通過表型和基因型鑒定篩選適合春油菜區(qū)的優(yōu)異種質(zhì)

徐亮，林建榮，杜德志

（國家油菜改良中心青海分中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部春油菜科學(xué)觀測實驗站/青海省春油菜遺傳改良重點實驗室/青海省春油菜工程技術(shù)研究中心/青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧， 810016）

油菜是最我國重要的油料作物，2018 年國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)表明，全國油菜種植面積達9826.5 萬畝（折合655.1 萬公頃），總產(chǎn)1328.1 萬噸。每年可生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菜籽油約520 萬噸，占國產(chǎn)植物油的47%；每年生產(chǎn)高蛋白飼用菜籽粕約800 萬噸，是我國第二大飼用蛋白源[1]。

我國油菜分為春油菜和冬油菜兩個生態(tài)類型。春油菜主要分布在青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏等?。▍^(qū)），總面積約66.7 萬公頃，其中甘藍(lán)型油菜面積約43 萬公頃，占春油菜總面積的64.5%[2]。青海省甘藍(lán)型春油菜資源主要從加拿大等少數(shù)春油菜國家引進，數(shù)量少、遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗（耐）菌核病性較弱。為了拓寬甘藍(lán)型春油菜資源的遺傳基礎(chǔ)，青海省從長江流域引進了一批半冬性甘藍(lán)型油菜資源，研究發(fā)現(xiàn)，半冬性甘藍(lán)型油菜資源與春性甘藍(lán)型油菜的遺傳差異較大，且兩者間的遺傳差異大于春性與春性資源間、半冬性與半冬性資源間的遺傳差異，半冬性甘藍(lán)型油菜資源的抗（耐）菌核病性顯著強于春性甘藍(lán)型油菜品種（系）[3,4]，春性品種（系）與半冬性品種（系）組配的雜交種比同種類型品種（系）間組配的雜交種具有更強的雜種優(yōu)勢[5]，春油菜中導(dǎo)入半冬性油菜遺傳成分，可以增強春油菜雜種優(yōu)勢，提高雜交種產(chǎn)量和菌核病抗性[6]。

基于上述研究結(jié)果，“十二五”期間，青海省又從國內(nèi)引進了一批甘藍(lán)型油菜資源。本研究對這批資源進行了遺傳多樣性分析，鑒定其開花時間、莖稈強度、產(chǎn)量和品質(zhì)等相關(guān)性狀，以期為春油菜新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

收集于“十二五”期間，來自國家油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系和國內(nèi)科研單位。通過5 代自交純化，淘汰農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀較差、初花期與甘藍(lán)型春油菜青油14 號差異超過10 d 的資源，獲得了124 份農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的甘藍(lán)型油菜。由于在青海生態(tài)環(huán)境下，長江上游區(qū)的資源普遍表現(xiàn)早熟，而黃淮海地區(qū)的資源普遍表現(xiàn)晚熟，因此這兩個生態(tài)區(qū)中選的資源較少。因此本研究以這124 份資源和青海原有的20份春油菜品種（系）為材料（表1）。

表1 144份甘藍(lán)型油菜品種（系）基本信息Table 1 Information of 144 germplasm resources in Brassica napus

續(xù)表

1.2 方法

利用50K SNP 芯片（包含42 090 個甘藍(lán)型油菜SNP 標(biāo)記，由武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司開發(fā)）對144份甘藍(lán)型油菜資源進行基因型分析，以差異位點占總檢測位點的比率作為兩個樣品間的遺傳距離，差異位點越少，對應(yīng)兩個樣品的遺傳距離就越近，得到一個n×n的二維遺傳距離矩陣（n指用于聚類的總樣品數(shù)）。利用R語言的ape和phangorn 包的UPGMA 方法對上述的距離矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在https://itol.embl.de/網(wǎng)站進行可視化，并使用不同顏色注釋樣品來源信息。所有材料基因型分析試驗由武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司完成。

2019 年所有材料種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院田間試驗區(qū)，試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，兩次重復(fù)，每小區(qū)3 行，行長2 m，行距0.3 m（小區(qū)面積1.8m2）。出苗后及時間苗除草，3～4葉期按株距0.15 m進行定苗，其它栽培措施按試驗區(qū)常規(guī)管理進行。

開花期調(diào)查：調(diào)查出苗到初花的時間。

莖稈強度相關(guān)性狀測定：成熟期收獲子葉節(jié)以上20～40 cm 莖段6 根，掛好編號并放置陰涼潮濕處，取樣當(dāng)天用莖稈強度測定儀（型號YYD-1，中國浙江托普儀器有限公司生產(chǎn)）測量莖折斷力、莖壁穿透力；用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）測量莖段近地端的直徑、莖壁厚度、木質(zhì)部厚度，每根莖段測量兩個部。由于莖折斷力與莖直徑呈顯著正相關(guān)，為了消除莖直徑對莖折斷力的影響，采用單位莖橫切面積抗斷力作為莖稈強度的評價指標(biāo)，計算公式為：

