復(fù)方透骨草酊對(duì)睪酮的抑制及促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用的初步研究

孔維嘉，陳佳祺，張文旭，商 鈺，薛雨辛，朱慶文

雄激素性脫發(fā)（androgenetic alopecia，AGA）是一種與遺傳因素及雄激素依賴(lài)相關(guān)的常見(jiàn)毛發(fā)疾病，屬于中醫(yī)學(xué) “發(fā)蛀脫發(fā)”“蛀發(fā)癬”等范疇。中國(guó)雄激素性禿發(fā)診療指南顯示，該疾病在我國(guó)男性的患病率約為21.3%，女性患病率約為6.0%[1]。AGA多見(jiàn)于青春期后男性，以進(jìn)行性毛發(fā)減少、毛囊的微小化為主要表現(xiàn)，伴皮脂溢出及輕微瘙癢。此疾病嚴(yán)重影響美觀，為早發(fā)性AGA患者帶來(lái)身心雙重負(fù)擔(dān)[2-4]。

目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）僅批準(zhǔn)米諾地爾和非那雄胺作為治療藥品，但使用米諾地爾會(huì)出現(xiàn)面部多毛癥等不良反應(yīng)，而非那雄胺則會(huì)導(dǎo)致性功能障礙等不良反應(yīng)[4,5]。研究表明[6,7]，中醫(yī)對(duì)本病有獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。復(fù)方透骨草酊由燕京皮膚科專(zhuān)家趙炳南教授經(jīng)驗(yàn)方透骨草方化裁而來(lái)，全方由透骨草（impatiens balsamina）、側(cè)柏葉（platycladi cacumen）、皂角（fructus gleditsia ）、白礬組成，具有祛濕解毒止癢的功效，文獻(xiàn)表明原方療效顯著[8,9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)AGA與睪酮及雙氫睪酮等雄激素含量密切相關(guān)[10]。因此本文用復(fù)方透骨草酊處理以睪酮誘導(dǎo)的 C57BL/6 病理脫發(fā)小鼠模型，通過(guò)測(cè)定小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)情況、毛囊細(xì)胞凋亡及血清睪酮、雙氫睪酮水平等，探究復(fù)方透骨草酊促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，并為其治療AGA提供初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6 小鼠，6周齡（體重 18～20 g），SPF級(jí)，40只[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。實(shí)驗(yàn)前，穩(wěn)定飼養(yǎng)1周；飼養(yǎng)環(huán)境：濕度 50%～70%，溫度 25 ℃～27 ℃（室溫），自然光照。

1.1.2 藥物與試劑 復(fù)方透骨草酊由透骨草40 g、側(cè)柏葉40 g、皂角15 g、白礬5 g組成（購(gòu)自北京康泰民生藥房）。上述藥材碾碎，加入200 ml 75%乙醇，浸泡7晝夜，后采用摻漉法到400 ml，過(guò)濾去渣，裝瓶備用。睪酮（北京伊諾凱科技有限公司），75%乙醇（杭州歐拓普生物技術(shù)有限公司），10%中性緩沖甲醛固定液（浙金械備20170017號(hào)），2%米諾地爾搽劑（國(guó)藥準(zhǔn)字H20052642），PH0429抗熒光淬滅封片劑，PH0615蛋白酶K溶液。小鼠睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）、小鼠雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司），原位雜交技術(shù)原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（生工生物工程股份有限公司）。

1.1.3 儀器及設(shè)備 伯樂(lè)iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad），BSA224S-CW 分 析 天 平（ 德 國(guó) Sartorius），5424R高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），KS 4000 i control 控溫?fù)u床（德國(guó)IKA），DMI6000 B倒置熒光顯微鏡、TP1020自動(dòng)組織脫水機(jī)、RM2235切片機(jī)、EG1160組織包埋機(jī)（德國(guó)Leica），CS-VI攤片烤片機(jī)、冷凍臺(tái)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），移液槍?zhuān)ǖ聡?guó) Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及涂藥方法 將40只雄性 C57BL /6小鼠，6周齡，正常喂養(yǎng)1周后，用Excel軟件隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、脫發(fā)模型組、米諾地爾酊組、復(fù)方透骨草酊組，每組10只小鼠。電動(dòng)剃須刀物理背部脫毛面積2 cm×3 cm，創(chuàng)傷刺激誘導(dǎo)小鼠毛囊從休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期。脫毛后小鼠皮膚呈粉紅色，無(wú)其他不良反應(yīng)。脫毛第2天按照對(duì)應(yīng)方法對(duì)各組小鼠背部脫毛區(qū)域用棉簽均勻給藥，每天1次。文獻(xiàn)[11]顯示，脫毛20 d以后小鼠毛囊從新進(jìn)入休止期，故本實(shí)驗(yàn)連續(xù)19 d給藥。參照文獻(xiàn)[12, 13]建立睪酮誘導(dǎo)的病理脫發(fā)模型，涂樣方法見(jiàn)表1。

