治療的熒光成像材料，實(shí)現(xiàn)了在小鼠活體內(nèi)對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊熒光的成像檢測(cè)，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的早期篩查和靶向治療研究等提供了理想的平臺(tái)（圖11）。

圖11 SV40-QD VLPs用于靶向小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊成像［100］（SV40 VLPs 含有動(dòng)脈粥樣硬化靶向單元，凝血酶抑制劑并可以封裝QD800。FH-QDs可靶向集中在小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化形成區(qū)）Fig.11 SV40-QD VLPs for imaging atherosclerotic plaques in targeted mice[100](SV40 VLPs contain atherosclerotic targeting units,thrombin inhibitors,which can encapsulate as QD800.FH-QDS can target atherosclerotic areas in mice.)

4 問題與展望

基于合成生物學(xué)原理與技術(shù)，設(shè)計(jì)合成生物相容性好的熒光材料與探針、對(duì)關(guān)鍵生物分子進(jìn)行可控標(biāo)記，能更好地應(yīng)用于細(xì)胞或活體內(nèi)重要生命過程實(shí)時(shí)成像。該研究領(lǐng)域逐漸顯示其優(yōu)勢(shì)和潛力，但也存在一些問題亟待解決。

在熒光材料方面，如何獲得性能更加優(yōu)異的熒光納米探針，如何進(jìn)一步提高熒光材料分子對(duì)特定目標(biāo)的靶向性和特異性、實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的絕對(duì)定量、避免多種熒光材料分子熒光信號(hào)的相互干擾等都需要進(jìn)一步的解決。熒光納米材料的性能難以精確控制，且通常尺寸較大，易影響生物體的結(jié)構(gòu)和生物活性。而且，探針的性能不但受到識(shí)別單元和信號(hào)單元各自性能的影響，還取決于二者間的有效連接和耦合，但至今還沒能很好地實(shí)現(xiàn)識(shí)別單元和信號(hào)單元連接的定向、定量調(diào)控，導(dǎo)致探針的重現(xiàn)性、特異性等性能不理想。因此，亟需發(fā)展新的合成生物學(xué)體系，構(gòu)建適用于不同生物體生物分子跨尺度研究的高特異、高親和、高靈敏、小尺寸、低活性擾動(dòng)的生物探針。傳統(tǒng)的合成生物學(xué)多是以“基因操縱”為主，熒光產(chǎn)物基本為有機(jī)物，而在活細(xì)胞內(nèi)合成無機(jī)材料及納米雜合功能材料，將拓展合成生物學(xué)的技術(shù)理念，并推動(dòng)生物功能材料的創(chuàng)新合成及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。然而，基于雜合熒光生物材料的合成，可以利用的生化反應(yīng)途徑依然較少，較難實(shí)現(xiàn)材料的組裝及進(jìn)一步功能化。在此過程中，如何更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的交流，利用活細(xì)胞這個(gè)強(qiáng)有力的化學(xué)工廠，實(shí)現(xiàn)多樣化的材料的可控制備，依然是極大的挑戰(zhàn)。

在熒光標(biāo)記技術(shù)方面，生物分子在細(xì)胞和活體的成像示蹤不僅需要性能優(yōu)異的生物探針，還需針對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)過程特征，建立高效、特異、定點(diǎn)、定量的原位標(biāo)記方法，并盡可能減少對(duì)生物分子活性的影響，從而獲取真實(shí)可靠、高靈敏的測(cè)量信號(hào)。目前，常規(guī)生物分子組分的標(biāo)記方法主要包括：①利用親和靶向識(shí)別細(xì)胞或生物體的特定組分；②通過生物化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接與生物分子偶聯(lián)；③將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)。然而上述方法存在一定的局限性，如親和標(biāo)記在復(fù)雜體系中易受干擾物及基質(zhì)影響，導(dǎo)致結(jié)合能力和特異性較低；生物化學(xué)標(biāo)記方法難以實(shí)現(xiàn)定量控制，而大量標(biāo)記物的結(jié)合易破壞原有生物體生物分子的結(jié)構(gòu)與功能，影響其活性；熒光蛋白的可標(biāo)記組分有限，且熒光蛋白的大量表達(dá)也會(huì)影響生物分子活性。另一方面，以病原微生物為例，為了準(zhǔn)確詳細(xì)地獲取病原微生物感染全過程的多元信息，需要對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，病毒囊膜、衣殼、核酸等不同結(jié)構(gòu)和組分分別進(jìn)行標(biāo)記，而已有的病原微生物雙標(biāo)或多重標(biāo)記標(biāo)方法普遍存在煩瑣、低效的問題。因此，生物分子標(biāo)記技術(shù)仍是制約其感染過程研究的難點(diǎn)，迫切需要發(fā)展新的合成生物學(xué)標(biāo)記體系，創(chuàng)建和發(fā)展對(duì)不同生物分子不同結(jié)構(gòu)和組分的特異、原位標(biāo)記方法。

總之，基于合成生物學(xué)新原理新技術(shù)，針對(duì)蛋白、核酸、病原體等不同類型標(biāo)志物為靶標(biāo)，從物質(zhì)基礎(chǔ)、能量驅(qū)動(dòng)和調(diào)控機(jī)制三方面作為突破口，創(chuàng)建功能性熒光材料體內(nèi)原位合成新方法，合成性能優(yōu)異的熒光材料和探針，發(fā)展生物分子定點(diǎn)、定量、特異、精準(zhǔn)標(biāo)記新技術(shù)，結(jié)合實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、高靈敏高分辨影像新技術(shù)解析重要生命活動(dòng)過程與機(jī)制，將極大促進(jìn)合成生物學(xué)技術(shù)在熒光生物成像技術(shù)方面的應(yīng)用。合成生物學(xué)與熒光成像技術(shù)的交叉融合，也將拓展合成生物學(xué)的研究領(lǐng)域，并推動(dòng)熒光成像技術(shù)發(fā)展和進(jìn)步。