• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大豆莢皮厚性狀QTL定位及候選基因挖掘

    2022-05-13 08:24:22王喬蔣洪蔚謝建國(guó)潘文婧鄭海洋侯立龍熊心武小霞
    關(guān)鍵詞:皮厚豆莢表型

    王喬,蔣洪蔚,謝建國(guó),潘文婧,鄭海洋,侯立龍,熊心,武小霞*

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍 江哈爾濱, 150030;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林省長(zhǎng)春市郵編 130033)

    大豆莢皮,是影響大豆產(chǎn)量的重要性狀。作為大豆生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品,大豆莢皮和大豆籽粒的比例達(dá)高達(dá)1∶2[1]。大豆莢皮中富含大量的蛋白質(zhì)和纖維素,具有較高的飼用價(jià)值[2]。Sruamsiri 等利用大豆莢皮替代部分稻草飼喂奶牛,結(jié)果表明奶牛的采食量和4%標(biāo)準(zhǔn)乳產(chǎn)量均有升高[3]。但大豆莢皮的利用率較低,大多數(shù)作為農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行焚燒,對(duì)環(huán)境造成極大破壞[4~6],也不利于資源的可持續(xù)發(fā)展。大豆莢皮厚與大豆單株產(chǎn)量呈負(fù)向相關(guān)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在莢部的分配主要集中于莢皮與子粒,莢皮過厚不利于子粒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累,降低了可食用率[7]。故大豆莢皮厚的研究對(duì)大豆增產(chǎn)、資源再利用等都具有重要意義。

    現(xiàn)如今,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和新型標(biāo)記的開發(fā),有關(guān)QTL 的研究已經(jīng)趨于成熟。其中有關(guān)QTL的算法,有復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)和完備區(qū)間作圖法(ICIM),這兩種方法都可以精確定位QTL。李永亮等[8]利用CIM 和ICIM 兩種方法結(jié)合,對(duì)來自CSSLs 群體的62 個(gè)單株和RIL 群體的147 個(gè)單株進(jìn)行大豆冠層性狀QTL定位分析,最終檢測(cè)到31個(gè)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)。姚丹等[9]以ICIM 法對(duì)吉農(nóng)18 和吉育47 雜交后代F2及次級(jí)分離群體進(jìn)行大豆油分相關(guān)QTL 定位,共檢測(cè)到分布于4 條染色體的7 個(gè)與高油含量相關(guān)的QTL 位點(diǎn)。ICIM 法簡(jiǎn)化了CIM 法中由背景遺傳調(diào)控的變異,精細(xì)了對(duì)QTL 的檢測(cè)效率[10]。大豆莢皮厚受環(huán)境因素和遺傳背景的共同調(diào)控,因此也是由多基因控制的數(shù)量性狀。我們利用完備區(qū)間作圖法(ICIM)對(duì)其進(jìn)行QTL定位。

    集群分離分析法(BSA)利用遺傳群體構(gòu)建高低混池進(jìn)行高通量測(cè)序,找到與目標(biāo)性狀相關(guān)標(biāo)記,從而實(shí)現(xiàn)QTL 精細(xì)定位。這是一種對(duì)遺傳群體的后代篩選極端表型,以構(gòu)建DNA 混池,快速檢測(cè)與目的性狀相關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的方法[11]。BSA 最早由Michelmore[12]于1991 年提出,主要用于鑒定基因組某個(gè)區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記。現(xiàn)在,BSA 混池測(cè)序通過開發(fā)分子標(biāo)記,廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、農(nóng)藝基因組學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種[13]。隨著全基因組高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,利用BSA 分析與全基因組測(cè)序相結(jié)合的BSA混池測(cè)序技術(shù),被廣泛應(yīng)用到QTL 定位和候選基因挖掘[14]。人們通過使用較大的遺傳群體,增加極端表型個(gè)體數(shù)量和提高分子標(biāo)記密度,使BSA 更適用于靶基因定位,從而無需通過使用陽(yáng)性標(biāo)記對(duì)整個(gè)群體進(jìn)行基因分型驗(yàn)證假定標(biāo)記[15]。Shen 等[16]利用BSA混池測(cè)序和基于SSR標(biāo)記所得的QTL定位出三個(gè)小麥鐮刀菌枯萎?。‵HB)抗性區(qū)間。Trick 等[17]將測(cè)序數(shù)據(jù)與BSA 分析相結(jié)合,對(duì)小麥的谷物蛋白含量進(jìn)行精細(xì)定位,成功將基因GPC-B1定位在0.4 cM 的區(qū)間內(nèi)。Song 等[18]用基于下一代測(cè)序(NGS)的BSA 法,快速定位植物中兩個(gè)控制大豆種子子葉顏色的基因。

