基于生物正交反應(yīng)的病毒功能化及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

黃利利，張韓，王偉偉，謝海燕，

（1 北京理工大學(xué)醫(yī)工融合研究院，北京 100081； 2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

病毒是一類個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單的非細(xì)胞型生物。病毒大小為納米級(jí)，形態(tài)呈單分散，不同類型的病毒具有特定的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)pH 值、溫度和溶劑的變化相對(duì)穩(wěn)定，可大量復(fù)制［1-5］。這些獨(dú)特的性能使得病毒被廣泛研究，并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域［6-8］。而在這之前需要根據(jù)病毒的實(shí)際使用需求對(duì)其進(jìn)行修飾，賦予其新的性質(zhì)和功能。從結(jié)構(gòu)組成來講，病毒是由核酸（DNA 或RNA）和蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸-蛋白復(fù)合體，而對(duì)于包膜病毒而言，在其核衣殼之外還包裹了一層由特殊蛋白、類脂、多糖組成的脂質(zhì)包膜。因此，組成病毒的核酸、蛋白質(zhì)、脂類、多糖四類生物大分子均可作為病毒修飾的分子靶標(biāo)。因此，建立普適、高效并且可在復(fù)雜環(huán)境下高選擇性地修飾生物大分子的技術(shù)和方法，不但對(duì)生物復(fù)雜體系中探索生物大分子的信息與功能具有重要意義，而且對(duì)病毒相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究具有重要的推動(dòng)作用。

生物正交反應(yīng)是指一類能夠在不干擾生物體自身生化反應(yīng)的條件下，在活體、組織或細(xì)胞中進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)。理想的生物正交反應(yīng)具有以下特點(diǎn)：反應(yīng)可在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，反應(yīng)速度快，且具有高度的反應(yīng)特異性和選擇性，生成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性好。2000 年，Bertozzi 課題組開發(fā)出了疊氮基團(tuán)與膦（如三苯基膦）或亞磷酸酯反應(yīng)，并將其用于細(xì)胞表面糖分子的化學(xué)修飾。該反應(yīng)對(duì)生命科學(xué)研究產(chǎn)生了革命性的影響，自此開啟了生物正交反應(yīng)的研究熱潮［9］。到目前為止，已有十余種生物正交反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)或者開發(fā)并用于病毒、菌類、細(xì)胞、組織的功能化改造［10］。迄今為止，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了多種生物正交反應(yīng)，其中常用于生物大分子功能化改造的生物正交反應(yīng)主要包括：①醛或酮與胺類化合物的縮合反應(yīng)；②施陶丁格反應(yīng)；③疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)；④逆電子效應(yīng)的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)［11-12］。

1 生物正交反應(yīng)及其對(duì)生物大分子的功能化

1.1 醛或酮與胺類化合物的縮合反應(yīng)

含羰基的化合物（如醛或酮）可與胺類化合物發(fā)生縮合反應(yīng)，形成結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的肟鍵或腙鍵（圖1）［13］。而且，研究者發(fā)現(xiàn)胺、硫醇等親核試劑也可以與含羰基的化合物反應(yīng)，生成的產(chǎn)物在水溶液中均能保持穩(wěn)定［14］。因此，在20 世紀(jì)后期，該類反應(yīng)被逐漸應(yīng)用于溶液中蛋白質(zhì)、脂類或聚糖等生物大分子的修飾［15-18］。但是這類反應(yīng)要求被修飾的生物大分子純度較高，主要原因是由于生物體系內(nèi)部的葡萄糖、丙酮酸等內(nèi)源性分子同樣含羰基基團(tuán)，可與上述親核試劑發(fā)生競爭反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)生物分子的選擇性和特異性不夠高。因此，將含羰基的化合物與胺類化合物的縮合反應(yīng)用于病毒功能化改造之前，需要先對(duì)病毒進(jìn)行分離純化［19］。為此化學(xué)家們開始嘗試將一些獨(dú)特的活性官能團(tuán)引入生物體系，以克服生物正交反應(yīng)在病毒功能化改造中的局限性。

圖1 基于醛或酮類的生物正交反應(yīng)［13］醛和酮可以與胺類化合物［氨基氧化合物（上）、酰肼化合物（下）］發(fā)生縮合反應(yīng)形成穩(wěn)定的肟鍵或腙鍵Fig.1 Bioorthogonal reactions based on aldehydes or ketones[13]［Aldehydes or ketones can condense with aminooxy compounds（top）or hydrazide compounds（bottom）to form stable oxime or hydrazine linkages，respectively］

1.2 施陶丁格反應(yīng)

施陶丁格反應(yīng)是通過疊氮化合物與膦（如三苯基膦）或亞磷酸酯反應(yīng)得到亞胺基膦烷中間體，并進(jìn)一步水解得到分子內(nèi)酰胺基氧化膦（如三苯基氧膦）的一類生物正交偶聯(lián)反應(yīng)。2000 年，Bertozzi 團(tuán)隊(duì)［13］改進(jìn)了施陶丁格反應(yīng)，將反應(yīng)過程中的氧化膦排出，使得疊氮化合物與膦反應(yīng)生成天然的酰胺鍵，該反應(yīng)被稱為無痕施陶丁格連接反應(yīng)（圖2）。反應(yīng)中的膦類化合物與疊氮化合物在生物體系中是完全不存在的，因此對(duì)生物體系中生物大分子功能化具有高度的特異性。這也是第一個(gè)基于非生物體系化學(xué)基團(tuán)的生物正交反應(yīng)［9，19-20］。更重要的是，二者對(duì)目標(biāo)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的影響非常小，可在活細(xì)胞或活體中進(jìn)行生物大分子的原位功能化改造［21-23］。此后，許多研究小組開始將疊氮基團(tuán)作為生物大分子功能化的報(bào)告基團(tuán)［24-26］。因此，理論上該反應(yīng)不但可用于分離純化后的病毒修飾，而且可用于細(xì)胞或活體內(nèi)病毒的原位標(biāo)記。然而，施陶丁格反應(yīng)在生物大分子功能化方面仍存在一定的局限性。其反應(yīng)速率很低［典型的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)為k=0.0020 L（/mol·s）］， 需 要 高 濃 度 的 三 苯 基 膦（>250 mmol/L）才能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行［9，19-20］。因此，化學(xué)家們對(duì)發(fā)展更快的基于疊氮基團(tuán)的生物正交反應(yīng)產(chǎn)生了極大的興趣。

圖2 生物大分子與配體通過無痕施陶丁格反應(yīng)偶聯(lián)［13］［通過膦（1）與疊氮基團(tuán)自發(fā)的反應(yīng)生成亞胺磷烷（2），進(jìn)一步發(fā)生結(jié)構(gòu)重排（3），之后水解得到酰胺鍵偶聯(lián)產(chǎn)物（4）和氧化膦副產(chǎn)物］Fig.2 Biomacromolecules coupling with ligands by the trace‐less Staudinger ligation reaction[13].[The phosphine-modified biomacromolecule(1)could react with the azide-linked ligand by the Staudinger ligation reaction to yield imino‐phosphorane(2),which rearranges to produce the intermediate(3)for hydrolysis to generate the coupling product(4)and a phosphine oxide by-product.]