1.2.2 觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況 每天觀察小鼠皮膚顏色變化，記錄小鼠背部實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚從開(kāi)始給藥到變黑、從開(kāi)始變黑到毛發(fā)長(zhǎng)出表皮的時(shí)間。以皮膚顏色從粉紅色（休止期）到開(kāi)始變黑（生長(zhǎng)期）作為毛發(fā)從休止期到生長(zhǎng)期的時(shí)間；皮膚開(kāi)始變黑（生長(zhǎng)期）到毛發(fā)長(zhǎng)出皮膚表面的時(shí)間作為毛發(fā)從進(jìn)入生長(zhǎng)期到長(zhǎng)出皮表的時(shí)間[14]。

1.2.3 血清中激素含量的測(cè)定 脫毛后第19 d，每組小鼠進(jìn)行眼球采血，1 500 r/min離心10 min后分離血清，用ELISA試劑盒測(cè)定每組小鼠血清中T、DHT以及E2含量，記錄并求其平均值。

1.2.4 TUNEL毛囊細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)[15]脫毛后第19 d取血后，將每組小鼠頸椎脫臼法處死，在脫毛部位平行于脊椎處取材，剪去新長(zhǎng)出的毛發(fā)，后將皮膚修剪成1 cm寬的長(zhǎng)條狀。置于10%甲醛中浸泡2 d后，用自來(lái)水沖去甲醛，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，修塊，切片，使切片方向與毛發(fā)生長(zhǎng)方向一致，切片厚度為4.5 μm。用TUNEL檢測(cè)毛囊內(nèi)細(xì)胞的凋亡狀況，嚴(yán)格按照紅色熒光TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體方法：①二甲苯脫蠟5～10 min 2次；②滴加 20 μg/ml 蛋白酶 K，無(wú)水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，蒸餾水分別處理2 min；③PBS 洗滌玻片去除蛋白酶K；④根據(jù)檢測(cè)樣品數(shù)目和表2配制反應(yīng)混合液；⑤滴加反應(yīng)混合液50 μl，37℃避光孵育 60 min；⑥吸去反應(yīng)混合物，PBS 洗板3～5次；⑦用1×Hoechst 33342染色細(xì)胞核；⑧用抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察并拍照。利用Image Por-plus6.0 圖像分析軟件，計(jì)數(shù)紅色熒光細(xì)胞和區(qū)域內(nèi)總細(xì)胞核數(shù)量，計(jì)算紅色熒光細(xì)胞所占百分比，即凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

表2 TUNEL毛囊細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS26.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用SNK 法進(jìn)行兩組間檢驗(yàn)。如果數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布的，則使用非參數(shù)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)C57BL/6 小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響

涂藥5～7 d后，米諾地爾酊組和復(fù)方透骨草酊組小鼠皮膚開(kāi)始變黑，6～8 d后空白對(duì)照組開(kāi)始變黑，脫發(fā)模型組開(kāi)始變黑時(shí)間為7～10 d。米諾地爾酊組和復(fù)方透骨草酊組小鼠毛囊從生長(zhǎng)期到毛發(fā)長(zhǎng)出皮表時(shí)間為2～4 d，空白對(duì)照組及脫發(fā)模型組為3～5 d。脫發(fā)模型組較空白對(duì)照組小鼠毛囊從休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期、從生長(zhǎng)期到長(zhǎng)出表皮時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，涂抹睪酮對(duì)C57BL/6 小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)具有抑制作用；復(fù)方透骨草酊組及米諾地爾酊組小鼠毛囊從休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期、從生長(zhǎng)期到長(zhǎng)出表皮時(shí)間較空白對(duì)照組明顯縮短（P＜0.05），較脫發(fā)模型組時(shí)間顯著縮短（P＜0.01），提示可從一定程度上緩解睪酮對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的抑制作用。各組藥物對(duì)C57BL/6 小鼠背部毛發(fā)生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表3。涂藥第19 d后，脫發(fā)模型組毛發(fā)再生呈抑制狀態(tài)，復(fù)方透骨草酊組及米諾地爾酊組小鼠恢復(fù)毛發(fā)再生能力（圖1）。