莖稈強度=莖抗斷力/πr2

（把油菜莖稈視為圓柱體，r為莖稈半徑）。

產(chǎn)量和品質(zhì)性狀測定：成熟期考查小區(qū)產(chǎn)量，并收獲6 個單株進行考種，考查角果長度、每角粒數(shù)、千粒重；用近紅外光譜儀（BRUKER MATRIX-1）檢測種子的芥酸含量、硫甙含量和含油量。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

利用50K SNP 芯片的基因型數(shù)據(jù)計算144 份甘藍(lán)型油菜資源兩兩之間的遺傳距離，最大遺傳距離為0.7561，最小遺傳距離為0.0049，平均遺傳距離為0.4683，遺傳距離大于等于0.5 的資源對數(shù)占總對數(shù)的36.45%，表明這批資源的遺傳多樣性豐富。按照資源兩兩之間的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，除了來自西北春油菜區(qū)的資源外，同一來源的資源沒有明顯地聚在一起，表明地理距離與遺傳距離沒有明顯的相關(guān)性，不再適合作雜交種雙親遺傳距離選擇的依據(jù)。

圖1 144份甘藍(lán)型油菜資源系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 UPGMA tree of 144 germplasm resources in Brassica napus

以同一來源的資源作為一個類群，分析同一類群內(nèi)和不同類群之間的平均遺傳距離，結(jié)果見表2。類群內(nèi)平均遺傳距離普遍小于不同類群之間的平均遺傳距離，但黃淮海區(qū)的資源群內(nèi)平均遺傳距離反而大于其與其它類群間的遺傳距離，表明黃淮海區(qū)的資源存在豐富的遺傳變異。長江上游區(qū)、長江中游區(qū)和長江下游區(qū)三個類群的資源，群內(nèi)和群間的平均遺傳距離都不大，表明這三個類群之間資源交流更頻繁。西北春油菜類群內(nèi)部平均遺傳距離為0.4189，與國外資源群之間的遺傳距離為0.4478，與黃淮海資源群、長江流域的三個類群之間的遺傳距離均超過0.5，表明西北春油菜資源群內(nèi)遺傳差異相對較小，與國內(nèi)四個類群間存在較大的遺傳差異。

表2 甘藍(lán)型油菜資源遺傳距離Table 2 Genetic distance of germplasm resources in B.napus

進一步分析發(fā)現(xiàn)，在西北春油菜資源群和長江中游資源群內(nèi)，部分資源之間存在明顯的親緣關(guān)系，遺傳距離小于0.1 的資源各有13 對。根據(jù)這一結(jié)果推測，在西北春油菜區(qū)和長江中游區(qū)，育種家使用了更為相近的優(yōu)良品種為親本創(chuàng)制資源。

2.2 重要性狀表型變異

144份甘藍(lán)型油菜的13個重要性狀表型變異分析結(jié)果見表3。品質(zhì)性狀方面，芥酸含量和硫甙含量有較大的變異系數(shù)，主要原因是這些資源含少數(shù)幾個品質(zhì)為雙高的資源；來源于國外、西北區(qū)和黃淮區(qū)的資源平均含油量高于長江流域的資源。莖稈強度相關(guān)性狀方面，來源于長江流域的資源具有較粗的莖稈，來源于國外的資源平均莖直徑最??；來源于國外的資源莖壁厚度較??；長江流域和黃淮區(qū)的資源莖折斷力高于西北區(qū)和國外的資源；黃淮區(qū)和下游區(qū)的資源莖稈強度值相對較大；六個類群資源在木質(zhì)部厚度和莖穿透力兩個性狀上沒有顯著差異。產(chǎn)量性狀方面，來源于長江中游區(qū)和國外資源具有較多的每角粒數(shù)；來源于長江流域的資源千粒重較大；長江下游區(qū)的資源平均小區(qū)產(chǎn)量最高，其次是上游區(qū)，平均小區(qū)產(chǎn)量最低的是黃淮區(qū)的資源；以春油菜區(qū)推廣面積最大的常規(guī)品種青油14號為對照，篩選出小區(qū)產(chǎn)量超過青油14號的資源55 份，其中長江中游22 份，長江下游13 份，長江上游4份，黃淮區(qū)1份，西北春油菜區(qū)15份。

表3 不同來源甘藍(lán)型油菜資源重要性狀分析Table 3 Phenotypic analysis of germplasm resources in B.napus

