箭葉淫羊藿藥材等級(jí)質(zhì)量研究*

覃春葉，何佳佳，陳子愉，陳志琳，李 瑋，杜洪志

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.是小檗科淫羊藿屬植物，藥用部位為葉，其味辛甘，性溫，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的作用[1]。主要含有黃酮及其苷類、生物堿、多糖、木脂素等成分，具有抗骨質(zhì)疏松、延緩衰老、抗腫瘤[2-8]等藥理作用，臨床上多用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征等疾病[9-10]。市場(chǎng)上，箭葉淫羊藿藥材使用廣，是很多中成藥的主要原料之一，如仙靈骨葆膠囊、益腎靈顆粒、抗骨增生片等。中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響到中成藥的質(zhì)量，藥材不同采收期、不同部位、不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格等級(jí)都與中藥材的質(zhì)量息息相關(guān)[11-12]。目前，《中藥材商品規(guī)格等級(jí)(226)種》中按照傳統(tǒng)分級(jí)方法，即葉片占比和碎葉占比和色澤將箭葉淫羊藿分為一等、二等和統(tǒng)貨，沒有結(jié)合現(xiàn)代質(zhì)量控制指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)該藥材商品規(guī)格等級(jí)質(zhì)量，已不符合當(dāng)前中藥材的生產(chǎn)、流通、使用，制約了箭葉淫羊藿藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，制定科學(xué)、全面的箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級(jí)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)于保證臨床療效、合理利用藥材、優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)都具有重要意義。

研究表明，淫羊藿的不同藥用部位中，淫羊藿苷以及總黃酮類成分的含量有所差異，含量最高的部位在葉片，葉柄和莖含量較低[13]；同時(shí)，葉類藥材的等級(jí)劃分較為簡(jiǎn)單，主要按照藥材的外觀性狀、顏色、含雜質(zhì)率等劃分[14]?；诖?，筆者將箭葉淫羊藿藥材外觀性狀與內(nèi)在品質(zhì)相結(jié)合，建立該藥材等級(jí)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，以期為箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1810型紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、ME204E型萬(wàn)分之一電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展公司)、HS10260D型超聲波清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥

淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)：110737-200414，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥99%)、甲醇和乙醇均為分析純、實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

16批箭葉淫羊藿藥材均由國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司提供。由貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定，為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.的全草。具體信息見表1。

表1 箭葉淫羊藿藥材產(chǎn)地及批號(hào)Tab.1 Origins and batch numbers of Epimedium sagittatum medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 分級(jí)要點(diǎn)

根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》對(duì)箭葉淫羊藿的質(zhì)量要求，結(jié)合葉片顏色、葉片所占比例(重量比)、其他非藥用雜質(zhì)、含量測(cè)定指標(biāo)總黃酮進(jìn)行等級(jí)劃分。

一等：全部為三出復(fù)葉(小葉)，葉片綠色，完整，無(wú)蟲蛀，不含葉柄(葉枝)，葉片所占比例為100%，無(wú)雜質(zhì)。

二等：有一部分為三出復(fù)葉(小葉)，葉片綠色，完整，無(wú)蟲蛀，含葉柄(葉枝)，含較短的葉枝，無(wú)雜質(zhì)。

三等：有一部分為三出復(fù)葉(小葉)，葉片綠色，完整，無(wú)蟲蛀，含葉柄(葉枝)比例較二等品多，含較長(zhǎng)葉枝和較短葉枝，無(wú)雜質(zhì)。

統(tǒng)貨：原藥材。

2.2 分級(jí)方法

每一個(gè)批次根據(jù)葉片顏色，有無(wú)雜質(zhì)，蟲蛀，是否完整，劃分為3個(gè)等級(jí)和統(tǒng)貨，并計(jì)算各批次各等級(jí)葉片占比和葉柄占比。

2.3 藥材顏色測(cè)定

采用主觀結(jié)合客觀方法綜合評(píng)價(jià)藥材顏色。主觀方法即感官觀察藥材未打粉之前葉片的顏色；客觀方法即是用色度測(cè)量?jī)x測(cè)定箭葉淫羊藿藥材打粉之后樣品粉末的顏色，以L、a、b表示色度值，其中L為亮度值，值越大表示亮度越高；a為色度值，“+”表示紅色，值越大顏色越紅，“-”表示綠色，值越小顏色越綠；“b”為彩度值，“+”表示黃色，值越大顏色越黃，“-”表示藍(lán)色，值越小顏色越藍(lán)。

2.4 水分測(cè)定

照2020版《中國(guó)藥典》第四部通則0832項(xiàng)下“水分測(cè)定法”烘干法測(cè)定藥材水分含量。

2.5 浸出物測(cè)定

照2020版《中國(guó)藥典》第四部通則2201項(xiàng)下“浸出物測(cè)定法”，分別以水和50%乙醇為溶劑，按熱浸法測(cè)定藥材水溶性和醇溶性浸出物含量。

2.6 總黃酮測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取2.5 mg的淫羊藿苷對(duì)照品置于25 mL的容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。取1 mL該溶液置于10 mL容量量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL含0.01 mg的溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 供試品溶液的制備