表3 藥物對(duì)AGA小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響（±s，n = 10）

表3 藥物對(duì)AGA小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組 別 從休止期到生長(zhǎng)期時(shí)間（d）從生長(zhǎng)期到長(zhǎng)出皮表時(shí)間（d）空白對(duì)照組 7.10±0.88 3.70±0.68脫發(fā)模型組 8.30±0.95## 4.50±0.71#米諾地爾酊組 6.20±0.63#** 2.90±0.74#**復(fù)方透骨草酊組 6.10±0.74##** 2.80±0.92#**

圖1 各組小鼠第19 d背部毛發(fā)生長(zhǎng)情況

2.1 對(duì)C57BL/6 小鼠血清中激素水平的影響

與空白對(duì)照組相比，脫發(fā)模型組小鼠血清中T含量顯著升高（P＜0.01），DHT含量明顯升高（P＜0.05），E2含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與脫發(fā)模型組相比復(fù)方透骨草酊組的T、DHT含量顯著降低（P＜0.01），E2含量沒(méi)有顯著性差異；米諾地爾酊組T含量顯著降低（P＜0.01），DHT含量明顯降低（P＜0.05），E2無(wú)顯著差異（表4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，涂抹睪酮可誘導(dǎo)小鼠血清中T、DHT含量升高，復(fù)方透骨草酊與米諾地爾酊可逆轉(zhuǎn)睪酮引起的小鼠高雄激素水平，對(duì)雌二醇無(wú)明顯作用。

表4 藥物對(duì) C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影響（±s，n = 10）

表4 藥物對(duì) C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 血清睪酮（T）（nmol/L）血清雙氫睪酮（DHT）（nmol/L）血清雌二醇（E2）（pmol/L）空白對(duì)照組 288.97±39.38 38.25±5.78 200.54±33.50脫發(fā)模型組 355.97±47.72## 48.37±8.09# 216.46±33.60米諾地爾酊組 272.26±52.79** 42.61±8.33* 207.39±36.75復(fù)方透骨草酊組 249.84±43.53** 37.94±5.73** 206.77±29.32

1.3 對(duì)C57BL/6 小鼠毛囊細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，圖2中紅色熒光代表凋亡細(xì)胞，同時(shí)對(duì)組織切片進(jìn)行Hoechst細(xì)胞核染色，藍(lán)色熒光代表小鼠毛囊細(xì)胞核。脫毛后第19天，與不加反應(yīng)混合液的陰性組相比，4組切片中均顯示熒光染色，表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。與空白對(duì)照組比較，脫發(fā)模型組紅色熒光明顯增強(qiáng)，且區(qū)域變大，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.01），表明造模成功；復(fù)方透骨草酊組及米諾地爾酊組圖像和凋亡指數(shù)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與脫發(fā)模型組相比，復(fù)方透骨草酊組及米諾地爾酊組中紅色熒光均顯著減弱，區(qū)域減小，呈星點(diǎn)分散分布，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01），提示復(fù)方透骨草酊及米諾地爾酊對(duì)C57BL/6小鼠毛囊細(xì)胞凋亡均有相似的明顯抑制作用（圖2，表5）。

圖2 藥物對(duì)C57BL/6 小鼠毛囊細(xì)胞凋亡的影響（×200）

表5 藥物對(duì)C57BL/6 小鼠毛囊細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n = 10）

表5 藥物對(duì)C57BL/6 小鼠毛囊細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組 別 凋亡指數(shù)（AI%）空白對(duì)照組 29.54±2.86脫發(fā)模型組組 51.44±2.16##米諾地爾酊組 16.09±1.60**復(fù)方透骨草酊組 17.34±2.20**

3 討論

正常毛發(fā)的生長(zhǎng)周期包括生長(zhǎng)期、退行期和休止期。T是引起脫發(fā)的一種重要雄性激素，在脫發(fā)區(qū)毛囊內(nèi)可被Ⅱ型5α-還原酶還原成活性更強(qiáng)的DHT，兩者與雄激素受體蛋白結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核使ATP生成受阻，影響細(xì)胞能量代謝，毛母細(xì)胞角質(zhì)化成為休止期毛發(fā)[10]。破壞毛發(fā)正常生長(zhǎng)周期，處于退行期及休止期毛囊的比例上升，從而誘發(fā)AGA[16]。