1.3 疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)

疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)是指含疊氮基團(tuán)的化合物作為1，3-偶極子與炔烴發(fā)生［3+2］環(huán)加成反應(yīng)（圖3）［13］。在一價(jià)銅離子的作用下，疊氮基團(tuán)與炔基的反應(yīng)速率可達(dá)到（65±10）L/（mol·min），該反應(yīng)被稱為Cu（Ⅰ）催化的疊氮-炔基環(huán)加成（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）反應(yīng)，反應(yīng)生成穩(wěn)定的三氮唑產(chǎn)物［27-28］。另外，研究者通過使用特定的銅離子配體，使得疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)的反應(yīng)速率得到不同程度提升［29-30］，基于該反應(yīng)極高的產(chǎn)率和優(yōu)異的官能團(tuán)選擇性，越來越多的生物學(xué)家將其應(yīng)用于生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子的功能化改造［31-32］。但是，Cu（Ⅰ）催化劑的潛在細(xì)胞毒性阻礙了CuAAC 反應(yīng)在生物大分子功能化方面的廣泛使用。由于對(duì)病毒組成成分進(jìn)行功能化的過程中無法保證病毒活性，該反應(yīng)更多地被用于病毒檢測和相關(guān)藥物的研發(fā)，而無法用于活病毒標(biāo)記與示蹤。為了消除Cu（Ⅰ）催化劑的毒副作用，化學(xué)家們一方面?zhèn)戎赜陂_發(fā)銅離子螯合配體，通過穩(wěn)定一價(jià)銅離子來降低其毒副作用［30，33-35］；另一方面，致力于開發(fā)無需銅離子催化的生物正交反應(yīng)。直到2004 年，Bertozzi 課題組［36］報(bào)道了一種可利用環(huán)狀炔烴的張力推進(jìn)作用觸發(fā)疊氮-炔基之間的環(huán)加成反應(yīng)，該反應(yīng)被稱為張力促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成（strain promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）反應(yīng)，也被稱為“無銅點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)。該反應(yīng)不但保留了疊氮基團(tuán)與炔基的反應(yīng)特異性，而且避免了因銅離子參與而產(chǎn)生的生物毒性。然而，與CuAAC 相比，其反應(yīng)效率較低。例如，環(huán)辛炔與疊氮化合物的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k=0.0024 L/（mol·s），與施陶丁格反應(yīng)相當(dāng)。為此，研究人員開發(fā)出了一系列環(huán)辛炔衍生物，使得反應(yīng)速率得到不同程度的提升［37-40］。目前該反應(yīng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒、菌類、細(xì)胞、活體等不同生物體系中生物大分子的功能化改造［41-45］，是目前為止進(jìn)行生物大分子功能化中最常用的生物正交反應(yīng)類型之一。

圖3 疊氮基團(tuán)與炔基發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，生成三氮唑產(chǎn)物［13］［Cu（Ⅰ）催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（上）和張力推進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（下）］Fig.3 Bioorthogonal cycloadditions of azides and alkynes to form triazoles[13][Terminal alkynes are activated by Cu(Ⅰ)to undergo cycloaddition with azides(top).Cyclooctynes react with azides through a strain-promoted cycloaddition(bottom).]

1.4 逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)

帶有供電子基團(tuán)的親雙烯體與帶有吸電子基團(tuán)的雙烯體之間可自發(fā)地發(fā)生快速高效的雙烯加成反應(yīng)［46］。其中最典型的反應(yīng)方式就是四嗪和反式環(huán)辛烯之間的逆電子需求的［4+2］狄爾斯-阿爾德環(huán)加成（inverse electron-demand Diels-Alder，IEDDA）反應(yīng)［47-48］。二者的反應(yīng)速度非?？欤?jí)反應(yīng)速率常數(shù)為（2000±400）L/（mol·s），因而可在低濃度下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物分子的功能化［47，49］。該反應(yīng)無需催化劑，且反應(yīng)具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性。目前該反應(yīng)也已被用于活體、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的體外或體內(nèi)生物大分子功能化改造與熒光標(biāo)記［50-53］。值得注意的是，四嗪分子上連接的吸電子基團(tuán)，或者提高親雙烯體的給電子能力，均可以有效地提高IEDDA反應(yīng)的反應(yīng)速率，然而過強(qiáng)的吸電子取代基會(huì)加快四嗪分子在體內(nèi)的降解速度，而親雙烯體的環(huán)張力、取代基構(gòu)象等因素同樣對(duì)IEDDA 反應(yīng)的反應(yīng)速率具有重要影響。因此，在實(shí)際應(yīng)用中需要考慮多方面的影響因素，尋找最佳平衡點(diǎn)。

2 生物正交反應(yīng)對(duì)病毒組成成分的功能化

利用生物正交反應(yīng)進(jìn)行病毒功能化改造，首先需要將特定的生物正交反應(yīng)基團(tuán)（如醛基、疊氮、烯烴等）引入目標(biāo)生物分子中，然后利用生物正交反應(yīng)將含有互補(bǔ)官能團(tuán)的功能元件（如抗體、寡核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物，熒光探針、藥物等）引入目標(biāo)分子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病毒的蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)、核酸不同組分的功能化改造。方法穩(wěn)健、通用，而且在胞外或胞內(nèi)均可進(jìn)行高效、特異的反應(yīng)，是進(jìn)行目標(biāo)病毒組分功能化中非常重要的工具［54-55］。

