DNA納米技術(shù)與合成生物學(xué)

施茜，吳園園，楊洋

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，分子醫(yī)學(xué)研究院，上海 200127）

1 從經(jīng)典生物學(xué)到合成生物學(xué)

生命經(jīng)過億萬年的自然選擇，已經(jīng)進(jìn)化成為高度復(fù)雜、高度動(dòng)態(tài)、高度集成的體系，對于生命奧秘的認(rèn)識與研究是人類在科學(xué)道路上最近發(fā)生的事情，雖然成果斐然，但仍任重道遠(yuǎn)。人類在與自然界的接觸中，歷經(jīng)了從認(rèn)識、理解，到改造甚至創(chuàng)造世界的過程。經(jīng)典生物學(xué)作為人們認(rèn)識與理解世界的階段，往往從現(xiàn)象和表型出發(fā)，探求生命是什么與為什么：自林奈至達(dá)爾文，物種間靜態(tài)的相似性和動(dòng)態(tài)的進(jìn)化聯(lián)系得以描述和闡釋；自孟德爾至摩爾根，生物體性狀背后的基因本質(zhì)得以揭示，而其物質(zhì)基礎(chǔ)也呼之欲出；沃森和克里克通過對DNA 結(jié)構(gòu)的正確認(rèn)識，為基因找到了分子載體，使得生命科學(xué)的大廈終于可以與物理和化學(xué)科學(xué)的大廈連通。分子生物學(xué)的時(shí)代接踵而至，無論是從基于生物催化劑“酶”的生化反應(yīng)出發(fā)還是從經(jīng)典有機(jī)化學(xué)的反應(yīng)機(jī)制出發(fā)，人類對于DNA的合成、復(fù)制、剪切和連接等操作都漸漸駕輕就熟直至爐火純青。而相應(yīng)地，在人類進(jìn)行世界改造與創(chuàng)造的追求驅(qū)使下，以設(shè)計(jì)與構(gòu)造為出發(fā)點(diǎn)的新的生物學(xué)研究模式也進(jìn)入了快車道。

隨著經(jīng)典生物學(xué)對自然界認(rèn)知的不斷深入，合成生物學(xué)（synthetic biology）的概念應(yīng)運(yùn)而生（圖1）?！昂铣缮飳W(xué)”的名詞首次出現(xiàn)于1910 年Stéphane Leduc 的著作中，在接下來的100 年里逐步萌芽并不斷發(fā)展：從20 世紀(jì)60 年代Jacob 和Monod 乳糖操縱子的經(jīng)典研究，對利用分子組分組裝新系統(tǒng)的大膽設(shè)想［1］，到21 世紀(jì)初Nature雜志報(bào)道的通過結(jié)合大腸桿菌的基因合成的兩種基因線路［2-3］，再到最近劍橋生物學(xué)家們設(shè)計(jì)合成的命名為“Syn61”的首個(gè)人造大腸桿菌［4］，合成生物學(xué)已經(jīng)將人類帶入了改造世界和創(chuàng)造世界的新征程。合成生物學(xué)是利用工程學(xué)思想，由生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科進(jìn)行交叉，以重編改造天然體系或設(shè)計(jì)合成新的生物體系為目標(biāo)的新興學(xué)科，主要通過基因拼接或分子組裝，構(gòu)建生物學(xué)配件和體系以模擬甚至在某些場景下替代自然生命體系。合成生物學(xué)被認(rèn)為是面向未來的學(xué)科，從資本市場表現(xiàn)來看，合成生物行業(yè)正在走向爆發(fā)期，根據(jù)2020 年CB Insights 公司分析數(shù)據(jù)顯示，2019 年全球合成生物學(xué)市場規(guī)模達(dá)53 億美元。預(yù)計(jì)到2024 年，與2019 年相比，合成生物學(xué)市場規(guī)模的年復(fù)合增長率將增長28.8%，達(dá)到189億美元［5］。合成生物學(xué)的迅速崛起將人類對于生命的認(rèn)知、改造和創(chuàng)造能力提升到了一個(gè)全新的層次，也為解決一些全球性重大問題提供了重要途徑，并且將在生命健康、食品、環(huán)境、能源等諸多方面有廣泛應(yīng)用。

圖1 經(jīng)典生物學(xué)與合成生物學(xué)研究相應(yīng)關(guān)系與側(cè)重點(diǎn)概念圖Fig.1 Schematic diagrams showing the relationship and key concepts of classical biology and synthetic biology

2 DNA 納米技術(shù)：合成生物學(xué)的重要支持技術(shù)

合成生物學(xué)的支持技術(shù)主要包括人工染色體合成技術(shù)、人工蛋白組件設(shè)計(jì)合成技術(shù)、基因合成、編輯與測序技術(shù)、微流控技術(shù)、計(jì)算機(jī)建模與分子模擬技術(shù)等，它們幫助構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件，并在合成系統(tǒng)中逐級利用這些生物元件［6］。本文著重介紹的DNA 納米技術(shù)是一種人為設(shè)計(jì)并“自下而上”構(gòu)建核酸納米結(jié)構(gòu)的技術(shù)，這里的DNA 分子被用作結(jié)構(gòu)材料，而非遺傳信息載體。由于在納米級別的精確可控性，使得利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建“標(biāo)準(zhǔn)化”“模塊化”的工具，以至未來利用這些工具構(gòu)建工程化平臺成為可能。DNA納米技術(shù)在多個(gè)場景下服務(wù)于合成生物學(xué)，例如進(jìn)行生物大分子的有序裝配，構(gòu)建細(xì)胞元件、生物裝置和生化系統(tǒng)模擬甚至替代自然生命體系，構(gòu)建核酸納米藥物和腫瘤疫苗，從而推動(dòng)合成生物學(xué)底層技術(shù)的進(jìn)步，很大程度上激發(fā)了其市場的增長勢能，將人類對生命的認(rèn)識和改造能力提升到一個(gè)全新的層次。由此可見，DNA 納米技術(shù)已經(jīng)成為合成生物學(xué)中不可或缺的重要盟友。

DNA 納米技術(shù)自1982 年Nadrian Seeman［7］創(chuàng)立至今，已經(jīng)經(jīng)歷了40 年的蓬勃發(fā)展，并且在生物、醫(yī)學(xué)、材料、化學(xué)等領(lǐng)域具有極其廣泛的應(yīng)用［8］。2006 年DNA 折紙術(shù)［9］的出現(xiàn)降低了DNA納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)難度，提升了其可編程性，從而大大拓展了DNA 納米技術(shù)的應(yīng)用場景［10］。DNA折紙術(shù)的基本原理是基于堿基互補(bǔ)配對原則，使用上百條稱作訂書釘鏈（staple strand）的短鏈DNA 將一條稱作腳手架鏈（scaffold strand）的長鏈DNA折疊為預(yù)先設(shè)計(jì)的形狀，如正方形、矩形、三角形、星星和笑臉等形狀［9］［圖2（a）］。在隨后十余年的發(fā)展中，DNA 折紙術(shù)在結(jié)構(gòu)維度、結(jié)構(gòu)曲率、拓?fù)渚幙?、?dòng)態(tài)控制以及模塊化超組裝方面［11-15］［圖2（b）、（c）］不斷取得突破，實(shí)現(xiàn)了更精細(xì)、更巨大、更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組裝。

