苗藥鳳仙花的提取工藝優(yōu)選及質(zhì)量標準的研究*

陳桃香，吳海燕，李春寧，胡成剛

(貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

鳳仙花來源于鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花ImpatiensbalsaminaL.全株，又稱指甲花，其種子稱急性子，被收載于2020版中國藥典。鳳仙花是苗族常用的一味藥材，在苗醫(yī)理論中，其味麻辣，性熱，入冷經(jīng)，快經(jīng)，半邊經(jīng)，有小毒。它具有活血化瘀、止痛解毒、祛風除濕接骨等功效。用于治療喉蛾，痞塊不消，骨鯁，噎食不下。莖常用于治療骨折，骨質(zhì)增生；花常用于治療甲癬[1]。鳳仙花資源豐富，全國有270余種，主要分布在我國西南地區(qū)[2～4]。本實驗對鳳仙花提取工藝進行了優(yōu)化并建立了其質(zhì)量標準，以期開發(fā)和利用鳳仙花植物資源，為臨床合理應用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-2030C液相色譜儀(自動進樣系統(tǒng)、在線排氣、紫外檢測器)；MODEL BX43F 光學顯微鏡(配成像系統(tǒng))；電子天平(型號：FA1004N，廠家：上海菁海儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(型號：GZX-9070MBE，廠家：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；恒溫水浴鍋(型號：HWS-24型，廠家：上海一恒科學儀器有限公司)；真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；人工智能氣候箱(型號：RQX-400B，廠家：常山市華普達教學儀器公司)；硅膠G薄層板。

1.2 材料

鳳仙花藥材均采自貴州省，共10個批次(詳細信息見表1)，由貴州中醫(yī)藥大學藥學院標本館胡成剛教授鑒定為鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花ImpatiensbalsaminaL.全株。2-甲氧基-1，4-萘醌對照品(批號：S20F719925，廠家：上海源葉生物科技有限公司，含量≧98%)，正己烷、乙酸乙酯、甲酸、苯、甲醇、庚烷、三氯甲烷、磷鉬酸均為分析醇。

表1 藥材樣品信息表Tab.1 Information of the medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

鳳仙花的全株分根、莖、葉子、花、果實和種子六個部分。葉互生，最下部葉有時對生；葉片披針形、狹橢圓形或倒披針形?；▎紊?～3朵簇生于葉腋，無總花梗，白色、粉紅色或紫色，單瓣或重瓣。蒴果寬紡錘形，長10～20 mm，兩端尖，密被柔毛；種子多數(shù)，圓球形，直徑1.5～3 mm，黑褐色。

2.2 顯微鑒別

粉末呈黃綠色，可見少量單細胞和多細胞的非腺毛，有較多的草酸鈣針晶及晶鞘纖維，多見草酸鈣方晶及簇晶，各種導管及纖維束多見，有少量橢圓形花粉粒，表面可見網(wǎng)狀雕紋，葉碎片少許，表面可見平軸式氣孔。結(jié)果見圖1。

圖1 鳳仙花藥材粉末顯微鑒定圖Fig.1 Microscopic identification of Impatiens balsamina powder

2.3 薄層鑒別

2.3.1 供試品、對照品溶液的制備

精密稱取鳳仙花藥材粉末5 g，加入95%的乙醇50 mL回流提取兩次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，即得供試樣品提取液[5]。精密稱取2-甲氧基-1，4-萘醌對照品5 mg，加入甲醇制成10 mL，使其充分溶解，即得0.5 mg/mL的對照品溶液。

2.3.2 方法

按照2015版中國藥典四部通則薄層色譜法(通則0502)[6]，分別吸取2-甲氧基-1，4-萘醌對照品溶液和鳳仙花的供試品溶液適量，點于已經(jīng)活化及飽和后的硅膠G薄層板上，以苯-甲醇(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干后，以磷鉬酸為顯色劑進行檢視，結(jié)果見圖2。在硅膠板上，槲皮素對照品溶液與不同產(chǎn)地的馬桑樣品在相應位置顯示清晰顏色相同的熒光斑點，分離效果及重復性良好，具體見圖2。

圖2 鳳仙花薄層鑒別圖Fig.2 Thin-layer identification of Impatiens balsamina

2.4 檢查與浸出物的測定

按照2015版中國藥典中各通則項下的實驗要求，通則0832水分測定法(烘干法)、2302灰分測定法(總灰分和酸不溶性灰分測定法以稀鹽酸測定酸不溶性灰分)、2201浸出物測定法(熱浸法測定醇溶性浸出物，以40%乙醇為溶劑)測定[6]，結(jié)果見表2。

表2 樣品水分、總灰分酸不溶性灰分和浸出物含量測定結(jié)果(%，n=3)Tab.2 Determination results of contents of water，total ash，acid-insoluble ash and extract(%，n=3)