2.1 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是病毒衣殼蛋白和包膜蛋白的重要組成成分，而氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，氨基酸具有幾個(gè)可直接進(jìn)行修飾的基團(tuán)，包括賴氨酸的伯氨基、半胱氨酸的巰基、天冬氨酸和谷氨酸的羧基、酪氨酸的酚羥基，以及組氨酸的咪唑基。因此，可通過化學(xué)修飾或生物偶聯(lián)的方式直接將生物正交基團(tuán)引入上述天然氨基酸，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的修飾。目前，疊氮或炔烴基團(tuán)已被成功引入多種病毒的蛋白組分中［56-59］。例如，Steinmetz 等［56］將炔基修飾的富勒烯衍生物通過CuAAC 反應(yīng)連接到疊氮修飾的豇豆花葉病毒和噬菌體Qβ 病毒樣顆粒表面，不但解決了富勒烯水溶性問題，而且可實(shí)現(xiàn)富勒烯在病毒表面的高效負(fù)載，這對(duì)于開發(fā)具有光激活性能的新型腫瘤診療試劑具有重要推動(dòng)作用。另外，研究表明與N-羥基琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺等直接的化學(xué)修飾相比，利用CuAAC 反應(yīng)進(jìn)行病毒功能化改造的速度更快，而且具有更高的選擇性和特異性［55］。Steinmetz 課題組［58］也證實(shí)，將炔基修飾到馬鈴薯X型桿狀病毒蛋白表面，可通過生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)生物素、熒光探針、PEG 等多種功能基團(tuán)與病毒的偶聯(lián)，進(jìn)而賦予病毒生物成像、腫瘤靶向等功能。本課題組利用疊氮修飾的PEG4-NHS 與痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）表面的氨基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生疊氮基團(tuán)修飾的VACV，進(jìn)而與環(huán)炔修飾的量子點(diǎn)通過SPAAC 反應(yīng)偶聯(lián)，修飾后的VACV仍具有良好的生物活性，能感染宿主細(xì)胞，而且病毒表面的量子點(diǎn)仍保持初始的熒光性能，可用于病毒感染過程的動(dòng)態(tài)示蹤［59］。

除了疊氮-炔基的環(huán)加成反應(yīng)外，基于醛或酮與胺類化合物的縮合反應(yīng)也被廣泛用于病毒蛋白的功能化。研究者分別將醛基或酮基官能團(tuán)引入病毒衣殼蛋白或包膜蛋白表面，并通過縮合反應(yīng)，將其與羥基胺、酰肼和烷氧胺類修飾的功能分子偶聯(lián)，成功構(gòu)建出多種以病毒為載體的生物成像系統(tǒng)和藥物遞送系統(tǒng)［60-65］。例如，Hooker 等［60］構(gòu)建了基于噬菌體MS2 的納米級(jí)磁共振成像系統(tǒng)。作者首先將NHS 修飾的醛基官能團(tuán)與病毒衣殼表面賴氨酸殘基的氨基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)病毒衣殼內(nèi)表面的醛基修飾，隨后通過肟縮合反應(yīng)，與對(duì)苯二胺配體修飾的Gd3+絡(luò)合物偶聯(lián)；該策略不但提高了磁成像造影劑——Gd3+絡(luò)合物的水溶性和穩(wěn)定性，而且所構(gòu)建的成像系統(tǒng)具有更高的弛豫性，為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域提供了性能優(yōu)良的成像探針［60］。另外，也有研究者利用磷酸吡哆醛修飾蛋白質(zhì)或多肽的N 端氨基，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)氨作用將羰基引入目標(biāo)蛋白，從而為蛋白質(zhì)的功能化提供作用靶點(diǎn)［63-64］。為了進(jìn)一步提高縮合反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)的功能化效率，Dirksen等［61］利用苯胺作為催化劑，將芳香醛引入未保護(hù)的氨基酸，使其能夠在室溫條件下與胺的親和試劑反應(yīng)得到腙和肟綴合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)熒光探針對(duì)目標(biāo)蛋白或多肽的功能化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)高效、快速、選擇性強(qiáng)，反應(yīng)速率常數(shù)為101~103L/（mol·s），超過了CuAAC 等常規(guī)的生物正交反應(yīng)，表明該反應(yīng)能夠在低濃度和中性pH 下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)多肽和蛋白質(zhì)的高效標(biāo)記。Kovacs 等［65］將兩種不同的生物正交反應(yīng)策略分別用于MS2 病毒樣納米不同組分的功能化改造，實(shí)現(xiàn)了熒光染料在病毒內(nèi)部裝載，以及靶向配體——核黃素與病毒衣殼外表面偶聯(lián)，進(jìn)而成功構(gòu)建出具有腫瘤靶向性的病毒載體成像系統(tǒng)。

通過直接對(duì)天然氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，進(jìn)而偶聯(lián)生物正交基團(tuán)的病毒功能化改造策略，操作簡便、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)，但也存在一些不足。比如：無法準(zhǔn)確控制生物正交基團(tuán)在目標(biāo)病毒組分上的數(shù)目和分布，偶聯(lián)的功能分子極易占據(jù)病毒的表面識(shí)別位點(diǎn)，影響病毒自身的生物學(xué)功能［66-67］。因此，功能化的病毒主要被用于抗病毒藥物或疫苗的開發(fā)，以及以病毒為載體的遞送系統(tǒng)構(gòu)建等，若將其用于病毒標(biāo)記和示蹤，則需要對(duì)病毒表面偶聯(lián)物的劑量和偶聯(lián)部位進(jìn)行嚴(yán)格控制。為了使功能化后的病毒仍具有良好識(shí)別并感染宿主細(xì)胞的能力，科學(xué)家們開發(fā)出多種向目標(biāo)生物大分子中引入特定生物正交反應(yīng)基團(tuán)的方法，主要包括基于殘基定位法的非天然氨基酸引入技術(shù)和基于基因編碼的非天然氨基酸定點(diǎn)引入技術(shù)［68-70］。