圖2 DNA折紙術(shù)基本原理及其發(fā)展（標(biāo)尺：50 nm）（a）DNA折紙術(shù)原理及二維組裝［9］；（b）三維組裝與彎曲控制［11］；（c）曲面設(shè)計(jì)與網(wǎng)狀編織［12-13］Fig.2 Basic principle of DNA origami and its development(Scale bar:50 nm)(a)Principle for the 2D assembly of DNA origami[9];(b)3D structure assembly with the bending control[11];(c)Design for curved surface and DNA gridiron[12-13]

近年來，以DNA 折紙術(shù)為代表的DNA 納米技術(shù)被逐步應(yīng)用于合成生物學(xué)研究，并且具有以下獨(dú)特優(yōu)勢：①高度可設(shè)計(jì)性，由于基于堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行自組裝，可以很容易地通過核酸鏈的設(shè)計(jì)來控制結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)一維到三維［16-18］、平直到彎曲［11-12］、孤立到復(fù)合［10，19］結(jié)構(gòu)的自組裝；②精確可尋址性，DNA 納米結(jié)構(gòu)還可以作為模板進(jìn)一步指導(dǎo)其他納米材料的精準(zhǔn)組裝，并且對數(shù)量、位置、距離等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行納米級精確控制，這些納米材料可以是無機(jī)材料，如金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）［20］，也可以是生物大分子，如核酸［21］、蛋白［16］、磷脂［22］等；③生物親和性，由于DNA 是天然存在的生物大分子，在構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)用于醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療時(shí)具有低免疫原性、低毒性等優(yōu)勢，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用前景；④模塊化組裝，通過模塊化組裝，可以大大提高結(jié)構(gòu)尺度，為在合成生物學(xué)的應(yīng)用提供了新的可能性。例如，DNA 磚塊是可以作為模塊的短鏈DNA，通過編程將它們像樂高積木那樣搭扣拼裝，可以將這些DNA 磚塊組裝成精確的形狀［23］，用于構(gòu)建（0.1～1）×109Da 的三維結(jié)構(gòu)［24］。近日，meta-DNA（元-DNA）策略的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了DNA 結(jié)構(gòu)的模塊化組裝，其組裝方式類似于短DNA 鏈的自組裝，可用于構(gòu)建更多宏觀規(guī)模的DNA 結(jié)構(gòu)，尺度可達(dá)亞微米-微米級［25］，甚至進(jìn)行鏈置換反應(yīng)［26］，未來有望在合成生物學(xué)和光電子學(xué)方面進(jìn)行應(yīng)用。

3 DNA納米技術(shù)服務(wù)于合成生物學(xué)

3.1 利用框架核酸實(shí)現(xiàn)生物大分子的有序裝配

DNA 納米技術(shù)由于具有高度的可設(shè)計(jì)性和空間可尋址性，已經(jīng)成熟地應(yīng)用于對無機(jī)材料進(jìn)行有序裝配，例如AuNP、碳納米管、高分子聚合物等。AuNP 可以通過與巰基修飾的DNA 形成硫金鍵結(jié)合在DNA 納米結(jié)構(gòu)上，實(shí)現(xiàn)在一維、二維或三維的DNA 框架上數(shù)量、位置可控的排列［27］。碳納米管通過末端修飾或中段綁定，也可以在DNA納米結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)可控角度、位置的組裝［28-30］，甚至可以在酶的催化下實(shí)現(xiàn)固定長度的切割［31］。此外，聚（2，5-二烷氧基）對苯乙烯-DNA 刷狀聚合物［32］、聚多巴胺［33］等也可以在DNA折紙結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)定位與排列。

除了無機(jī)材料和人工高分子材料，DNA 納米結(jié)構(gòu)也大量應(yīng)用于生物大分子的有序裝配。由于能夠精確控制裝配材料的數(shù)量、距離和方向，DNA 納米結(jié)構(gòu)在對生物大分子進(jìn)行有序裝配方面具有極大的優(yōu)勢。以下將從分子類型的角度，分別介紹基于DNA 折紙結(jié)構(gòu)的核酸裝配、蛋白裝配和磷脂裝配等方向的進(jìn)展。

3.1.1 核酸裝配

DNA 折紙結(jié)構(gòu)自身的核酸屬性為其作為模板對靶分子核酸片段的進(jìn)一步裝配提供了便捷條件，利用折紙結(jié)構(gòu)特定位置上訂書釘鏈延伸出相應(yīng)序列，即可通過分子雜交的方法實(shí)現(xiàn)溶液中靶標(biāo)核酸分子（包括DNA 和RNA）的識別與結(jié)合。2005 年，Lund 等［21］設(shè)計(jì)了3×3 的納米網(wǎng)格，并在每個(gè)網(wǎng)格節(jié)點(diǎn)伸出的9 nt的黏性末端上各雜交一段不同的寡核苷酸鏈作為該節(jié)點(diǎn)的標(biāo)簽，應(yīng)用鏈親和素標(biāo)記的方法實(shí)現(xiàn)了原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）下對節(jié)點(diǎn)的精確定位。Ke 等［34］利用DNA 折紙術(shù)構(gòu)建了矩形核酸探針模塊，表面伸出的單鏈DNA 片段能夠通過“V 字形”連接的方法與溶液中的RNA 形成DNA-RNA 雜交鏈，從而實(shí)現(xiàn)了RNA 在納米尺度的有序裝配［圖3（a）］，被用于多種RNA序列的無標(biāo)記檢測。

圖3 核酸分子裝配及應(yīng)用（a）RNA識別陣列［34］；（b）DNA機(jī)器與分子搬運(yùn)［46］Fig.3 Assembly and applications of nucleic acid molecules(a)RNA recognition array[34];(b)DNA machines and molecular handling[46]

由于核酸互補(bǔ)雜交反應(yīng)是基于多重氫鍵和堿基堆疊的多弱相互作用，因此可以根據(jù)核酸鏈的長度和序列進(jìn)行精準(zhǔn)細(xì)致的調(diào)節(jié)，這一優(yōu)勢為核酸的動(dòng)態(tài)結(jié)合提供了基礎(chǔ)，并用于構(gòu)建納米條形碼、分子計(jì)算機(jī)和分子步行器（DNA walker）。實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)組裝的第一種方式是利用短鏈DNA 瞬時(shí)概率性的互補(bǔ)雜交，在DNA 納米結(jié)構(gòu)模板的特定位置實(shí)現(xiàn)熒光閃爍，通過對熒光閃爍的持續(xù)記錄、信號疊加以及基于泊松分布的位置計(jì)算，該位置可以以納米級別的分辨率呈現(xiàn)出來，這一全新技術(shù)被稱為DNA-PAINT（DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography），它為超分辨熒光顯微成像技術(shù)家族增添了新鮮血液?；贒NA-PAINT 技術(shù)，哈佛大學(xué)Lin 等［35］在一條含平行6 條雙鏈螺旋的DNA 長棒上通過三色熒光構(gòu)建了簡易的條形碼系統(tǒng)，在混合熒光的應(yīng)用下實(shí)現(xiàn)了216種獨(dú)立條碼的高分辨成像。