2.5 提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，選取提取溶劑的濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)作為考察因素，以提取出的鳳仙花2-甲氧基-1，4-萘醌含量為評價指標，利用L9(34)正交試驗設計，優(yōu)選最佳工藝。正交試驗與水平因素見表3，正交試驗見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 因素水平表Tab.3 Factor-level table

表4 正交試驗表Tab.4 Orthogonal testresults

表5 方差分析表Tab.5 Analysis of Variance

試驗結(jié)果表明，影響鳳仙花提取工藝的因素大小順序為提取溶劑濃度(A)>料液比(B)>提取時間(C)。得到鳳仙花最佳提取工藝為A3B3C2，具體操作為：精密稱取鳳仙花藥材粉末1 g，用純甲醇100 mL，每次提取時間為1 h。

2.6 2-甲氧基-1，4-萘醌的含量測定研究

2.6.1 色譜條件

COSMOSIL Cholester C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動相：A相為純水，B相為乙腈；梯度洗脫：0～5 min，10%～35%(B)，5～15 min，35%～35%(B)，15～20 min，35%～65%(B)，20～21 min，65%～10%(B)，21～30 min，10%～10%(A)檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。色譜圖見圖3。

圖3 2-甲氧基-1，4-萘醌色譜圖Fig.3 Chromatogram of 2-methoxy-1，4-naphthoquinone

2.6.2 供試品溶液的制備

精密稱取鳳仙花藥材粉末1 g，加入100 mL的甲醇溶液，稱定重量，在90 ℃下回流提取1 h，放冷至室溫，稱定重量[7]，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用干燥的濾紙過濾后，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后即得供試品溶液[8]。

2.6.3 線性關系考察[9]

精密稱取2-甲氧基-1，4-萘醌對照品適量，加甲醇配成0.06 mg/mL溶液，稀釋成5個質(zhì)量濃度(0.003 mg/mL、0.018 mg/mL、0.03 mg/mL、0.042 mg/mL、0.054 mg/mL)，各吸取10 μL，平行3份，按“2.6.1”項色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標(Y)，2-甲氧基-1，4-萘醌質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得到回歸方程為Y=6×107X-16256(r=0.9997)，在3.4～54.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6.4 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.6.1”項下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，得到2-甲氧基-1，4-萘醌峰面積RSD為0.22%，儀器精密度良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液，按“2.6.1”項下的色譜條件，根據(jù)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h分別進樣10 μL，測得2-甲氧基-1，4-萘醌峰面積RSD為1.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 重復性試驗

取同一批號藥材粉末6份，按“2.6.2”項下制備供試品溶液，根據(jù)“2.6.1”項下色譜條件，注入色譜儀中測定，得到2-甲氧基-1，4-萘醌含量的RSD為0.53%，表明該方法重復性良好。

2.6.7 加樣回收試驗

精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末0.5 g，共6份，每份精密加入對照品0.3 mg，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL測定，計算回收率，結(jié)果見表6。

表6 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.6 Spiked recovery rate(n=6)

2.6.8 樣品含量測定

精密稱取各產(chǎn)地鳳仙花粉末1 g，平行3份，按“2.6.2”項下制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，實驗結(jié)果見表7。

表7 鳳仙花的含量測定結(jié)果(n=3)Tab.7 Determination results of Impatiens balsamina(n=3)

3 結(jié)論與討論

本次研究分別從定性鑒別、定量測定兩部分對鳳仙花進行了研究，鳳仙花藥材粉末中特征明顯，可作為鑒定鳳仙花藥材真?zhèn)蔚蔫b定依據(jù)。結(jié)合參考文獻及藥典其他藥材檢查，暫定鳳仙花各檢查指標含有量為水分不超過17.0%，總灰分不超過22.0%，酸不溶性灰分不超過0.33%，醇溶性浸出物不低于17.0%。

鳳仙花主要含黃酮醇類及萘醌類衍生物，其中2-甲氧基-1，4-萘醌為鳳仙花所含成分中最主要的抗真菌化學成分[10]，而且鳳仙花的根中還含有指甲醌、東莨菪素等，具有抗真菌、抗過敏、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[10-12]。鳳仙花是苗族民間用于治療爛癬、頑癬、手足氣等疾病的常用藥，基于開發(fā)治療皮膚癬類疾病苗藥新制劑，故選用2-甲氧基-1，4-萘醌作為質(zhì)量控制的指標。

本實驗，考察了提取溶劑濃度、提取時間、料液比等3個單因素，在單因素考察的基礎上，運用正交試驗設計方法優(yōu)選出鳳仙花2-甲氧基-1，4-萘醌成分提取的最佳提取方法為甲醇、料液比為1∶100，提取時間為1 h。考察了不同的流動相(甲醇-水、乙腈-水)，發(fā)現(xiàn)后者分離效果優(yōu)于前者，故采用乙腈-水進行梯度洗脫。紫外掃描顯示，最大吸收波長位于280 nm，故將其作為檢測波長。