基于殘基定位法的非天然氨基酸引入技術(shù)，是將生物正交基團(tuán)修飾的氨基酸作為天然氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物，通過蛋白質(zhì)自然的生物合成與代謝嵌入途徑實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的功能化。這種蛋白質(zhì)功能化策略具有良好的生物相容性，一般不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，而且無需額外加入氨酰-tRNA合成酶。目前，帶有疊氮、炔基或羰基等小分子官能團(tuán)的氨基酸已經(jīng)通過上述策略成功實(shí)現(xiàn)多種病毒蛋白的功能化［71-72］。例如，Carvalho 等［71］利用生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)流感病毒樣顆粒包膜蛋白熒光標(biāo)記的策略（圖4）。首先，作者將疊氮高丙氨酸（AHA）加入培養(yǎng)基中，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)A 型流感病毒包膜蛋白——血凝素進(jìn)行高效表達(dá)的過程中，實(shí)現(xiàn)血凝素的疊氮基衍生，該過程不影響血凝素蛋白的折疊和生物學(xué)功能，構(gòu)建的流感病毒樣顆粒的包膜表面帶有疊氮基團(tuán)，可利用環(huán)炔修飾的熒光探針，通過SPAAC 反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)病毒樣顆粒的熒光標(biāo)記［71］。Strable 等［72］分別將帶有炔基或疊氮基的甲硫氨酸類似物用于乙型肝炎病毒或噬菌體Qβ 衣殼蛋白的修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的病毒樣顆粒中，生物正交基團(tuán)的嵌入率超過95%。表明上述甲硫氨酸類似物具有良好的生物相容性，可實(shí)現(xiàn)病毒蛋白的高效、高選擇性修飾，為熒光探針、靶向分子等功能基團(tuán)對(duì)病毒的功能化改造提供了有利條件。

圖4 流感病毒樣顆粒包膜蛋白的體內(nèi)位點(diǎn)特異性標(biāo)記［71］將疊氮基團(tuán)修飾的非天然氨基酸——AHA添加到培養(yǎng)基中，在細(xì)胞中后續(xù)血凝素蛋白擴(kuò)增的過程中，將AHA引入新生的血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）中，帶有疊氮基團(tuán)的血凝素蛋白被融合到細(xì)胞分泌的囊泡表面，進(jìn)而可利用環(huán)炔修飾的Alexa 488通過張力促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)囊泡表面血凝素蛋白的位點(diǎn)特異性標(biāo)記，構(gòu)建成可發(fā)熒光的流感病毒樣顆粒Fig.4 Site-specific in vivo labeling of enveloped influenza VLPs[71]During intracellular protein synthesis，the AHA is incorporated into the nascent HA proteins.The modified HA is further incorporated into the vesicles’envelope that can secret from the cells，carrying the chemical modification.Addition of the Alexa 488-cyclooctyne reagent allows the site-specific modification of HA by strain-promoted alkyne-azide cycloaddition（SPAAC）

基于基因編碼的非天然氨基酸定點(diǎn)引入技術(shù)，是將帶有環(huán)狀烯烴或炔烴等大分子生物正交反應(yīng)官能團(tuán)的非天然氨基酸，以基因編碼的方式引入目標(biāo)蛋白的特定部位，從而實(shí)現(xiàn)蛋白功能化修飾的目的［73］。2000 年，Schultz 課題組［74］將非天然氨基酸編碼到對(duì)應(yīng)的琥珀密碼子或四堿基密碼子上；同時(shí)，將可特異識(shí)別非天然氨基酸的外源氨酰-tRNA合成酶也引入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而在蛋白質(zhì)翻譯過程中將該氨基酸插入延長的肽鏈中，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白的位點(diǎn)特異性修飾。研究者將該技術(shù)與生物正交偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了病毒蛋白的位點(diǎn)特異性修飾。例如，Carrico 等［75］將側(cè)鏈上含苯丙氨酸官能團(tuán)的非天然氨基酸利用終止密碼子引入病毒的衣殼蛋白上，進(jìn)而通過生物正交反應(yīng)成功地將多肽偶聯(lián)在病毒的特定部位，提高了病毒的腫瘤靶向性。目前該技術(shù)已被用于多種功能分子對(duì)噬菌體MS2、肝炎病毒、HIV 病毒等的功能化改造，拓寬了病毒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范疇［76-79］。

2.2 糖類

糖基是包膜病毒糖蛋白的重要組成成分，同樣可作為病毒功能化的靶點(diǎn)。糖類分子上的醛基和酮基可直接與胺類化合物發(fā)生縮合反應(yīng)。另外，也可將生物正交基團(tuán)引入糖類分子的羥基，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)糖類分子的修飾［80-81］。然而，由于病毒糖蛋白在其感染宿主細(xì)胞的多個(gè)階段，例如吸附、入胞、組裝、出芽等過程中起著至關(guān)重要的作用，因此，若希望功能化后的病毒仍保持良好的感染力，則需要對(duì)生物正交基團(tuán)的引入數(shù)量和引入位點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格控制。因此常用的功能化策略是將帶有疊氮、硫醇、酮等生物正交基團(tuán)的甘露胺、半乳糖胺、葡萄糖胺等寡糖或單糖分子作為天然糖分子類似物，并通過自然的糖代謝機(jī)制將該糖分子類似物引入目標(biāo)糖蛋白中，之后通過生物正交反應(yīng)與帶有互補(bǔ)官能團(tuán)的功能分子偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)糖蛋白的功能化［82-83］。例如，人類腺病毒（Ad5）在纖維蛋白的第109 位絲氨酸殘基上有一個(gè)乙酰葡萄糖（O-GlcNAc）殘基。因此，Banerjee 等［84］將疊氮基團(tuán)修飾的葡萄糖通過糖代謝引入腺病毒纖維蛋白中，進(jìn)而利用CuAAC 反應(yīng)，將腫瘤靶向元件——葉酸小分子偶聯(lián)在病毒顆粒表面，從而增強(qiáng)腺病毒對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶向性。Zhao 等［85］分別利用疊氮基團(tuán)修飾的N-乙酰甘露糖胺和半乳糖胺通過糖代謝嵌入麻疹病毒的包膜糖蛋白，并通過SPAAC 反應(yīng)與炔烴修飾的熒光探針偶聯(lián)（圖5）。研究表明，上述標(biāo)記策略不影響病毒的結(jié)構(gòu)和功能，可用于病毒的動(dòng)態(tài)可視化成像，為包膜的代謝標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)［84-86］。另外，基于病毒蛋白質(zhì)的修飾策略同樣可用于病毒糖蛋白的功能化。例如，F(xiàn)ernandez等［87］利用基因工程改造技術(shù)，將環(huán)炔修飾的非天然氨基酸定點(diǎn)引入HIV-1包膜糖蛋白復(fù)合物中，進(jìn)而通過四嗪與環(huán)炔間的IEDDA 反應(yīng)對(duì)HIV-1 包膜糖蛋白熒光標(biāo)記，并用于對(duì)宿主細(xì)胞感染過程的動(dòng)態(tài)可視化成像。