基于DNA的分子計(jì)算是動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的前沿領(lǐng)域，其基礎(chǔ)是鏈置換反應(yīng)，該反應(yīng)起始于目標(biāo)結(jié)構(gòu)的單鏈區(qū)（toehold），加入的啟動(dòng)鏈可以通過分支遷移取代掉預(yù)先雜交DNA 鏈，置換下的DNA 鏈又可以作為下個(gè)鏈取代反應(yīng)的啟動(dòng)鏈。Seelig 等［36］首先基于鏈取代反應(yīng)設(shè)計(jì)了邏輯門，包括與門（AND）、或門（OR）和非門（NOT）。隨后，Qian和Winfree［37］在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種新的邏輯門，由130 條DNA 鏈構(gòu)成，可以實(shí)現(xiàn)四位二進(jìn)制數(shù)的開方運(yùn)算。上述DNA 計(jì)算往往基于若干條寡核苷酸鏈彼此之間結(jié)合或解體的競爭過程，而其表征依賴于熒光信號的增強(qiáng)或衰減曲線的解讀，因此并不利于直觀觀察。DNA 結(jié)構(gòu)組裝技術(shù)為DNA計(jì)算的可視化提供了新思路，當(dāng)DNA模塊間的組裝行為被邏輯運(yùn)算法則所規(guī)定的時(shí)候，其運(yùn)算結(jié)果可以以圖案的形式展現(xiàn)。在過去幾年中，Qian 的團(tuán)隊(duì)通過正方形DNA 折紙模塊的邊界信息編輯，實(shí)現(xiàn)了隨機(jī)迷宮［38］、蒙娜麗莎、公雞、電子線路等圖樣的組裝［14］；利用“模塊置換反應(yīng)”（tile displacement）讓DNA 自行運(yùn)行井字格游戲（tic-tac-toe game）［39］；利用“贏者通吃”的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)策略實(shí)現(xiàn)了基于DNA 邏輯線路的圖像識別［40］。2019 年，Winfree 和哈佛大學(xué)的尹鵬［41］合作利用355 條單鏈DNA 模塊實(shí)現(xiàn)了連續(xù)邏輯線路的生長和圖像化，這些邏輯線路可以攜載6 個(gè)bit 的算法，進(jìn)行隨機(jī)游走、乘法、排序、選舉等操作，并將數(shù)字化的結(jié)果直接以組裝出的條帶在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)出來。這些進(jìn)步展示了抽象算法與具象分子組裝之間的完美契合，也代表了一類基于DNA模板的核酸裝配的發(fā)展方向。

DNA 分子步行器是可以沿著特定路線或軌道行走的DNA 納米結(jié)構(gòu)。基于前文所述的鏈置換反應(yīng)，DNA 結(jié)構(gòu)通過不同結(jié)構(gòu)域在軌道上的先后結(jié)合和解體，即可實(shí)現(xiàn)步進(jìn)式的定向運(yùn)動(dòng)。早在2004 年，Sherman 等［42］即通過分步加入DNA 鏈，實(shí)現(xiàn)了兩足結(jié)構(gòu)在既定的線性軌道上前進(jìn)或后退。Gu 等［43］利用類似的原理在DNA 折紙結(jié)構(gòu)的模板上實(shí)現(xiàn)了一個(gè)三角形結(jié)構(gòu)的步進(jìn)控制，并在步進(jìn)過程中完成了結(jié)構(gòu)搭載和釋放金納米顆粒貨物的應(yīng)用。另一類自動(dòng)步進(jìn)器拋開了復(fù)雜低速的鏈置換反應(yīng)，而是通過酶切反應(yīng)消耗軌道上的核酸燃料驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)。Tian 等［44］設(shè)計(jì)了一種包含DNA酶的DNA 納米結(jié)構(gòu)，可以不斷地從底物分子（RNA）中提取化學(xué)能，并利用這種能量來推動(dòng)DNA 裝置在一維軌道上的單向運(yùn)動(dòng)。基于相同原理，Lund 等［45］設(shè)計(jì)了一款分子蜘蛛（molecular spider），可以通過感應(yīng)和修飾二維DNA 折紙上的底物分子的軌跡，來實(shí)現(xiàn)包括“起始”“跟隨”“轉(zhuǎn)彎”“停止”的定向運(yùn)動(dòng)。值得注意的是，上述裝置由于在運(yùn)動(dòng)過程中擦除了軌道，從而無法逆向或可控運(yùn)行，是一類一次性運(yùn)動(dòng)器件。而2017 年Qian 和Winfree 課題組［46］設(shè)計(jì)的新型分子機(jī)器利用雙腳在二維模板上交替站穩(wěn)的策略，一定程度上犧牲了分子機(jī)器運(yùn)動(dòng)的定向性，但實(shí)現(xiàn)了軌道的無損使用［圖3（b）］。采用這一系統(tǒng)分子機(jī)器仍然可以在隨機(jī)游走的過程中，利用結(jié)合能力差異將分子貨物從起始點(diǎn)分選并運(yùn)送到目的地。

3.1.2 蛋白裝配

在細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)，蛋白的協(xié)同作用并不是空間上隨機(jī)的，它們往往需要一定的空間排布和種類數(shù)量才可以高效行使功能。然而，以往的技術(shù)在納米級對蛋白進(jìn)行有序裝配存在相當(dāng)大的困難，而DNA 可以和蛋白進(jìn)行有效結(jié)合，這樣利用DNA 納米結(jié)構(gòu)的可尋址性，可以在預(yù)先設(shè)計(jì)的位置進(jìn)行修飾，完成對蛋白的精確排布，操作較為簡單。

目前，對DNA 進(jìn)行蛋白裝配的方法主要包括非共價(jià)偶聯(lián)和共價(jià)偶聯(lián)（表1）。非共價(jià)偶聯(lián)主要利用DNA 上修飾的配體和蛋白之間的相互作用形成DNA-蛋白復(fù)合物，主要包括以下方式：生物素-鏈親和素［47］、Ni-NTA-Histag［48］、抗體-抗原［49］、核酸適配體-蛋白［50］、DNA結(jié)合蛋白［51］（例如鋅指蛋白）、RNA-病毒蛋白［52］、DNA-衣殼蛋白［53］等。非共價(jià)偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)是具有可逆性，然而在特定狀態(tài)下，這種結(jié)合并不穩(wěn)定，這就需要共價(jià)偶聯(lián)的方式獲得更加穩(wěn)定的DNA-蛋白復(fù)合物。共價(jià)偶聯(lián)的方式又分為非特異性的和特異性的。N-琥珀酰亞氨基3-（2-吡啶基二硫代）-丙酸鹽［N-succinimidyl 3-（2-pyridyldithio）-propionate，SPDP］［54］和磺基丁二酰亞胺-4-（N-馬來亞胺甲基）-環(huán)己烷-1-羧酸酯［Nsuccinimidyl 3-（2-pyridyldithio）-propionate，Sulfo-SMCC］［55］作為小分子交聯(lián)劑，可以通過連接蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基和DNA 上的巰基將蛋白質(zhì)和DNA 進(jìn)行非特異性共價(jià)偶聯(lián)。而進(jìn)行特異性共價(jià)偶聯(lián)則通常會引入一個(gè)tag蛋白，tag蛋白通過融合到目標(biāo)蛋白來提供自催化反應(yīng)位點(diǎn)，用以和小分子標(biāo)記的DNA 進(jìn)行反應(yīng)。常用的tag 蛋白包括人O6-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶（SNAP-tag）［56］和鹵代烷脫鹵酶［57］（Halo-tag）。