復(fù)方透骨草酊由燕京皮膚科專(zhuān)家趙炳南教授經(jīng)驗(yàn)方透骨草方化裁而來(lái)，原方由透骨草四兩、側(cè)柏葉四兩、皂角二兩、白礬三錢(qián)組成，具有祛濕止癢，解毒消腫的功效。文獻(xiàn)顯示，原方對(duì)AGA等脫發(fā)疾病療效顯著，方中透骨草為君藥，散風(fēng)濕、活血止痛，民間有單味透骨草煎湯外洗治療脫發(fā)的經(jīng)驗(yàn)[17]；同時(shí)鳳仙透骨草地上部分化合物具有抗菌、止癢及5α-還原酶抑制作用[18]；側(cè)柏葉為臣藥，助君藥涼血祛濕，對(duì)球菌、桿菌等有抑制作用[19]。研究表明總黃酮成分能夠促進(jìn)血液循環(huán)，同時(shí)激活毛母細(xì)胞，從而發(fā)揮養(yǎng)發(fā)生發(fā)的作用[20]。鐘玲玲等[21]的復(fù)方側(cè)柏葉溶液治療AGA臨床試驗(yàn)，總有效率為90.00%；佐藥皂角、白礬，解毒殺蟲(chóng)止癢，對(duì)真菌、細(xì)菌有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在“趙氏皮科酊劑制劑經(jīng)驗(yàn)”的基礎(chǔ)上將水煎劑改為酊劑，能夠增強(qiáng)清熱止癢、解毒殺蟲(chóng)、活血散瘀的作用，改進(jìn)后的復(fù)方透骨草酊更貼合臨床實(shí)際。

C57BL/6 小鼠是國(guó)內(nèi)外目前廣泛應(yīng)用的毛發(fā)周期動(dòng)物模型[10,22]。6～8周飼養(yǎng)良好狀態(tài)下所有毛囊均處于休止期，物理拔毛后同步進(jìn)入生長(zhǎng)期，可通過(guò)觀察皮膚顏色變化來(lái)判斷毛發(fā)周期。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)每天在小鼠背部涂抹0.1%T溶液建立病理脫發(fā)模型[13]，選用復(fù)方透骨草酊作為實(shí)驗(yàn)組，選用FDA批準(zhǔn)治療AGA的惟一外用藥米諾地爾作為西藥對(duì)照。研究結(jié)果顯示，T通過(guò)延長(zhǎng)C57BL/6小鼠毛囊從休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期、從生長(zhǎng)期到長(zhǎng)出表皮時(shí)間，從而抑制毛發(fā)生長(zhǎng)，而復(fù)方透骨草酊及米諾地爾酊可通過(guò)縮短時(shí)間從而促進(jìn)小鼠毛發(fā)的生長(zhǎng)。除此之外，筆者比較了小鼠血清中雄激素的含量，復(fù)方透骨草酊與米諾地爾酊可降低睪酮刺激引起的T及DHT含量增加，表明復(fù)方透骨草酊可能通過(guò)降低雄激素水平從而治療AGA。盡管有文獻(xiàn)顯示E2會(huì)通過(guò)改變雄激素代謝影響毛囊生長(zhǎng)[23]，然而本實(shí)驗(yàn)并未觀察到各組之間E2含量存在明顯差異，雌激素對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的影響需要進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是近年來(lái)研究毛發(fā)生長(zhǎng)及周期的熱點(diǎn)，毛囊從生長(zhǎng)期到休止期是以部分細(xì)胞凋亡為特征的程序性器官退化的過(guò)程。有研究表明，雄激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)增加，抑制毛囊細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡[24]。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)，經(jīng)Hoechst染色后的正常細(xì)胞核呈靛藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞核則呈致密濃染[25-27]，同時(shí)顯紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方透骨草酊組與米諾地爾酊組紅色熒光減弱、區(qū)域減少，且呈藍(lán)色致密濃染的細(xì)胞核也減少，凋亡率比脫發(fā)模型組顯著降低，驗(yàn)證復(fù)方透骨草酊及米諾地爾酊通過(guò)抑制C57BL/6小鼠毛囊細(xì)胞凋亡，從而減少進(jìn)入退行期及休止期毛囊的比例，延長(zhǎng)毛囊生長(zhǎng)期，具有防脫發(fā)作用。

綜上所述，復(fù)方透骨草酊能夠促進(jìn)C57BL/6病理脫發(fā)小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與降低血清中T及DHT水平，抑制毛囊細(xì)胞凋亡相關(guān)。中醫(yī)藥外用治療皮膚疾病具有整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，關(guān)于復(fù)方透骨草酊對(duì)AGA患者自覺(jué)癥狀改善情況（如瘙癢、油膩感等）及用藥安全值得今后進(jìn)一步研究。