圖5 利用疊氮化的糖通過宿主細(xì)胞膜蛋白的糖基化過程實(shí)現(xiàn)對(duì)包膜麻疹病毒糖蛋白的修飾［85］Fig.5 Modification of an enveloped measles virus can be achieved by the metabolic incorporation of azido sugars into the host cells through the protein glycosylation process[85]

2.3 脂類

與病毒表面糖蛋白不同，修飾病毒包膜脂質(zhì)分子對(duì)病毒的生物學(xué)性能影響相對(duì)較小。因此，對(duì)其進(jìn)行功能化修飾可更好地保持病毒的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。最初，研究者開發(fā)了一系列帶有生物正交官能團(tuán)的脂類分子類似物或其前體分子類似物，如磷脂類、固醇類、鞘脂類，并通過直接插膜或脂代謝的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜脂類的功能化［88-90］。例如，Salic 課題組［88］設(shè)計(jì)合成了膽堿的結(jié)構(gòu)類似物——丙炔膽堿，并將其加入不含膽堿的細(xì)胞培養(yǎng)液中與NIH 3T3 細(xì)胞共孵育，進(jìn)而通過細(xì)胞內(nèi)磷脂酰膽堿的生物合成和代謝嵌合機(jī)制，成功將丙炔基修飾在細(xì)胞膜磷脂上，并利用疊氮基團(tuán)修飾的熒光探針實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的標(biāo)記。由于包膜病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，組裝好的子代病毒顆粒會(huì)以出芽方式從細(xì)胞中釋放，并將宿主細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成自身的包膜。因此，許多研究小組利用這一策略成功地將疊氮基團(tuán)引入到目標(biāo)病毒包膜中，并證實(shí)這種修飾方法可以有效保持病毒的生物活性［91-92］。例如，本課題組首先通過膽堿磷脂的“生物合成”與“自然嵌合”，實(shí)現(xiàn)了宿主細(xì)胞膜上膽堿磷脂的疊氮基衍生，接著進(jìn)行病毒的感染復(fù)制，利用包膜病毒復(fù)制組裝時(shí)需要從宿主細(xì)胞膜中獲取磷脂成分以形成自身包膜的特性，在病毒的復(fù)制組裝過程中實(shí)現(xiàn)了病毒包膜的疊氮基衍生，進(jìn)而加入環(huán)炔基修飾的熒光探針，通過SPAAC 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了病毒包膜的標(biāo)記（圖6）［91］。

圖6 宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒包膜與核酸的雙熒光標(biāo)記［91］［疊氮化物膽堿（Azide-Cho）和［Ru（phen）2（dppz）］2+存在下，利用VACV感染宿主細(xì)胞。首先Azide-Cho利用宿主細(xì)胞中磷脂的生物合成途徑摻入細(xì)胞膜中（①）；然后在VACV感染細(xì)胞2 h后，加入［Ru（phen）2（dppz）］2+，使其能通過病毒導(dǎo)致細(xì)胞病理效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞，并嵌入病毒核酸中（②）；在病毒感染24 h后，將DBCO-Fluor 525熒光探針加入培養(yǎng)基中，用于VACV包膜的標(biāo)記（③）；繼續(xù)感染24 h后，雙標(biāo)記的病毒粒子被組裝并釋放］Fig.6 Dual-fluorescent labeling of the viral envelope and nucleic acid in host cells[91][The vaccinia virus(VACV)propagates in the presence of both azide-Cho and[Ru(phen)2(dppz)]2+in the host cell.The biosynthesis and incorporation of azide-Cho-containing phospholipids in the host cells are carried out at first(①);then the cells are infected with VACV,and the[Ru(phen)2(dppz)]2+is added into the medium at 2 h after the infection,which could enter the cells through the permeable cytomembrane due to the cytopathogenic effect of the virus to label the nucleic acid of the virions(②);at 24 h after the infection,DBCO-Fluor 525 is added into the medium to label the envelope of the VACV(③);after another 24 h with the infection,the dual-labeled virions are finally assembled and released.]

2.4 核酸

病毒核酸分為RNA 和DNA 兩種類型。分別由四種不同的核苷酸/脫氧核苷酸組成，而這也是進(jìn)行病毒核酸功能化改造的分子靶標(biāo)。目前科學(xué)家已經(jīng)合成多種功能化核苷酸/脫氧核苷酸分子，并通過生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核酸的功能化［93-98］。例如，Carell 和他的同事合成了炔基修飾的核苷酸用于DNA 的合成后標(biāo)記［97］。Salic 等［98］分別合成了炔基修飾的脫氧尿苷、烯基修飾的脫氧尿苷和炔基修飾的尿苷，并作為核苷酸衍生物通過生物合成及代謝嵌入途徑分別引入DNA 或RNA 中，之后利用功能化熒光探針通過生物正交反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA或RNA 的熒光標(biāo)記。Wang 等［95］將炔基修飾的核苷類似物用于病毒DNA 修飾，進(jìn)而通過疊氮修飾的熒光探針實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的原位標(biāo)記。而且作者比較了炔基修飾的不同核苷類似物（炔基脫氧尿苷、炔基脫氧胞苷、炔基脫氧腺苷）分別對(duì)單純皰疹病毒、腺病毒和痘苗病毒的毒性和修飾效率。研究結(jié)果為基于核苷類似物和生物正交反應(yīng)的病毒核酸標(biāo)記技術(shù)提供了重要信息。本課題組［99］基于上述標(biāo)記策略，發(fā)展了一種普適性更強(qiáng)的病毒多組分標(biāo)記方法，首先分別合成了帶有疊氮基團(tuán)的氨基酸以及帶有乙烯基團(tuán)的脫氧核苷酸，并通過宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的生物合成途徑，分別實(shí)現(xiàn)了病毒蛋白的疊氮基和核酸的乙烯基衍生，進(jìn)而將SPAAC與IEDDA 兩種生物正交反應(yīng)偶合于同一個(gè)細(xì)胞中發(fā)生，實(shí)現(xiàn)了病毒蛋白與核酸的雙重標(biāo)記。該方法可應(yīng)用于所有包膜病毒和衣殼病毒，具有很強(qiáng)的普適性（圖7）。