表1 蛋白裝配的分類Tab.1 Classification of protein assembly

解決了修飾問題，人們便可以通過設(shè)計(jì)DNA框架，精確控制蛋白類研究對象的種類、數(shù)量、間距等重要參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對蛋白位置和功能的調(diào)控。Voigt 等［58］構(gòu)建了矩形DNA 納米結(jié)構(gòu)，并在選定位置的訂書釘鏈上進(jìn)行生物素修飾，這樣單個(gè)化學(xué)鍵的形成或斷裂將導(dǎo)致生物素-鏈親和素復(fù)合物的附著或去除，這一過程可以運(yùn)用AFM 進(jìn)行表征，通過不同的蛋白分子排布，實(shí)現(xiàn)對單分子化學(xué)反應(yīng)的表征。Rinker 等［59］將多親和力的核酸適配體裝配在矩形DNA 納米結(jié)構(gòu)上，它們可以作為“鉗子”來捕獲和展示納米陣列上的凝血酶分子，并通過AFM 研究了“鉗子”寬度對捕獲效率的影響，加深了對適配體-蛋白相互作用的認(rèn)識。擺臂（swinging arm）是許多天然存在的多酶復(fù)合物中多步催化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵功能部分，它能通過柔性接頭（linker）共價(jià)連接于酶復(fù)合物上，從而使底物分子在復(fù)合物的多個(gè)活性位點(diǎn)之間直接轉(zhuǎn)移。而利用DNA 納米技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對這些位點(diǎn)距離的精確調(diào)控，這種納米級別對位置參數(shù)的控制是其他技術(shù)較難達(dá)到的。Fu等［60］將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6pDH） 和蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase，MDH）裝配在DX 結(jié)構(gòu)模塊（double crossover tile）兩端，并在其中間放置了輔酶NAD+修飾的人工擺臂，實(shí)現(xiàn)了這兩種脫氫酶之間的氫化物轉(zhuǎn)移和級聯(lián)反應(yīng)效率的提高，并且可以利用DNA 納米結(jié)構(gòu)的可尋址性，精確控制關(guān)鍵參數(shù)（包括位置、化學(xué)計(jì)量和酶間距離）以獲得最佳活性。Ke等［61］進(jìn)一步引入乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）并將該體系拓展放置在矩形的DNA 折紙結(jié)構(gòu)上，把輔酶NAD+參與的兩套酶聯(lián)反應(yīng)路徑以前置G6pDH酶為中心向兩側(cè)排列，通過鏈置換反應(yīng)把NAD+擺臂選擇性錨定在不同的路徑上，即可相應(yīng)開啟該酶聯(lián)通路［圖4（a）］。這些研究利用DNA 納米技術(shù)對蛋白進(jìn)行精確裝配，推動(dòng)了蛋白功能研究甚至級聯(lián)生化反應(yīng)的功能研究，為酶促反應(yīng)的精細(xì)研究和調(diào)控提供了全新的平臺。

3.1.3 磷脂裝配

除了對核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行有序裝配，對于磷脂這一雙親性生物大分子，DNA納米框架可以實(shí)現(xiàn)對誘導(dǎo)生長出的人工脂質(zhì)體大小、形狀的精確控制。2016年，Yang等［62］利用剛性DNA納米環(huán)指導(dǎo)磷脂分子作為種子（seed）進(jìn)行有序裝配，隨后利用透析法在納米環(huán)內(nèi)誘導(dǎo)生長出大小可控、均一化的人工脂質(zhì)體［圖4（b）］，提供了新的脂質(zhì)雙層膜指導(dǎo)形成的方法，為囊泡運(yùn)輸和藥物遞送的研究提供了有價(jià)值的研究工具。利用同樣的誘導(dǎo)脂質(zhì)體生長的方法，還可以通過調(diào)節(jié)DNA 框架的幾何結(jié)構(gòu)以完成對其中納米囊泡形狀的精確控制。Zhang等［63］構(gòu)建了模塊化的DNA 納米籠，通過改變納米籠的排列和構(gòu)象，誘導(dǎo)生長出了串珠、管狀、螺旋狀、環(huán)管狀的人工脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。相比三維球狀的脂膜結(jié)構(gòu)，平面可視化的二維平面膜（納米脂盤）在膜蛋白的顯微研究方面有著巨大的工具優(yōu)勢，而大面積的二維平面脂膜制備始終是一個(gè)難題。針對這一問題，哈佛大學(xué)的Zhao 等［64］利用環(huán)狀剛性的DNA納米框架定位組裝了一圈小納米盤并誘導(dǎo)它們生長充滿了環(huán)內(nèi)的二維平面，形成90 nm 直徑的巨大納米脂盤，并應(yīng)用于通道蛋白VDAC-1和脊髓灰質(zhì)炎病毒的展示和成像［圖4（c）］。上述進(jìn)展顯示了DNA 納米結(jié)構(gòu)框架在制備、調(diào)控生物膜體系方面所具有的重要價(jià)值和應(yīng)用潛力。

圖4 蛋白組裝與磷脂組裝（a）酶促反應(yīng)介導(dǎo)與調(diào)控［61］；（b）可控尺寸囊泡組裝［62］；（c）二維磷脂膜組裝［64］Fig.4 DNA nanoframe-directed assembly of proteins and phospholipids(a)DNA swing arm and regulation on cascade enzymatic reactions[61];(b)Vesicles with controllable sizes[62];(c)Two-dimensional lipid bilayer assembly[64]

3.2 利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建仿生細(xì)胞元件、生物裝置和生化系統(tǒng)

合成生物學(xué)的一個(gè)重要研究任務(wù)是模擬自然界已有的生物學(xué)配件和體系，甚至在某些場景下替代自然生命體系。然而，由于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和各種生化活動(dòng)的時(shí)空復(fù)合性，僅依靠傳統(tǒng)技術(shù)對其模擬具有很大的困難。而DNA納米技術(shù)由于在納米級別的精確可控性，在模擬細(xì)胞的很多生物配件例如核孔、人工膜通道、網(wǎng)格蛋白等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢；并且由于利用DNA納米技術(shù)可以對生物大分子進(jìn)行有序裝配，使其對構(gòu)建具有復(fù)合結(jié)構(gòu)的生物裝置和系統(tǒng)，模擬體內(nèi)生物過程、體內(nèi)合成體系具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。下文將從組裝仿生細(xì)胞元件、模擬生物過程和構(gòu)建生化系統(tǒng)三個(gè)方面進(jìn)行介紹。