    本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建由SN14 與ZYD00006 為父母本的CSSLs 群體,然后利用ICIM 進(jìn)行QTL 定位,共獲得位于6 條連鎖群的13 個(gè)QTL 區(qū)間。同時(shí)構(gòu)建高低混池,進(jìn)行BSA 混池測(cè)序,得到新的QTL 區(qū)間。對(duì)兩方法得到的QTL 區(qū)間進(jìn)行整合,得到共識(shí)QTL區(qū)間。對(duì)該區(qū)間內(nèi)的所有基因進(jìn)行注釋,通過基因的序列對(duì)比、氨基酸變異確定候選基因。最終得到與大豆莢皮厚相關(guān)的目的基因,為高產(chǎn)大豆品種的遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    從2006 年至2018 年,使用母本黑龍江省栽培品種綏農(nóng)14(SN14)為與父本野生品種ZYD00006進(jìn)行雜交,再經(jīng)過多次的回交、自交,最后構(gòu)建一套包含208 個(gè)株系的染色體片段替代系(CSSLs)[19]。每個(gè)品系每年種成株行,行距60 cm,株距6 cm,行長(zhǎng)5 m。材料成熟后,每行材料隨機(jī)選取5 株,每株材料隨機(jī)取十個(gè)莢皮,整齊疊放在一起,用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量,獲取莢皮厚的表型數(shù)據(jù)[20]。

    1.2 BSA(Bulked Segregant Analysis)混池的構(gòu)建

    根據(jù)2013至2016莢皮厚4年的表型數(shù)據(jù),計(jì)算平均值,整體表型呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的正態(tài)分布(圖1),極大值2.40 cm 和極小值1.54 cm,相差0.86 cm,變異程度較大,以平均值加減一倍標(biāo)準(zhǔn)差篩選出極端表型各30 份材料(如表1),構(gòu)建DNA 混池,為混池測(cè)序做準(zhǔn)備。

    表1 莢皮厚高低混池的材料組成Table 1 Phenotypic screening of pod thickness in high and low mixed ponds

    圖1 CSSLs群體莢皮厚四年平均值表型數(shù)據(jù)Fig.1 Four-year average data of pod thickness of CSSLs population

    1.3 混池測(cè)序數(shù)據(jù)處理

    選取新鮮的葉片,使用CTAB 法提取植物組織的DNA,對(duì)提取的DNA 片段進(jìn)行修飾,添加測(cè)序接頭。利用PCR擴(kuò)增對(duì)DNA 片段進(jìn)行富集,完成測(cè)序混池的構(gòu)建。最后合格的DNA 文庫(kù),送于Illumina-HiSeqTM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。為了保證數(shù)據(jù)分析的可靠性,對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理:去掉測(cè)序接頭,過濾數(shù)據(jù)中未檢測(cè)堿基數(shù)量比值大于10%的數(shù)據(jù),再次過濾數(shù)據(jù)中低質(zhì)量堿基——即堿基質(zhì)量值小于10%大于50%的數(shù)據(jù),使用GATK 軟件進(jìn)行局部重新比對(duì),過濾得到高質(zhì)量的SNP 位點(diǎn)。最后利用BW[21]軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)定位到參考基因組中,進(jìn)行變異分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

    對(duì)CSSLs群體莢皮厚性狀的四年表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用ICIMapping4.1 對(duì)CSSLs 群體中“BIP”模型進(jìn)行QTL 分析。以LOD>2.5 為標(biāo)準(zhǔn),確定QTL 存在的依據(jù)。使用MapChart2.2 軟件,將定位得出的QTL 標(biāo)注在連鎖群上。QTL 命名方法如下:q+性狀名稱+LG或LG編號(hào)+“-”+QTL編號(hào)[8]。