取供試品粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理1 h，取出，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液0.35 mL加甲醇定容到25 mL即得供試品溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取不同體積的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，配置成濃度分別為0.006 mg/mL、0.01 mg/mL、0.014 mg/mL、0.016 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL一系列對(duì)照品溶液。在270 nm處測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，求得回歸方程Y=31.801X+0.0118(r=0.9998)，淫羊藿苷濃度在0.006～0.03 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.4 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.01 mg/mL淫羊藿苷對(duì)照品溶液，在270 nm處下連續(xù)測(cè)定6次，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算其RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取箭葉淫羊藿藥材樣品6份，每份約0.2 g，精密稱定，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在270 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量的RSD為2.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份箭葉淫羊藿藥材樣品，約0.2 g，精密稱定，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在270 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，每隔1 h測(cè)定吸光度，連測(cè)6次，吸光度RSD為0.60%，說(shuō)明該藥材溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一已知含量的箭葉淫羊藿藥材粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，加入約等量的淫羊藿苷對(duì)照品溶液(1 mg/mL淫羊藿苷)，按2.6.2項(xiàng)下方法制備溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，其6份供試品的回收率范圍為94.29%～98.10%，平均回收率為96.51%，RSD值為1.6%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.8 樣品含量測(cè)定

取箭葉淫羊藿藥材樣品，分別按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在270 nm處測(cè)定其吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算干燥品藥材中總黃酮的含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

16批箭葉淫羊藿藥材葉片占比、葉柄占比、顏色、水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表2，采用SPSS23.0軟件進(jìn)行主成分分析，系統(tǒng)聚類分析和K-均值聚類分析。

表2 箭葉淫羊藿相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Measurement results of related indexes of Epimedium sagittatum(n=3)

續(xù)表2

2.7.1 主成分分析

采用SPSS23.0軟件對(duì)16批箭葉淫羊藿藥材各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，根據(jù)不同主成分的貢獻(xiàn)率及線性組合的相關(guān)系數(shù)，通過指標(biāo)權(quán)重歸一化，得到各項(xiàng)指標(biāo)綜合得分系數(shù)與指標(biāo)權(quán)重，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，葉片占比、醇溶性浸出物含量和總黃酮含量的指標(biāo)權(quán)重占比較大，為主要的影響因素。

表3 指標(biāo)權(quán)重分析結(jié)果Tab.3 Results of index weight analysis

2.7.2 系統(tǒng)聚類分析

根據(jù)主成分分析的結(jié)果，以葉片占比、醇溶性浸出物含量和總黃酮含量為指標(biāo)，采用SPSS23.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖可知，各批次的一等、二等和三等之間基本可以有效、有規(guī)律的聚為一類，說(shuō)明各批次的相同等級(jí)之間相似性比較大。

圖1 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Fig.1 System cluster analysis results

2.7.3 K-均值聚類分析

根據(jù)主成分分析和系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果，以葉片占比、葉柄占比、顏色、水溶性浸出物、醇溶性浸出物和總黃酮含量進(jìn)行K-均值聚類分析，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，除統(tǒng)貨外將箭葉淫羊藿藥材分成三類，第一類箭葉淫羊藿各方面的指標(biāo)優(yōu)于第二類箭葉淫羊藿，第二類優(yōu)于第三類。

表4 K-均值聚類最終聚類中心Tab.4 Final cluster centers of K-means clustering

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

根據(jù)箭葉淫羊藿樣品K-均值聚類分析結(jié)果，以葉片、葉柄占比，顏色，總黃酮含量為重要指標(biāo)，水分、浸出物含量為對(duì)應(yīng)指標(biāo)，將箭葉淫羊藿藥材分為一等、二等、三等和統(tǒng)貨。結(jié)果見表5。

表5 箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級(jí)劃分結(jié)果Tab.5 Grading results of Epimedium sagittatum medicinal materials

3.2 討論

《中藥材商品規(guī)格等級(jí)(226)種》中按照傳統(tǒng)分級(jí)方法，即葉片占比、碎葉占比和色澤將箭葉淫羊藿分為一等、二等和統(tǒng)貨，本文在此基礎(chǔ)上，與現(xiàn)代質(zhì)量控制指標(biāo)相結(jié)合，測(cè)定水分、浸出物、總黃酮含量，旨在探究外在指標(biāo)與內(nèi)在指標(biāo)的相關(guān)性以及按照傳統(tǒng)的分級(jí)方法進(jìn)行該藥材等級(jí)劃分是否合理。由SPSS23.0數(shù)據(jù)分析，可知外在指標(biāo)和內(nèi)在指標(biāo)有相關(guān)性，并且呈正相關(guān)，說(shuō)明傳統(tǒng)分級(jí)方法具有合理性。通過外在指標(biāo)和內(nèi)在指標(biāo)相結(jié)合制定箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級(jí)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，既是對(duì)原有商品規(guī)格的傳承，也是一種現(xiàn)代補(bǔ)充，滿足了市場(chǎng)的變化和需求，可以有效控制箭葉淫羊藿藥材的質(zhì)量，制定的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法更加科學(xué)、全面。

目前，基于性狀-成分-藥效模式評(píng)價(jià)中藥材的商品規(guī)格等級(jí)已是很多研究者認(rèn)可的方法，陳虹宇對(duì)羌活不同商品規(guī)格抗炎、鎮(zhèn)痛藥效進(jìn)行對(duì)比，研究結(jié)果表明，不同商品規(guī)格的羌活藥材抗炎、鎮(zhèn)痛效果有差異，蠶羌和疙瘩羌的抗炎鎮(zhèn)痛效果比竹節(jié)羌、尾羌的效果好[15]；曹旭林按照傳統(tǒng)分級(jí)方法，以天冬藥材外觀性狀指標(biāo)顏色、斷面等將天冬藥材分為一等、二等和三等，研究不同等級(jí)天冬藥材止咳、祛痰作用強(qiáng)弱，發(fā)現(xiàn)一等品較三等品止咳祛痰作用顯著[16]。然而，箭葉淫羊藿藥材不同等級(jí)之間是否存在藥效學(xué)差異，還有待進(jìn)一步研究。