3.2.1 組裝仿生細(xì)胞元件

核孔是核質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)交換的重要通道，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，內(nèi)徑約40 nm，內(nèi)部有一定數(shù)量無序的核孔蛋白（nucleoporins，nups），它們富含苯丙氨酸（FG）氨基酸殘基，又稱為FG-nups。為模擬天然核孔結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài)，F(xiàn)isher 等［55］構(gòu)建了內(nèi)徑為46 nm 的DNA 納米環(huán)，該結(jié)構(gòu)向內(nèi)伸出多個(gè)錨定序列，可以再連接8個(gè)、16個(gè)、24個(gè)或32 個(gè)FG-nups［圖5（a）］，應(yīng)用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和AFM對該人工核孔進(jìn)行表征，深入研究了該人工核孔中FG 結(jié)構(gòu)域的拷貝數(shù)和構(gòu)型對“核孔”結(jié)構(gòu)的影響，對探討核孔結(jié)構(gòu)通透性的建立有著重要的價(jià)值。類似的，Ketterer 等［65］設(shè)計(jì)了內(nèi)徑為34 nm 的人工核孔，該結(jié)構(gòu)向內(nèi)伸出不同數(shù)量的FG-nups或者其親水突變體，探討了數(shù)量和親水突變體對核孔內(nèi)部蛋白密度和電導(dǎo)率的影響。

圖5 構(gòu)建仿生細(xì)胞元件（a）模擬核孔復(fù)合體［55］；（b）模擬細(xì)胞骨架蛋白［70］Fig.5 Mimic and construction of cell elements(a)Simulation of the nuclear pore complex [55];(b)Simulation of cytoskeleton protein and network [70]

另一DNA 納米結(jié)構(gòu)在仿生細(xì)胞元件上的重要應(yīng)用是構(gòu)建人工膜通道。天然的膜通道多由蛋白質(zhì)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)精巧，可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外的小分子和離子的被動(dòng)擴(kuò)散或者主動(dòng)運(yùn)輸。目前，研究人員試圖利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建人工膜通道，用來模擬天然離子通道，甚至向細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分子運(yùn)輸。2012 年，Langecker 等［66］設(shè)計(jì)了由54 條平行DNA螺旋束構(gòu)成的人工離子通道，通過膽固醇修飾可以使頭部的桶狀結(jié)構(gòu)固定在人造脂質(zhì)雙層膜上，中央6條螺旋束圍成的莖狀結(jié)構(gòu)則穿過膜結(jié)構(gòu)，在單通道電生理測量中該結(jié)構(gòu)具有與天然離子通道類似的響應(yīng)，然而該結(jié)構(gòu)未在活細(xì)胞上進(jìn)行測試。近 期 ， Lü 等［67］構(gòu) 建 了 硫 代 磷 酸（phosphorothioate，PPT）修飾的人工膜通道，該結(jié)構(gòu)由6 條DNA 螺旋束圍成，內(nèi)徑為2 nm，并證實(shí)這種結(jié)構(gòu)可以將離子和小分子抗腫瘤藥物分別運(yùn)輸至神經(jīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，成功模擬了生物分子跨活細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。除了上述兩項(xiàng)代表性工作，近年來大量基于DNA 納米結(jié)構(gòu)的人工跨膜孔道體系被構(gòu)建出來，英國倫敦大學(xué)學(xué)院的Howorka 課 題 組［68］在2021 年 初 的 一 篇Nature Protocol文章中細(xì)致綜述了各類孔道的跨膜機(jī)制和設(shè)計(jì)制備原則方法，為領(lǐng)域內(nèi)和跨領(lǐng)域研究者進(jìn)行相關(guān)工具的開發(fā)與應(yīng)用提供了重要的參考。

網(wǎng)格蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的單元模塊，它具有特征性的三聯(lián)體骨架結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)吞過程中自組裝形成多面體晶格，逐漸覆蓋在細(xì)胞膜上，最終使脂質(zhì)雙層內(nèi)陷并脫離細(xì)胞膜［69］。Journot等［70］模擬網(wǎng)格蛋白三聯(lián)體（triskelion）設(shè)計(jì)了三臂的DNA 納米結(jié)構(gòu)，利用膽固醇可以將其錨定在脂質(zhì)單分子或者雙分子層上，加入訂書釘鏈后可以誘導(dǎo)其形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［圖5（b）］。利用TEM可以觀察到三臂結(jié)構(gòu)聚集引起的脂質(zhì)單分子層的局部變形，這一過程類似網(wǎng)格蛋白誘導(dǎo)的小凹形成。

3.2.2 模擬生物過程

運(yùn)用DNA 納米技術(shù)可以構(gòu)建仿生裝置，對生物體內(nèi)大量分子參與的復(fù)雜生理過程進(jìn)行模擬，有助于將復(fù)雜的生命現(xiàn)象在體外進(jìn)行簡單的模式化研究，并且能夠在體外對各種參數(shù)進(jìn)行精確的控制。大部分生物膜相關(guān)的生理生化反應(yīng)是由膜蛋白驅(qū)動(dòng)，磷脂雙分子層共同參與的復(fù)雜過程。傳統(tǒng)生化研究方法雖然可以得到大致的分子組成信息、環(huán)境信息和初末狀態(tài)信息，并提出一定的合理假設(shè)，但對于真實(shí)狀態(tài)的分子時(shí)空排布與變構(gòu)、磷脂膜的應(yīng)變過程等信息的獲取無能為力。耶魯大學(xué)的Lin Chenxiang 課題組近年來做出了一系列重要工作，利用DNA 納米結(jié)構(gòu)為上述問題的研究提供了全新的工具。

膜融合是一種重要的生命現(xiàn)象，可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）在這一過程中起到了關(guān)鍵作用。SNARE 蛋白復(fù)合體由三種蛋白構(gòu)成：質(zhì)膜蛋白（t-SNAREs）Synaxin 1、25kDa 的突觸小體相關(guān)蛋白（STX1 和SNAP25A）和囊泡蛋白（v-SNARE）synaptobrevin-2（VAMP2）。Xu 等［71］構(gòu)建了DNA 納米環(huán)，通過錨定序列可以將一定數(shù)量的VAMP2 和脂質(zhì)固定在納米環(huán)上并指向環(huán)的內(nèi)部，并且設(shè)計(jì)了一對DNA系鏈（tether）v-tether和t-tether 來模擬天然的系鏈蛋白，修飾DNA v-tether小型單層膜囊泡 （small unilamellar vesicles，SUV）可以通過疏水作用組裝到納米環(huán)上，這樣能夠和修飾了DNA t-tether 的支持脂質(zhì)雙層（supported lipid bilayers，SBL）組成生物裝置來模擬SNARE 蛋白介導(dǎo)的錨定和膜融合的過程［圖6（a）］，該研究證明了僅僅一兩對SNARE 復(fù)合物足以誘導(dǎo)膜融合反應(yīng)的發(fā)生。