    1.5 SNP-index關(guān)聯(lián)分析

    SNP-index 是通過計(jì)算極端混池間基因型頻率的顯著差異,進(jìn)而進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[22~24],利用雙親的重測(cè)序結(jié)果,計(jì)算極端混池SNP-index,尋找與性狀緊密相關(guān)的位點(diǎn)。計(jì)算公式如下:

    SNP-index(Mut)=ρx/(ρX+ρx)

    SNP-index(WT)=ρx/(ρX+ρx)

    ΔSNP-index=SNP-index(Mut)-SNP-index(WT)

    1.6 基因注釋

    以Williams 82.a2.v1 為參考基因組,根據(jù)所得的共識(shí)QTL 區(qū)間,利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)區(qū)間的所有基因進(jìn)行注釋。結(jié)合生物信息學(xué)分析,進(jìn)行序列比對(duì),同源基因功能查找,分析氨基酸變異,預(yù)測(cè)候選基因,確定與莢皮厚相關(guān)的目的基因。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CSSLs群體莢皮厚表型數(shù)據(jù)分析

    對(duì)CSSLs 群體2013 年至2016 年四年的莢皮厚表型數(shù)據(jù)(表2)統(tǒng)計(jì)分析。四年間的表型數(shù)據(jù)的極高值3.62 cm、極低值1.23 cm,相差2.39 cm,變異較大。四年間表型的平均值差異也較大。2013 年群體莢皮厚的平均值為1.67 cm,與2016 年群體表型的平均值1.67 cm 較接近,而同比明顯低于2014和2015莢皮厚表型平均值。CSSLs群體莢皮厚性狀在4個(gè)環(huán)境的數(shù)據(jù)分布都顯示為典型的近似正態(tài)分布,說明莢皮厚性狀符合數(shù)量性狀遺傳特征,適用于QTL 定位分析(圖2)。

    圖2 CSSLs群體四年莢皮厚表型數(shù)據(jù)頻率分布Fig.2 Frequency distribution of pod thickness phenotype data of CSSLs population in four years

    表2 四年CSSLs群體的莢皮厚表型數(shù)據(jù)參數(shù)Table 2 Phenotypic parameters of pod thickness in four year CSSLs population

    2.2 莢皮厚性狀QTL分析

    我們利用ICIM 法對(duì)大豆莢皮厚進(jìn)行QTL 定位,在8個(gè)連鎖群上共定位到13個(gè)與莢皮厚相關(guān)的QTL(表3,圖3)。表型貢獻(xiàn)率為2.98%~14.44%,LOD 值在2.53~8.43 之間。F 連鎖群上被檢測(cè)到的QTL 最多有3 個(gè),分別為qPT-f-1、qPT-f-2和qPTf-3。三個(gè)QTL位點(diǎn)的區(qū)間位置非常接近,可能是緊密連鎖的關(guān)系。N、K 連鎖群上的QTL 為2 個(gè),其他的連鎖群僅有1 個(gè)。其中qPT-n-2在2015 年和Mean兩個(gè)環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到,重復(fù)被檢測(cè)到也說明了該QTL位點(diǎn)的可靠性。

    圖3 CSSLs群體莢皮厚性狀QTL分析Fig.3 QTL analysis of pod thickness in CSSLs population

    表3 ICIM法對(duì)大豆夾皮厚性狀QTL分析Table 3 Analysis of QTL for pod thickness in soybean by ICIM

    2.3 BSA(bulked segregant analysis)測(cè)序數(shù)據(jù)分析

    進(jìn)行DNA 混池測(cè)序的極端材料中,共檢測(cè)到1 953 662 個(gè)原始SNP。經(jīng)過SNP 過濾,最終得到1 630 948個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)。