圖7 宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白與核酸的雙熒光標(biāo)記［99］（疊氮基衍生的病毒蛋白可通過SPAAC反應(yīng)與環(huán)炔修飾熒光探針偶聯(lián)；乙烯基衍生的病毒核酸可通過IEDDA反應(yīng)與四嗪修飾熒光探針偶聯(lián)）Fig.7 Dual-fluorescent labeling of viral protein and nucleic acid in host cells[99]（AHA-containing protein is labeled by SPAAC reaction，and the VdU-containing nucleic acid is labeled by IEDDA reaction）

3 功能化病毒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

生物正交反應(yīng)功能化的病毒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)相關(guān)研究，包括病毒示蹤、病毒疫苗的開發(fā)、病毒感染的檢測、基于病毒載體的納米藥物或成像試劑的遞送等［54，100-102］。

3.1 病毒示蹤

對(duì)病毒感染宿主細(xì)胞的過程和致病機(jī)理等知識(shí)的缺乏，嚴(yán)重限制了病毒性疾病診斷技術(shù)的發(fā)展，以及相關(guān)疫苗與治療藥物的研發(fā)［103］。隨著先進(jìn)的熒光成像顯微鏡和單分子熒光成像技術(shù)的發(fā)展，使得單粒子或單分子水平上研究病毒-細(xì)胞相互作用成為了可能。其中利用生物大分子的生物合成和代謝嵌入機(jī)制進(jìn)行病毒不同組分的熒光標(biāo)記，方法簡便、高效，避免了煩瑣和破壞性很強(qiáng)的病毒純化和修飾過程，最大程度保持了病毒活性［78，86，104-107］；進(jìn)而通過動(dòng)態(tài)示蹤被標(biāo)記病毒的運(yùn)動(dòng)軌跡，解析其感染宿主細(xì)胞過程中的關(guān)鍵分子事件，為闡明病毒的感染機(jī)理提供理論依據(jù)［93，96，108-109］。例如，Teo等［107］通過示蹤單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的蓄積過程，揭示了NPDs蛋白在HSV感染早期招募宿主和翻譯新生病毒蛋白的重要作用。Hagemeijer 等［93］利用帶有乙炔基的尿苷修飾新生冠狀病毒的RNA，并通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)病毒核酸的熒光標(biāo)記，進(jìn)而可視化示蹤病毒核酸的運(yùn)

動(dòng)軌跡，闡述了雙鏈RNA（dsRNA）在病毒RNA合成中的作用。Alandijany 等［108］通過示蹤HSV 對(duì)宿主細(xì)胞的感染過程，發(fā)現(xiàn)早幼粒細(xì)胞白血病核體（PMLNBs）在病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，通過捕獲病毒DNA的方式阻止病毒復(fù)制。

研究清楚病毒的感染機(jī)制，將有助于病毒性疾病的診斷和相關(guān)疫苗與治療藥物的研發(fā)。例如，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的抑制劑BMS-790052，可通過與HCV 編碼的鋅結(jié)合磷酸化蛋白NS5A 作用，抑制病毒感染［110］。為此，研究者設(shè)計(jì)了含有生物素標(biāo)簽的BMS-790052 結(jié)構(gòu)變體，并成功地從相關(guān)的細(xì)胞模型中分離出NS5A，從而驗(yàn)證上述結(jié)構(gòu)變體可作為BMS-790052 的替代品用于HCV的抑制［111］。在此基礎(chǔ)上，作者將硼二吡咯亞甲基（BODIPY）熒光團(tuán)取代生物素標(biāo)簽偶聯(lián)到BMS-790052 結(jié)構(gòu)變體上，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)變體無法與NS5A 共定位，表明BODIPY 熒光團(tuán)的引入削弱了BMS-790052 結(jié)構(gòu)變體對(duì)NS5A 的作用；與BODIPY 標(biāo)記的探針相比，疊氮基團(tuán)修飾的BMS-790052 結(jié)構(gòu)變體能更有效地抑制病毒的復(fù)制，利用炔基修飾的Alexa Fluor 488 熒光探針原位標(biāo)記BMS-790052 結(jié)構(gòu)變體，可實(shí)現(xiàn)NS5A 蛋白在亞細(xì)胞中的精準(zhǔn)定位，從而通過可視化方式直觀地找到病毒作用于宿主細(xì)胞的靶點(diǎn)［110-111］。

3.2 病毒疫苗的開發(fā)

兩個(gè)多世紀(jì)以來，接種病毒疫苗是人類預(yù)防病毒性疾?。ㄈ绺窝住⒙檎詈土鞲校┑挠行Т胧?。病毒疫苗主要是基于病毒結(jié)構(gòu)及其亞結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建而成。目前，研究者已利用生物正交反應(yīng)開發(fā)出多種改造的病毒疫苗［112-116］。主要策略是將病毒抗原和表位裝配于載體表面，通過呈現(xiàn)多種抗原和佐劑的方式，提高疫苗效價(jià)。例如，Wang等［112］通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將HA和鞭毛蛋白（TLR5受體激動(dòng)劑）同時(shí)偶聯(lián)在金納米顆粒（AuNPs）表面，修飾的AuNPs在體外和小鼠體內(nèi)均能夠有效誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。Patel等［113］利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建得到帶有疊氮基團(tuán)的病毒樣顆粒，進(jìn)而通過生物正交反應(yīng)，直接將炔基修飾的功能分子［包括蛋白質(zhì)（抗體片段、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）、核酸和聚乙二醇］結(jié)合到病毒樣顆粒表面。通過控制功能分子的偶聯(lián)數(shù)量和比例，制備出呈現(xiàn)獨(dú)特抗原、免疫刺激蛋白和刺激核酸的病毒樣顆粒。此外，研究者還利用多種帶有生物正交基團(tuán)的非天然氨基酸制備病毒疫苗，所構(gòu)建的疫苗對(duì)預(yù)防病毒感染呈現(xiàn)出良好的效果［114-115］。