圖6 模擬生物過程和生化體系（a）模擬蛋白錨定和膜融合［71］；（b）囊泡成管［74］；（c）RNA擠出納米工廠［75］；（d）自組裝合成衣殼蛋白［52］；（e）自主調(diào)控凝血系統(tǒng)［77］；（f）肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)［78］Fig.6 Mimic king biological reactions and biochemical systems(a)Simulation of SNAREs protein-induced membrane fusion[71];(b)Mimicking BAR protein-induced membrane tubulation [74];(c)Producing RNA in a nanofactory[75];(d)Assembly TMV capsid protein on the DNA template [52];(e)Autonomous regulation of the thrombin dependent coagulation[77];(f)Simulation of the G-actin movement [78]

兩片鄰近的磷脂膜之間發(fā)生磷脂分子的交換傳遞現(xiàn)象也是一種重要而神秘的生理現(xiàn)象，通常發(fā)生在膜接觸的部位。為了研究這些特定位點(diǎn)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)理，Bian等［72］構(gòu)建了DNA折紙結(jié)構(gòu)，可以精確控制兩個(gè)脂質(zhì)體之間的距離，并應(yīng)用該結(jié)構(gòu)研究了突觸結(jié)合蛋白樣線粒體脂質(zhì)結(jié)合蛋白（synaptotagmin-like mitochondrial lipidbinding protein，SMP）結(jié)構(gòu)域的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在超過SMP 二聚體長度的距離上，符合脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)拇┧竽Ｐ汀?/p>

成管過程在細(xì)胞內(nèi)吞、病毒出芽和胞質(zhì)分裂中扮演著重要的角色。多種膜變形蛋白可以感知并且產(chǎn)生膜曲率，從而幫助細(xì)胞膜成管［73］。為模擬動(dòng)力蛋白（dynamins）和內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，

ESCRT）聚合成螺旋結(jié)構(gòu)包裹脂質(zhì)微管的過程，Grome 等［74］構(gòu)建了DNA 折紙卷曲（curls）用來誘導(dǎo)大型單層膜囊泡（large unilamellar vesicles，LUV）的成管［圖6（b）］。這種DNA 卷曲能夠自組裝成類似Snf7 的長絲狀螺旋結(jié)構(gòu)，并且在其內(nèi)表面修飾兩親性肽來模擬Snf7的N段ANCHR螺旋用以增強(qiáng)其膜親和性。

3.2.3 構(gòu)建生化體系

從工程化的角度看，生物體內(nèi)部有著各種復(fù)雜的生理生化體系負(fù)責(zé)物質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)組裝、信號調(diào)控和能量輸出等具體任務(wù)。利用DNA 納米技術(shù)，模擬生命在體外構(gòu)建人工體系是非常有趣的方向，不但有助于加深對天然體系的認(rèn)識，也為諸如人工細(xì)胞等復(fù)雜仿生體系的構(gòu)建提供可用模塊。

2020 年，Hahn 等［75］設(shè)計(jì)了一款RNA 擠出納米工廠（nanofactory），可以對RNA 進(jìn)行完整的滾環(huán)轉(zhuǎn)錄和加工。他們構(gòu)建了外部直徑為60 nm 的DNA 折紙桶裝結(jié)構(gòu)作為“廠房”，內(nèi)部“機(jī)器”在其中按一定空間構(gòu)象排列［圖6（c）］。內(nèi)部的“機(jī)器”包括：①RNA產(chǎn)生單元，由DNA模板和RNA聚合酶組成，進(jìn)行滾環(huán)轉(zhuǎn)錄，平均每30 min 能夠產(chǎn)生100 個(gè)拷貝的目標(biāo)RNA；②RNA 加工單元，RNA 內(nèi)切酶可以進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從聚合體切割為單體，從而使加工效率提高30%。納米工廠提供了一種RNA 轉(zhuǎn)錄和加工的體外模型，用以研究RNA 分子排列對其功能的影響，并且為體外生產(chǎn)RNA以外的其他材料提供了新思路。

為模仿病毒衣殼蛋白的合成過程，研究人員又設(shè)計(jì)了體外蛋白合成體系，將DNA 納米結(jié)構(gòu)作為模板，可以在其上雜交RNA 鏈，用于合成衣殼蛋白并完成自組裝。2018年，Zhou等［52］構(gòu)建了棒狀、三角形和三腳架DNA 納米結(jié)構(gòu)，并將煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）基因組來源的RNA 鏈通過錨定位點(diǎn)連接在這些結(jié)構(gòu)上，這段RNA 序列上包含了裝配序列的起始段，可以原位介導(dǎo)衣殼蛋白的合成，而衣殼蛋白會自組裝為圓柱體結(jié)構(gòu)［圖6（d）］。該研究為精確設(shè)計(jì)并合成DNA-蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)提供了新的路徑。在此研究的基礎(chǔ)上，Zhou 等［76］又設(shè)計(jì)了動(dòng)態(tài)組裝TMV 衣殼蛋白的體系，通過間隔設(shè)計(jì)錨定位點(diǎn)，可以將TMA-RNA 按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在DNA 納米結(jié)構(gòu)上，而錨定位點(diǎn)的延長鏈中包含了可以進(jìn)行鏈置換反應(yīng)的toehold 區(qū)域，加入信號鏈則觸發(fā)RNA 鏈的釋放，進(jìn)而能夠進(jìn)行衣殼蛋白的原位組裝，若RNA 未成功釋放，則組裝中止，該體系探討了實(shí)現(xiàn)可編程DNA-蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)組裝的可能性。

凝血系統(tǒng)是高等生物體內(nèi)非常復(fù)雜和達(dá)到精致平衡的體系，其調(diào)節(jié)失衡將導(dǎo)致血栓或溶血兩個(gè)方向的致命后果。Yang 等［77］利用一種桶狀DNA 納米結(jié)構(gòu)模板（結(jié)構(gòu)部）搭建了一組由凝血酶傳感器、閾值控制和凝血抑制劑生成器三個(gè)模塊組成的自主調(diào)控系統(tǒng)（計(jì)算部）［圖6（e）］，可以通過調(diào)節(jié)傳感模塊和閾值模塊的比例，在模擬生物血漿的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)對抗凝激活濃度的任意調(diào)節(jié)，并為該體系在不同醫(yī)療場景中對凝血酶活性自主調(diào)控開啟了可能性。

肌小節(jié)是肌纖維收縮的基本功能單位，由肌球蛋白構(gòu)成（myosins），可以自組裝成粗肌絲，可以在高度結(jié)構(gòu)化的晶格中與基于肌動(dòng)蛋白（actin）的細(xì)肌絲相互作用。在模擬天然粗肌絲的形態(tài)方面，F(xiàn)ujita 等［78］構(gòu)建了棒狀DNA 納米結(jié)構(gòu)，并將肌球蛋白IIa通過linker連接在結(jié)構(gòu)上，這樣可以在有限的空間內(nèi)直接觀察力產(chǎn)生過程中肌動(dòng)蛋白頭部的運(yùn)動(dòng)［圖6（f）］。他們發(fā)現(xiàn)頭部擴(kuò)散時(shí)，會與肌動(dòng)蛋白發(fā)生弱相互作用，隨后像布朗棘輪一樣優(yōu)先與前部區(qū)域緊密結(jié)合。在牢固結(jié)合后，兩級杠桿臂擺動(dòng)主要在第一步停止，偶爾會反轉(zhuǎn)方向。利用該裝置可以實(shí)現(xiàn)對多個(gè)參數(shù)進(jìn)行精確控制，例如傾斜步數(shù)、杠桿角度、弱相互作用的結(jié)合和分離動(dòng)力學(xué)，以及空間不對稱性。