    利用混池間的基因型頻率和莢皮厚進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以群體的中值+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值,計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的ED 值,選擇ED 值大于閾值的區(qū)域?yàn)楹蜻x區(qū)間。最終在4 個(gè)連鎖群上定位了7 個(gè)與大豆莢皮厚相關(guān)的候選區(qū)域(表4,圖4)。其中,F(xiàn)連鎖群上檢測(cè)到3個(gè)QTL位點(diǎn),N連鎖群檢測(cè)到2個(gè)QTL位點(diǎn)。這與ICIM 法在F連鎖群和N連鎖群檢測(cè)到3個(gè)QTL和2個(gè)QTL的結(jié)果一致,說明F連鎖群和N連鎖群含有調(diào)控大豆莢皮厚性狀的QTL 位點(diǎn)。最小的QTL 區(qū)間qPT-f-4僅為0.08 Mb,最大的QTL 區(qū)間qPT-b1-1達(dá)到8 Mb。

    圖4 CSSLs群體莢皮厚性狀BSA分析Fig.4 BSA analysis of pod thickness in CSSLs population

    表4 BSA法對(duì)大豆莢皮厚性狀QTL分析Table 4 Analysis of QTLs associated with pod thickness in soybean by BSA

    2.4 共識(shí)QTL區(qū)間

    我們通過比較BSA 法和ICIM 法定位的QTL 位點(diǎn),找到公共的QTL 區(qū)間。這樣既能得到相對(duì)穩(wěn)定的QTL 位點(diǎn),也能縮小了QTL 的置信區(qū)間。將ICIM法檢測(cè)到的13 個(gè)QTL 區(qū)間與BSA 法檢測(cè)到的7 個(gè)QTL 位點(diǎn)相結(jié)合(圖5),獲得1 個(gè)穩(wěn)定的QTL 位點(diǎn)qPT-n-2。同時(shí),qPT-n-2在多個(gè)環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到,說明該QTL 是調(diào)控大豆莢皮厚的穩(wěn)定可靠QTL 位點(diǎn)。最終通過兩種分析方法,共同將影響大豆莢皮厚性狀的候選區(qū)間精確到3 號(hào)染色體0.03Mb(2 970 674 bp~3 000 004 bp)的區(qū)間內(nèi),為后續(xù)候選基因的挖掘工作奠定基礎(chǔ)。

    圖5 CSSLs群體莢皮厚性狀QTL在連鎖群上的分布Fig.5 Distribution of QTLs about pod thickness of CSSLs populations on linkage groups

    2.5 候選基因分析

    為得到共識(shí)QTL 區(qū)間內(nèi)的功能基因,我們對(duì)該區(qū)間進(jìn)行了基因注釋,得到4 個(gè)候選基因Gly?ma. 03G027000、Glyma. 03G027100、Glyma. 03G0272 00、Glyma. 03G027300注 釋 結(jié) 果(表5)。Gly?ma.03G027000的擬南芥同源基因?yàn)锳T3G50120,是未知功能的植物蛋白;Glyma. 03G027100沒有擬南芥同源基因,其GO 注釋為膜的組成部分;Gly?ma.03G027200的擬南芥同源基因?yàn)锳T1G35710,注釋為具有富含亮氨酸重復(fù)域的蛋白激酶家族蛋白,其GO 注釋為蛋白質(zhì)磷酸化以及蛋白激酶活性等功能。Glyma. 03G027300的擬南芥同源基因?yàn)锳T4G00110,注釋為UDP-D-葡萄糖醛酸4-表異構(gòu)酶3。通過Soybase 公共數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,四個(gè)基因在花、莢不同時(shí)期的表達(dá)量差異較大。Glyma.03G027 000和Glyma.03G027200在花莢各個(gè)時(shí)期表達(dá)量都非常低,而Glyma. 03G027100和Glyma. 03G027300在花莢各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量則顯著的較高,尤其是Glyma. 03G027300在花和莢中的表達(dá)量最高(如圖6)。

    圖6 soybase數(shù)據(jù)庫(kù)候選基因花莢時(shí)期表達(dá)量分析Fig.6 Expression analysis of candidate genes at flowering and pod stage in soybase database

    表5 大豆莢皮厚性狀候選基因注釋信息Table5 Candidate gene annotation information related to pod thickness of soybean

    2.6 候選基因氨基酸序列比對(duì)