此外，利用生物正交反應(yīng)對(duì)病毒進(jìn)行功能化的應(yīng)用還可以擴(kuò)展到病毒疫苗的生產(chǎn)中。將可發(fā)生生物正交反應(yīng)的官能團(tuán)（例如炔基、疊氮基團(tuán)）引入病毒的蛋白亞基，進(jìn)而通過帶有互補(bǔ)生物正交反應(yīng)官能團(tuán)的探針對(duì)修飾的病毒做出反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程中病毒疫苗的監(jiān)測和鑒定。例如，Carvalho 和他的同事［71］利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)流感病毒HA 的過程中，加入AHA，得到了帶有疊氮基團(tuán)標(biāo)簽的HA 蛋白；因此，所構(gòu)建的流感病毒樣顆粒可與環(huán)辛炔基修飾的Alexa Fluor 488熒光探針發(fā)生SPAAC 反應(yīng)；進(jìn)而在病毒疫苗制備過程中，可通過熒光信號(hào)將所需的流感病毒樣顆粒與其他雜質(zhì)（如桿狀病毒和細(xì)胞碎片）區(qū)分開來。該技術(shù)也是生物制藥產(chǎn)業(yè)化過程中，優(yōu)化和監(jiān)控病毒疫苗生產(chǎn)下游流程的有力工具。

3.3 病毒感染的檢測

對(duì)病毒的高靈敏檢測是預(yù)防病毒進(jìn)一步擴(kuò)散的有效手段，也是進(jìn)行病毒性疾病治療的前提。目前對(duì)病毒檢測的方法主要分為血清學(xué)檢測和病毒核酸檢測。血清學(xué)檢測主要是通過抗原-抗體反應(yīng)對(duì)病毒抗原或由病毒感染引起的機(jī)體抗體進(jìn)行檢測。通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將抗體或核酸適配體偶聯(lián)在生物傳感器上被廣泛用于病毒感染早期的血清學(xué)檢測。例如，Kato等［116］報(bào)道了一種利用四苯基乙烯（TPE）的熒光“開啟”傳感器，用于流感病毒抗原的檢測。主要是利用炔基修飾的TPE 與疊氮化唾液酰乳糖偶聯(lián)，進(jìn)而通過唾液酰乳糖與流感病毒NA 的高親和作用，實(shí)現(xiàn)病毒的特異識(shí)別；偶聯(lián)在病毒表面的TPE 具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光的特性，從而通過熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)病毒的高靈敏檢測。Pfeilsticker 等［117］報(bào)道了一種HIV-1 的體外檢測方法。將抗HIV 的抗體通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到HIV-1 包膜蛋白gp41 的保守表位，所構(gòu)建的肽基捕獲器，可從HIV 陽性患者收集的血清中檢測出HIV-1；該策略與金標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)化的重組蛋白抗原相比，其靈敏度和特異性均有所提高，而且捕獲劑可作為粉末在常溫下長期儲(chǔ)存。最近，一顆硼摻雜金剛石（boron-doped diamond，BBD）的電極與唾液酸模擬肽通過生物正交反應(yīng)偶聯(lián)，進(jìn)而利用電極表面唾液酸模擬肽與流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶的高親和作用成功捕獲樣本中的流感病毒粒子［118］。該裝置對(duì)流感病毒具有很高的檢測靈敏度，可以檢測20～500 pfu 的H1N1 型或H3N2型病毒粒子，可用于病毒感染早期的診斷；而且裝置用的唾液酸模擬肽具有很好的穩(wěn)定性，它在功能上可以模擬唾液酸與神經(jīng)氨酸酶作用，而在性質(zhì)上又可避免被神經(jīng)氨酸酶消化［119］。

對(duì)病毒核酸進(jìn)行檢測，主要是通過核酸分子雜交、熒光定量PCR 等手段檢測病毒的基因組。該策略在實(shí)際病毒檢測中具有更高靈敏度和重現(xiàn)性，也是最常用的病毒檢測方法?；谏镎环磻?yīng)的病毒核酸檢測方法在病毒定性和定量檢測中具有很好的應(yīng)用前景。例如，Yue 等［119］將生物素修飾的捕獲DNA 固定在鏈霉親和素修飾的順磁粒子（PMPs）上，當(dāng)其與目標(biāo)乙型肝炎病毒DNA雜交后，與DNA-CuS 顆粒形成三明治結(jié)構(gòu)；隨后，CuS 粒子被酸化形成Cu（Ⅱ），并被抗壞血酸鈉還原成Cu（Ⅰ），繼而催化具有微弱熒光信號(hào)的3-疊氮-7-羥基香豆素和丙炔醇偶聯(lián)，形成具有強(qiáng)熒光信號(hào)的1，2，3-三唑化合物，而且熒光強(qiáng)度和目標(biāo)DNA 濃度之間在0.1~100 nmol/L 范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，使得病毒基因組的檢出限可低至0.04 nmol/L。Thomson 等［120-121］報(bào)道了一種無需信號(hào)放大即可進(jìn)行HSV 檢測的方法，通過將磁性納米顆粒表面包覆聚乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，并在表面羥基端修飾疊氮基團(tuán)，進(jìn)而通過生物正交反應(yīng)與炔烴修飾的HSV 特異性DNA 捕獲探針結(jié)合，該探針兼具磁可操縱性和熒光特性，當(dāng)其與目標(biāo)DNA 連接后，可直接通過熒光強(qiáng)度反應(yīng)目標(biāo)DNA的濃度。

3.4 基于病毒載體的藥物遞送系統(tǒng)