綜上，DNA 納米組裝結(jié)構(gòu)在指導(dǎo)生物大分子組裝并構(gòu)建仿生元件、過程、體系方面有著獨(dú)特優(yōu)勢，因此DNA 納米技術(shù)在合成生物學(xué)領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

4 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 藥物遞送

裸露的治療藥物（包括小分子和生物分子藥物），溶解性較低，對酶和化學(xué)降解的穩(wěn)定性較差，具有一定副作用和毒性，且往往難以越過生物屏障，因此大多數(shù)時(shí)候無法在體內(nèi)發(fā)揮其全部療效［79］。近年來，DNA 納米結(jié)構(gòu)由于具有結(jié)構(gòu)可控性和生物親和性，在開發(fā)藥物遞送方面有非常大的優(yōu)勢，可以用于增加載藥量、延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，從而獲得更好的療效［79-80］。

從可控性角度看，具有開關(guān)功能的DNA 納米結(jié)構(gòu)可以在一定條件下打開并釋放內(nèi)容物，因此在藥物靶向遞送方面有著很大的應(yīng)用潛力。2012 年，Douglas 等［81］構(gòu)建的一種邏輯門控的DNA 納米機(jī)器人，可以將負(fù)載的分子藥物遞送給靶細(xì)胞。該機(jī)器人為六角套筒形的結(jié)構(gòu)，分子藥物通過共價(jià)修飾連接到結(jié)構(gòu)內(nèi)部，兩對核酸適配體-互補(bǔ)序列分別修飾在機(jī)器人前部兩側(cè)，組成一套“與”計(jì)算的邏輯門控體系，只有當(dāng)兩個(gè)核酸適配體都和抗原結(jié)合才能打開結(jié)構(gòu)，暴露其中的有效載荷［圖7（a）］。

從載藥角度，DNA 納米結(jié)構(gòu)已被成功用于小分子藥物、siRNA 等分子的搭載［79］。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種常用的小分子藥物，具有抗腫瘤的作用，然而它的脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致心肌損傷，因此選用合適的遞送方式非常重要。而DOX 具有插層作用，能夠插入到DNA 中并降低其扭轉(zhuǎn)應(yīng)力［82］，并且搭載到DNA 納米結(jié)構(gòu)上的方式也較為簡單［83］。小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是一個(gè)20～25 個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，主要參與RNA 干擾，可以特異性地沉默靶基因用于基因治療［84］。siRNA 引起的免疫反應(yīng)較小，然而最大的問題是體內(nèi)的穩(wěn)定性較低，可以利用DNA 納米結(jié)構(gòu)搭載siRNA 增加其穩(wěn)定性［85］。siRNA 可以通過與DNA 納米結(jié)構(gòu)伸出的錨定序列雜交［86-87］連接到結(jié)構(gòu)上。此外，還可以同時(shí)在DNA 納米結(jié)構(gòu)上搭載多種藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。例如，Liu 等［88］構(gòu)建了三角形的DNA 納米結(jié)構(gòu)，同時(shí)搭載了腫瘤治療基因P53 和小分子藥物DOX，可用于多藥耐藥性腫瘤人乳腺癌MCF-7R細(xì)胞系的聯(lián)合治療，在體內(nèi)體外均能有效抑制腫瘤增長，且無明顯全身毒性。

近年來，研究人員利用不同形狀的DNA 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大量細(xì)胞遞送研究，例如三角形［88-89］、矩形［87］、棒狀［90-91］、納米管［87］、納米籠［92-93］、四面體［94-95］、立方體［96-97］、八面體［92］、二十面體［98］等。DNA 納米結(jié)構(gòu)可以通過內(nèi)吞途徑或非內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)吞途徑主要包括吞噬作用、網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞、小窩蛋白依賴型內(nèi)吞和巨胞飲［79］。通過加入抑制劑阻斷通路的方法可以對結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞的途徑進(jìn)行探索［94］。然而，細(xì)胞攝取DNA納米結(jié)構(gòu)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

影響DNA 納米結(jié)構(gòu)細(xì)胞遞送的主要因素包括：細(xì)胞類型［99］、結(jié)構(gòu)形狀［100］、結(jié)構(gòu)大小［90］、結(jié)構(gòu)剛性［101］、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［102］和靶向分子修飾等［103］。因此，可以通過對結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計(jì)達(dá)到增加細(xì)胞攝取的目的。此外，還可以通過修飾病毒衣殼蛋白增加DNA 納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞遞送效率。Mikkil? 等［104］構(gòu)建了大小為72 nm×92 nm 的矩形DNA 折紙結(jié)構(gòu)，豇豆褪綠斑駁病毒（cowpea chlorotic mottle virus， CCMV） 的 衣 殼 蛋 白（capsid proteins，CP）可以通過靜電作用自組裝于結(jié)構(gòu)上，并將結(jié)構(gòu)包裹其中，形成DNA 折紙-CP復(fù)合體［圖7（b）］，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染人胚腎293（human embryonic kidney，HEK）細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)與裸露的折紙結(jié)構(gòu)相比，DNA 折紙-CP復(fù)合物的細(xì)胞遞送效率提高了13倍。

Perrault 等［105］模擬有包膜的球狀病毒結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了直徑約50 nm 的DNA 八面體結(jié)構(gòu)（DNAnano-octahedron，DNO），其中脂質(zhì)修飾的寡核苷酸可以與結(jié)構(gòu)上的48 個(gè)DNA 錨定序列雜交，并在結(jié)構(gòu)外部有序排列，隨后運(yùn)用透析法可以誘導(dǎo)生成磷脂膜包裹的DNA 納米結(jié)構(gòu)［圖7（c）］。與無包膜的DNO相比，有包膜的DNO展現(xiàn)出較低的免疫應(yīng)答和更慢的體內(nèi)降解速度。

圖7 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用（a）邏輯門控DNA納米機(jī)器人［81］；（b）病毒衣殼蛋白修飾DNA納米結(jié)構(gòu)［104］；（c）仿病毒磷脂膜包裹DNA納米結(jié)構(gòu)［105］Fig.7 Applications in biomedicines(a)Logic-gate controlled DNA nanorobot[81];(b)Viral capsid protein modified DNA nanostructure[104];(c)Virus-inspired membrane-coated DNA nanostructure[105]