    通過比對(duì)SN14和ZYD00006兩個(gè)親本間的堿基和氨基酸序列,Glyma. 03G027200的堿基變異程度很低,只有兩個(gè)堿基發(fā)生突變,對(duì)應(yīng)的組氨酸和亮氨酸氨基酸發(fā)生了非同義突變,氨基酸的相似度為99.82%。Glyma. 03G027100和Glyma. 03G027300的基因堿基序列變異程度很高。Glyma.03G027100有26處堿基發(fā)生突變,氨基酸序列有17種非同義突變,Glyma. 03G027300的堿基突變?yōu)? 處,對(duì)應(yīng)9 處氨基酸都發(fā)生了非同義突變。

    3 討論與結(jié)論

    現(xiàn)階段對(duì)大豆莢皮厚性狀研究?jī)?nèi)容較少。但是大豆莢皮厚與大豆的產(chǎn)量和抗病蟲能力都緊密相關(guān),是未來大豆?;繕?biāo)育種及分子育種的重要性狀。

    如今對(duì)于大豆QTL 定位的研究非常多。截止到2020 年1 月,Soybase 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.soybase.org)公布的與大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL 超過200個(gè),但具有重演性的QTL 很少[25,26]。究其原因是由于數(shù)量性狀遺傳機(jī)制復(fù)雜,受環(huán)境影響較大。傳統(tǒng)的QTL 定位需要構(gòu)建遺傳群體,與整個(gè)群體全部分析相比,BSA方法與成熟的測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,為快速基因定位和基因挖掘提供了技術(shù)支持,并為鑒定和開發(fā)新的分子標(biāo)記開辟了一條捷徑[27]。由于該方法僅僅分析子代群體中具有極端表型的一些個(gè)體,極大地降低了測(cè)序成本,而其統(tǒng)計(jì)能力也與QTL 定位相當(dāng),具有省時(shí)省力,精確度高的優(yōu)點(diǎn)[28,29]。本研究通過ICIM 法和BSA混池測(cè)序相結(jié)合的方法,共檢測(cè)到20 個(gè)QTL 位點(diǎn),分別位于N、C2、A2、K、O 等10 條連鎖群。位于F 連鎖群的QTL 位點(diǎn)有6 個(gè),位置緊密相連,表明F 染色體含有調(diào)控大豆莢皮厚性狀的重要基因。qPT-n-1位于兩種方法檢測(cè)的共識(shí)QTL區(qū)間,同時(shí)在兩個(gè)環(huán)境中同時(shí)多次被檢測(cè)到,具有重演性、穩(wěn)定性的特點(diǎn),故而是和大豆莢皮厚關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵QTL。

    圖7 候選基因親本序列氨基酸比對(duì)Fig.7 Amino acid alignment of candidate gene between two parents