病毒高度對(duì)稱的空間結(jié)構(gòu)、可大規(guī)模生產(chǎn)，及其對(duì)宿主細(xì)胞的高效識(shí)別和入侵能力，使其成為非常有應(yīng)用前景的多功能載體，用于基因、藥物、成像試劑遞送系統(tǒng)的構(gòu)建［122］。然而，病毒載體存在一定的不足，例如容易被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除、血液循環(huán)時(shí)間短、腫瘤靶向性差、存在一定的毒副作用等［123-124］。因此，改善病毒載體的傳遞性能仍然是醫(yī)學(xué)上的一個(gè)挑戰(zhàn)。通過生物正交反應(yīng)進(jìn)行病毒功能化，可增強(qiáng)其對(duì)特定細(xì)胞的靶向 性、降 低毒 副作 用［84，125-127］。例如，Banerjee等［84］利用腺病毒作為基因遞送載體，并通過疊氮基團(tuán)修飾的糖分子功能化病毒糖蛋白，然后利用生物正交反應(yīng)將葉酸小分子修飾在病毒表面，使得目標(biāo)基因?qū)π∈蟀┘?xì)胞的遞送效率顯著增加（圖8）。Chatterjee 等［126］通過基因工程手段將疊氮化的非天然氨基酸（UAAs）插入腺病毒衣殼上的特定位點(diǎn)；進(jìn)而通過SPAAC 反應(yīng)使環(huán)狀RGD 肽特異性附著于病毒衣殼表面，實(shí)現(xiàn)病毒對(duì)腫瘤血管中過表達(dá)αvβ3 整合素受體細(xì)胞的靶向感染。本課題組［127］同時(shí)將具有腫瘤細(xì)胞靶向識(shí)別功能和抗巨噬細(xì)胞吞噬功能的兩種多肽，通過SPAAC 反應(yīng)與溶瘤痘苗病毒偶聯(lián)，構(gòu)建兼具腫瘤靶向及“隱身”功能的溶瘤痘苗病毒。該方法增強(qiáng)了痘苗病毒的腫瘤靶向性，延長了其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，可有效抑制腫瘤生長。另外，病毒還可以通過生物正交反應(yīng)將具有光、電、磁信號(hào)的納米元件裝載于病毒內(nèi)腔或者偶聯(lián)于病毒表面，構(gòu)成成像探針，用于疾病的檢測［128-129］。例如，Prasuhn 等［57］將炔基修飾的Gd（DOTA）類似物通過CuAAC 反應(yīng)與正二十面體的豇豆花葉病毒偶聯(lián)，構(gòu)建為T1 磁成像系統(tǒng)，與游離的Gd（DOTA）類似物相比，其弛豫性顯著增強(qiáng)，是一種非常有應(yīng)用前景的磁成像造影劑。

圖8 葉酸配體對(duì)腺病毒纖維蛋白的功能化示意圖［84］［O-GlcNAz摻入腺病毒的纖維蛋白（摻入位點(diǎn)用紅圈表示），進(jìn)而通過Click（1）或Staudinger（2）反應(yīng)將葉酸分子與腺病毒偶聯(lián)］Fig.8 A cartoon illustration for incorporating the O-GlcNAz residue with the adenoviral fiber protein and subsequent chemical modification with the ligand[84]［Potential sites for the O-GlcNAz incorporation are indicated with red circles.Either“Click”（1）or Staudinger ligation（2）chemistry is used to decorate metabolically labeled adenovirus.］

4 總結(jié)與展望

綜上所述，醛或酮與胺類化合物的縮合反應(yīng)、無痕施陶丁格反應(yīng)、疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)、逆電子效應(yīng)的狄爾斯-阿爾德反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)簡單、反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易分離純化、生物相容性好等特性，是進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂類、糖類、核酸及其代謝物功能化的常用工具，也是實(shí)現(xiàn)病毒不同組分修飾的重要方法。目前，化學(xué)家仍在不斷開發(fā)新的生物正交反應(yīng)，例如：光催化的四氮唑-烯烴環(huán)加成反應(yīng)、鈀/釕催化的生物正交反應(yīng)、基于四嗪-烯烴的生物正交剪切反應(yīng)等，為病毒不同組分的功能化提供更多的選擇。基于生物正交反應(yīng)的病毒功能化改造技術(shù)對(duì)病毒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要推動(dòng)作用，具體應(yīng)用方向包括：病毒感染機(jī)制的研究、病毒性疾病的診斷，以及以病毒為載體的基因、藥物、成像試劑遞送系統(tǒng)的構(gòu)建等。研究者需要根據(jù)病毒的實(shí)際應(yīng)用情況選擇合適的修飾策略與生物正交反應(yīng)類型，同時(shí)也要分析不同類型生物大分子在目標(biāo)病毒中的結(jié)構(gòu)組成和功能，結(jié)合病毒自身的結(jié)構(gòu)特性和功能屬性，選擇適合的功能化部位和功能化策略。比如對(duì)流感病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記，并用于研究該病毒的感染機(jī)制時(shí)，需要保證在病毒功能化過程中，其自身的感染力不受影響。因此，可選擇能夠精確控制目標(biāo)病毒中生物正交基團(tuán)的數(shù)量和位置的功能化策略，比如基于殘基定位法的非天然氨基酸引入技術(shù)和基于基因編碼的非天然氨基酸定點(diǎn)引入技術(shù)，且應(yīng)盡量避免對(duì)病毒表面糖蛋白進(jìn)行改造，以免因生物正交基團(tuán)的修飾導(dǎo)致病毒感染力下降，或者感染路徑的改變。如果病毒功能化的目的是為了進(jìn)行病毒相關(guān)藥物、疫苗的開發(fā)或者病毒性疾病的診斷等，這類對(duì)病毒自身感染力沒有要求的應(yīng)用時(shí)，則對(duì)其功能化的方式可有更多的選擇性，比如可通過生物偶聯(lián)或化學(xué)修飾的方式將生物正交基團(tuán)直接引入目標(biāo)病毒中，作為后續(xù)進(jìn)行病毒功能化的報(bào)告基團(tuán)。若將生物正交基團(tuán)引入病毒中，是為了進(jìn)行病毒疫苗的分離純化或病毒檢測等，要求對(duì)目標(biāo)病毒具有高度反應(yīng)特異性的應(yīng)用時(shí)，可以選擇疊氮-炔基、環(huán)烯基-四嗪等這些反應(yīng)基團(tuán)。它們本身在生物體系中是不存在的，但二者具有高度的反應(yīng)選擇性。因此，將其作為生物正交反應(yīng)的偶聯(lián)配體，可以有效避免病毒功能化過程中其他生物成分的干擾。另外，可根據(jù)實(shí)際情況將基于生物正交反應(yīng)的病毒功能

化策略與基因工程技術(shù)、生物偶聯(lián)技術(shù)、化學(xué)修飾技術(shù)、生物礦化技術(shù)、病毒蛋白的自組裝技術(shù)等多種病毒功能化改造技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)的精確調(diào)控，優(yōu)化病毒性能并賦予病毒更多的功能，進(jìn)而拓展病毒的應(yīng)用方向。