DNA 納米結(jié)構(gòu)可以通過修飾核酸適配體或靶向性配體增加藥物的選擇性，減少脫靶效應(yīng)。Ma 等［106］將anti-HER2 核酸適配體加載到四面體DNA 納米結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)可以特異性靶向HER2陽性的SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞，通過誘導(dǎo)HER2介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)內(nèi)吞和溶酶體降解，從而降低細(xì)胞膜表面的HER2表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長。Ge等［93］利用靶向配體修飾棒狀DNA納米結(jié)構(gòu)，用于構(gòu)建抗體-藥物結(jié)合體（antibody-drug conjugate，ADC），配體2-［3-（1，3-二羧基丙基）-脲基］戊 二 酸（2-［3-（1，3-dicarboxy propyl）-ureido］pentanedioic acid，DUPA）可以與前列腺特異性膜抗原（prostate-specifc membrane antigen，PSMA）結(jié)合，將搭載DOX 的ADC 特異性地遞送到PSMA陽性的LNCaP人前列腺癌細(xì)胞系。

4.2 腫瘤治療

搭載抗腫瘤藥物（如Dox、siRNA 等）進(jìn)行細(xì)胞遞送是常用的腫瘤治療的解決方案，在前面藥物遞送一節(jié)已經(jīng)做過介紹。除此以外，國家納米科學(xué)中心丁寶全教授課題組利用DNA 納米機(jī)器進(jìn)行腫瘤血管栓塞和腫瘤疫苗開發(fā)，為腫瘤治療提供了新思路。2018 年，該課題組設(shè)計(jì)了一種DNA 納米機(jī)器人，可以在檢測到腫瘤標(biāo)志物的部位精確給藥［107］，在這種DNA納米管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部通過小分子交聯(lián)劑sulfo-SMCC 連接了一定數(shù)量的凝血酶，“鎖定序列”是靶向腫瘤標(biāo)志物的核酸適配體，可以特異性識別腫瘤血管標(biāo)志物核仁素（nucleolin）。在核酸適配體與腫瘤部位的核仁素結(jié)合后，結(jié)構(gòu)展開為矩形，凝血酶暴露于血液中，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)的血栓形成和腫瘤壞死。2021年，丁教授課題組又構(gòu)建了一種管狀DNA 納米結(jié)構(gòu)用以開發(fā)腫瘤疫苗［108］，其內(nèi)部裝配了相同比例的一種抗原（OVA多肽）和兩種toll-樣受體激動(dòng)劑（dsRNA 和CpG DNA），當(dāng)結(jié)構(gòu)進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）的溶酶體時(shí)，pH 的降低使“鎖定序列”構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)展開為矩形，暴露的抗原和佐劑會誘導(dǎo)APC 成熟，誘發(fā)強(qiáng)烈的腫瘤特異性T 細(xì)胞免疫，疫苗產(chǎn)生的長期T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以有效地保護(hù)小鼠免受腫瘤的再次侵襲。然而，關(guān)于DNA 納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用于藥物遞送和腫瘤治療方面的研究目前主要集中于細(xì)胞和動(dòng)物層面，離臨床應(yīng)用還有一段距離，主要有幾個(gè)方向需要尋求突破：①降低結(jié)構(gòu)成本，實(shí)現(xiàn)批量制備；②獲得人體產(chǎn)生效應(yīng)所需劑量；③獲得結(jié)構(gòu)人體代謝相關(guān)數(shù)據(jù)；④評估在人體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。

5 挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，DNA 納米結(jié)構(gòu)由于具有高度可設(shè)計(jì)性、精確可尋址性、生物親和性等特性，在納米級別的可控合成方面體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢，已經(jīng)成為合成生物學(xué)重要的支持技術(shù)。本文詳細(xì)介紹了如何利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行核酸、蛋白和磷脂的有序裝配，從而實(shí)現(xiàn)生物大分子在一維、二維或三維的DNA 框架上數(shù)量、位置可控的排列；如何利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建仿生細(xì)胞元件、生物過程和生化體系，包括模擬核孔、人工膜通道、網(wǎng)格蛋白等細(xì)胞配件，模擬膜融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞膜成管等生命現(xiàn)象，以及構(gòu)建RNA 合成、病毒蛋白合成、凝血系統(tǒng)等復(fù)雜仿生體系；如何利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物遞送和腫瘤治療，并探討了搭載藥物種類、影響遞送效率的因素、增加靶向性的方法，以及在腫瘤血管栓塞、腫瘤疫苗開發(fā)方面的應(yīng)用。過去10 年中，DNA 納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)不再滿足于從工程學(xué)的角度，追求結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的新穎性和完善性，而是爆發(fā)式地向生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的方向，提出內(nèi)在變革與不斷進(jìn)步的要求。在探索實(shí)現(xiàn)這些具體需求的過程中，研究者們不斷地進(jìn)行著向自然學(xué)習(xí)和作用于自然的反復(fù)迭代，逐步積累了越來越多的仿生構(gòu)建和功能化制備的知識與經(jīng)驗(yàn)，相關(guān)成果也為化學(xué)生物學(xué)、合成生物學(xué)、分子醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域注入了全新的血液，開啟了相當(dāng)積極的探索。同時(shí)，我們也清楚地看到，利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)一步合成、模擬、調(diào)控生物體系的過程中仍存在著較多改善的空間，例如：如何在已經(jīng)組裝完成的DNA 納米結(jié)構(gòu)上，一定程度地恢復(fù)和利用DNA 攜載遺傳信息能力；如何在提高結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)修飾復(fù)雜性的同時(shí)，保持人工體系的簡潔和生產(chǎn)的高效；如何在保證DNA 納米結(jié)構(gòu)合成效率的同時(shí)，擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)和降低材料成本；以及如何在細(xì)胞內(nèi)完成結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)組裝等。這些問題為DNA 納米技術(shù)的發(fā)展指出未來研究方向。此外，目前DNA 納米技術(shù)在腫瘤治療的研究大部分停留在細(xì)胞和動(dòng)物層面，在推進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化的道路上仍存在許多亟待解決的問題。例如：如何通過對DNA 納米結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)，增加載藥量；如何在體液環(huán)境中保持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；如何評估結(jié)構(gòu)的免疫原性及反復(fù)給藥造成的副作用；如何增加靶向性，使得結(jié)構(gòu)在腫瘤部位形成有效聚集；如何通過不同的免疫佐劑修飾，誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)行免疫治療。事實(shí)上，大量的研究正在為上述問題的解決尋求積極途徑，例如DNA 納米結(jié)構(gòu)的成本和規(guī)?；苽湟恢笔瞧洚a(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸，利用傳統(tǒng)的固相合成法，成本將近180 元/mg，難以進(jìn)行大規(guī)模合成。利用生物自身的合成體系構(gòu)建生物反應(yīng)器可能是解決這一問題的突破口。目前的研究已經(jīng)可以利用噬菌體和DNA 核酶完成結(jié)構(gòu)所需的長、短單鏈的生產(chǎn)和自組裝，可以將產(chǎn)量提升至克級甚至千克級，選擇活性更強(qiáng)的DNA 核酶則為效率提升指明了方向。而所有進(jìn)步都將為DNA納米技術(shù)更好地服務(wù)于合成生物學(xué)提供助益，隨著DNA 納米技術(shù)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、功能優(yōu)化、規(guī)模生產(chǎn)等方面的不斷成熟，將有助于打破臨床應(yīng)用壁壘，形成新型產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)。