    本研究對(duì)定位到的QTL 區(qū)間qPT-n-1內(nèi)基因進(jìn)行了分析。結(jié)合基因注釋信息分析與Soybase 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站提供的基因空間表達(dá)分析,最終從中篩選出2 個(gè)與大豆莢皮厚性狀相關(guān)的目的基因,為Glyma.03G027100和Glyma.03G027300。Glyma. 03G027100的GO 注釋為細(xì)胞膜的組成部分相關(guān),很有可能是調(diào)控細(xì)胞膜生長(zhǎng)的重要功能基因,在莢中高表達(dá),說明與莢皮厚性狀密切相關(guān),可能是直接調(diào)控大豆莢皮厚性狀的基因。Gly?ma.03G027300是花和莢中的各個(gè)時(shí)期表達(dá)量最高的基因,該基因的擬南芥同源基因?yàn)锳T4G00110,在UDP-D-葡萄糖醛酸-表型異構(gòu)酶的編碼中起作用,UDP-葡萄糖是由蔗糖降解所得到的產(chǎn)物,經(jīng)過UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)催化后進(jìn)入纖維素合成途徑[30]。這個(gè)過程中UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸,經(jīng)由UDP-葡萄糖醛酸-差向異構(gòu)酶(GAE)和半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(GAUT)的催化作用,最終進(jìn)入果膠的合成途徑[31]。這個(gè)途徑的中間產(chǎn)物還可作為細(xì)胞壁組分的合成前體[32]。GO 注釋描述為碳水化合物代謝過程、生物合成過程等功能,是一類參與植物生長(zhǎng)發(fā)育中能量合成消耗循環(huán)的重要基因,能量代謝的調(diào)控作用側(cè)面影響大豆莢皮的發(fā)育,對(duì)植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中都起著關(guān)鍵作用。這兩個(gè)基因都可能直接或間接地參與了大豆莢皮厚的調(diào)節(jié)途徑,其具體的生物學(xué)過程和分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究鑒定到與莢皮厚相關(guān)的重要的、可信度高的QTLqPT-n-1,預(yù)測(cè)到Gly?ma. 03G027100和Glyma. 03G027300是 調(diào) 控 大 豆 莢皮厚性狀的重要基因。這些工作為大豆莢皮厚研究奠定了基礎(chǔ),為開發(fā)新的分子標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)大豆莢皮厚分子標(biāo)記輔助育種及?;繕?biāo)提供理論和材料基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    皮厚豆莢表型
    登記簿里的信任
    黨員生活(2023年7期)2023-07-26 21:05:23
    豆莢兒,嘭!
    小房子上的綠豆莢
    建蘭、寒蘭花表型分析
    GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
    豆莢旅館
    剝豆莢
    慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學(xué)測(cè)定的臨床意義
    72例老年急性白血病免疫表型分析
    “臉皮厚”
    手机成人av网站| 天堂动漫精品| 青草久久国产| 午夜久久久在线观看| 99国产精品99久久久久| 免费在线观看影片大全网站| 十八禁网站免费在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 最好的美女福利视频网| 黄色视频,在线免费观看| 日韩有码中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产私拍福利视频在线观看| 在线观看午夜福利视频| 一本精品99久久精品77| 国产午夜福利久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 69av精品久久久久久| 亚洲免费av在线视频| 国产亚洲欧美98| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜日韩欧美国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲国产看品久久| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品影院久久| 亚洲av电影在线进入| 欧美乱妇无乱码| 99久久国产精品久久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久久国产成人免费| 免费搜索国产男女视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av成人av| 国产一区二区激情短视频| 波多野结衣高清作品| 99热只有精品国产| 国产精品一区二区三区四区久久 | 视频在线观看一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 69av精品久久久久久| 好男人在线观看高清免费视频 | 天天添夜夜摸| 99久久综合精品五月天人人| 老司机在亚洲福利影院| 国产私拍福利视频在线观看| 午夜精品在线福利| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩免费av在线播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久午夜亚洲精品久久| 久久 成人 亚洲| ponron亚洲| 久久香蕉国产精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 看黄色毛片网站| 自线自在国产av| 在线天堂中文资源库| 欧美色视频一区免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 麻豆久久精品国产亚洲av| 波多野结衣高清作品| 久9热在线精品视频| 午夜免费鲁丝| 国产精品影院久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 手机成人av网站| 草草在线视频免费看| 精品久久久久久久末码| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美一区二区精品小视频在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产国语露脸激情在线看| 精品高清国产在线一区| 91成人精品电影| 制服丝袜大香蕉在线| 在线av久久热| 久久国产精品影院| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 男人的好看免费观看在线视频 | 色哟哟哟哟哟哟| 长腿黑丝高跟| 国内精品久久久久久久电影| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲国产看品久久| 国产精华一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 色在线成人网| 久久精品91无色码中文字幕| 怎么达到女性高潮| 国产亚洲精品第一综合不卡| 麻豆av在线久日| 久久午夜综合久久蜜桃| 自线自在国产av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美日韩精品网址| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 久久香蕉国产精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美激情 高清一区二区三区| tocl精华| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一a级毛片在线观看| 日韩av在线大香蕉| 免费在线观看日本一区| 亚洲欧美日韩无卡精品| √禁漫天堂资源中文www| 白带黄色成豆腐渣| 日韩三级视频一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 免费无遮挡裸体视频| 18禁国产床啪视频网站| 免费在线观看亚洲国产| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文字幕久久专区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中国美女看黄片| 淫妇啪啪啪对白视频| 午夜福利高清视频| 一夜夜www| 伦理电影免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产v大片淫在线免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 嫩草影院精品99| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| www日本在线高清视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产日本99.免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 1024香蕉在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久国产精品麻豆| 欧美中文日本在线观看视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美性猛交黑人性爽| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久香蕉国产精品| 成人18禁在线播放| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最新在线观看一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美国产精品va在线观看不卡| 韩国精品一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 香蕉av资源在线| cao死你这个sao货| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜成年电影在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲国产精品合色在线| ponron亚洲| 国产av一区二区精品久久| 国产黄a三级三级三级人| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久视频播放| 色av中文字幕| 看黄色毛片网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲国产精品sss在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品美女久久av网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 看免费av毛片| 美女大奶头视频| 国产精华一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av电影在线进入| 国产精品 欧美亚洲| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美黑人精品巨大| 夜夜夜夜夜久久久久| 麻豆成人av在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91成人精品电影| 国产成人影院久久av| 中文字幕av电影在线播放| 99re在线观看精品视频| 亚洲成人久久爱视频| 岛国在线观看网站| 久久中文字幕人妻熟女| 中文字幕av电影在线播放| av欧美777| 国产麻豆成人av免费视频| 白带黄色成豆腐渣| 91av网站免费观看| 国产精品野战在线观看| 88av欧美| 久久久久精品国产欧美久久久| 男人舔女人的私密视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 在线永久观看黄色视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲一码二码三码区别大吗| netflix在线观看网站| 宅男免费午夜| 法律面前人人平等表现在哪些方面| ponron亚洲| 亚洲国产欧美一区二区综合| 超碰成人久久| 亚洲av电影在线进入| 两个人看的免费小视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产成人av教育| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 欧美一级a爱片免费观看看 | 中国美女看黄片| 香蕉久久夜色| 视频区欧美日本亚洲| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| www.自偷自拍.com| 日韩大码丰满熟妇| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品二区激情视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜久久久久精精品| 国产一区二区三区视频了| 在线观看一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 人人澡人人妻人| 在线观看66精品国产| 黄色女人牲交| 午夜免费激情av| 男女那种视频在线观看| 身体一侧抽搐| 黄色女人牲交| www.www免费av| 校园春色视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av成人av| 母亲3免费完整高清在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产单亲对白刺激| 欧美日本视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美又色又爽又黄视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 高清毛片免费观看视频网站| 特大巨黑吊av在线直播 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产野战对白在线观看| 草草在线视频免费看| 国产伦人伦偷精品视频| 99热6这里只有精品| 中文字幕高清在线视频| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av电影在线进入| 俺也久久电影网| 久99久视频精品免费| 久久伊人香网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av成人av| 制服丝袜大香蕉在线| 91国产中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精品久久国产高清桃花| aaaaa片日本免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 一级黄色大片毛片| 午夜福利一区二区在线看| 夜夜爽天天搞| 国产高清videossex| 亚洲 国产 在线| 免费高清在线观看日韩| 午夜福利成人在线免费观看| 久热爱精品视频在线9| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一本一本综合久久| 欧美日本视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 波多野结衣巨乳人妻| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产熟女xx| 欧美激情极品国产一区二区三区| 丁香六月欧美| 国产亚洲欧美在线一区二区| 波多野结衣巨乳人妻| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精品av麻豆狂野| 香蕉av资源在线| a在线观看视频网站| 男女那种视频在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99在线人妻在线中文字幕| 无人区码免费观看不卡| 国产亚洲av高清不卡| 大型av网站在线播放| 欧美性长视频在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 一本综合久久免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲九九香蕉| 国产熟女xx| 视频区欧美日本亚洲| 丁香六月欧美| 91成年电影在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜福利免费观看在线| 在线观看舔阴道视频| 90打野战视频偷拍视频| 中文资源天堂在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久国产精品麻豆| 国产人伦9x9x在线观看| 精品久久久久久,| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品人妻少妇| 在线观看午夜福利视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精华国产精华精| 国产精品一区二区精品视频观看| 又大又爽又粗| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一区二区三区精品91| 国产视频一区二区在线看| 丝袜人妻中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 午夜福利视频1000在线观看| 丝袜在线中文字幕| 无人区码免费观看不卡| 婷婷精品国产亚洲av在线| 757午夜福利合集在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 69av精品久久久久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲av熟女| 婷婷亚洲欧美| 视频在线观看一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 制服诱惑二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久这里只有精品19| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品亚洲av一区麻豆| av国产免费在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级黄片播放器| 永久网站在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产亚洲欧美98| 在线观看66精品国产| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久欧美国产精品| 免费av毛片视频| 国产精品伦人一区二区| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国国产精品蜜臀av免费| 免费av观看视频| 乱人视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 插阴视频在线观看视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 最近的中文字幕免费完整| 日日啪夜夜撸| 免费看日本二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费av毛片视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区激情短视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| av视频在线观看入口| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 网址你懂的国产日韩在线| 中国美女看黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久人人爽人人片av| 成人三级黄色视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 99热只有精品国产| 看黄色毛片网站| 免费观看人在逋| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 毛片女人毛片| 日日啪夜夜撸| 精品久久久久久成人av| 国产精品免费一区二区三区在线| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩欧美在线乱码| 嫩草影院新地址| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产色片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲av成人av| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 婷婷亚洲欧美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 97碰自拍视频| 欧美极品一区二区三区四区| 丰满的人妻完整版| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 最近的中文字幕免费完整| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产av一区在线观看免费| 亚洲av成人av| 欧美人与善性xxx| 一个人观看的视频www高清免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 18禁在线播放成人免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲国产精品成人久久小说 | 校园人妻丝袜中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 老女人水多毛片| 精品久久国产蜜桃| 久久久久国产网址| 一边摸一边抽搐一进一小说| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美精品国产亚洲| 国产伦在线观看视频一区| 美女内射精品一级片tv| 22中文网久久字幕| 色av中文字幕| 天堂√8在线中文| 伦精品一区二区三区| 久久午夜福利片| ponron亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 久久中文看片网| 日韩欧美在线乱码| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚州av有码| 久久久久久久久中文| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲成人久久爱视频| 国产 一区精品| 精品久久久久久久久久久久久| 哪里可以看免费的av片| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 美女内射精品一级片tv| 日本免费一区二区三区高清不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲自偷自拍三级| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精华一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 色综合站精品国产| 一个人看的www免费观看视频| 在线免费十八禁| 日本色播在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲成人av在线免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 有码 亚洲区| 看免费成人av毛片| 国产淫片久久久久久久久| 美女免费视频网站| 亚洲三级黄色毛片| av视频在线观看入口| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品伦人一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 内射极品少妇av片p| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂网av新在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 不卡一级毛片| 成人二区视频| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久国产网址| 国产人妻一区二区三区在| 少妇丰满av| 国产精品野战在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99久久精品热视频| 看黄色毛片网站| 国模一区二区三区四区视频| 国产男靠女视频免费网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品一二三区在线看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本欧美国产在线视频| eeuss影院久久| 亚洲av成人精品一区久久| 国产成人福利小说| 中文资源天堂在线| 在线观看午夜福利视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久精品国产亚洲av天美| 91久久精品国产一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 韩国av在线不卡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久国产av精品国产电影| 久久精品人妻少妇| 国产精品伦人一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久色成人| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 两个人视频免费观看高清| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲人成网站在线播| 淫秽高清视频在线观看| 小说图片视频综合网站| 干丝袜人妻中文字幕| 长腿黑丝高跟| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 22中文网久久字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 深爱激情五月婷婷| 国产精品一区二区性色av| 一级av片app| 精品久久国产蜜桃| 亚洲成人av在线免费| 成人二区视频| 久久久久久国产a免费观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色视频www国产| 天堂√8在线中文| 亚洲av二区三区四区| 色视频www国产| АⅤ资源中文在线天堂| 国产伦在线观看视频一区| 天天躁日日操中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产人妻一区二区三区在| 嫩草影视91久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲图色成人| 精品午夜福利在线看| 日韩欧美在线乱码| 狠狠狠狠99中文字幕| 熟女电影av网| 国产美女午夜福利| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 又爽又黄a免费视频| 有码 亚洲区| 国产成人freesex在线 | 免费无遮挡裸体视频| 老司机影院成人| 国产男靠女视频免费网站| 高清毛片免费看| 哪里可以看免费的av片|