144份資源中，莖直徑超過17 mm 的資源有6份（X621、X553、X603、X573、X459、X567），木質(zhì)部厚度超過1 mm 的資源8 份（X377、X567、X553、X545、X565、72Y、X393、X411），這些資源更容易獲得較大的生物產(chǎn)量，可用于飼用油菜資源創(chuàng)新和新品種選育。鑒定篩選出莖折斷力超過80 N 的資源12 份（X621、157Y、X565、X567、X545、X469、X641、X579、X651、X603、X591、X457），莖稈強度超過40 N/cm2的資源15 份（X473、157Y、X621、X667、X449、X581、X625、X631、X641、X469、X549、X499、X639、X503、X617），這些資源可用于抗莖倒油菜資源創(chuàng)新和新品種選育。在產(chǎn)量及其相關(guān)性狀上，鑒定篩選到小區(qū)產(chǎn)量超過600 g 的資源5 份（X457、X399、X603、X373、X555），千粒重超過6 g 的資源9 份（X599、X515、X511、X535、X531、X399、X593、X371、X603），這些資源可用于產(chǎn)量性狀的改良。篩選到含油量超 過48% 的 資 源9 份（X653、X555、X553、X431、X665、X635、X551、121Y、159Y），這些資源可為高含油量春油菜品種選育提供有利的基因資源。

2.3 綜合性狀優(yōu)良資源的遺傳差異分析

在144 份資源中，篩選出小區(qū)產(chǎn)量超過青油14號的資源，同時品質(zhì)達到雙低標(biāo)準(zhǔn)、含油量超過40%、每角粒數(shù)大于20粒、莖稈強度超過30 N/cm2作為綜合性狀優(yōu)良的資源共22 份。對這些資源的遺傳距離進行分析，篩選出遺傳距離大于等于0.4 的資源對（表4）。大量的研究已經(jīng)證明，遺傳差異是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，在一定的范圍內(nèi)，遺傳差異與雜種優(yōu)勢呈正相關(guān)，表4 的資源對可為甘藍(lán)型春油菜雜交種親本選配提供參考，也可用于改良現(xiàn)有優(yōu)良親本系，進一步拓寬親本間的遺傳差異。

表4 綜合性狀優(yōu)良資源的遺傳距離矩陣（≥0.4）Table 4 Genetic distance matrix of resources with excellent comprehensive traits (≥0.4)

3 討論

3.1 遺傳多樣性評價方法

遺傳多樣性是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)。早期主要利用地理來源和表型性狀來評價種質(zhì)資源的遺傳差異[7～10]，但隨著油菜遺傳育種的發(fā)展，種質(zhì)資源的跨區(qū)交流更加頻繁、表型性狀易受環(huán)境影響等問題，限制了這兩種方法在種質(zhì)資源遺傳多樣性評價中的應(yīng)用。本文的研究結(jié)果也進一步證明，地理來源難以有效地評價種質(zhì)資源的遺傳差異。

蛋白質(zhì)檢測技術(shù)[11,12]和基于DNA 水平的分子標(biāo)記技術(shù)[13～22]在油菜遺傳多樣性評價中得到廣泛應(yīng)用，但這些技術(shù)存在檢測位點數(shù)少、檢測效率低、檢測時間長等問題。近來年，基因組測序和SNP 芯片技術(shù)已經(jīng)用于油菜遺傳多樣性研究[23～26]，使得遺傳多樣性評價更準(zhǔn)確、高效。本研究利用50K SNP 芯片進行遺傳多樣性分析，可以檢測全基因組4.2 萬個位點，數(shù)據(jù)過濾優(yōu)化之后獲得高質(zhì)量的SNP 標(biāo)記28 491 個，利用這些基因組數(shù)據(jù)進行遺傳多樣性分析，能更準(zhǔn)確地反映種質(zhì)資源在基因組水平的遺傳差異。

3.2 雜種優(yōu)勢模式和親本選育方法

杜德志等[4～6]研究表明，甘藍(lán)型春油菜雜交種親本組配模式中，“春性×半冬性”的親本組配模式的雜種優(yōu)勢強于“春性×春性”、“半冬性×半冬性”兩種模式組配的雜交種，同時在春油菜中導(dǎo)入半冬性油菜遺傳成分，也可以增強春油菜雜種優(yōu)勢、提高雜交種的產(chǎn)量和菌核病抗性。而得出以上研究結(jié)果的重要原因是春性甘藍(lán)型油菜與半冬性甘藍(lán)型油菜之間具有較大的遺傳差異。本文的研究也進一步證明，西北春油菜區(qū)的資源與長江流域的資源存在較大的遺傳差異。

外來資源的引進，一方面可以拓寬育種資源的遺傳基礎(chǔ)，但另一方面也加大了雜交種選育過程中親本選配的工作量和復(fù)雜性。在育種過程中，確保雜交種雙親有較大的遺傳差異是很有必要的，結(jié)合本研究的結(jié)果，在春油菜雜交種選育過程中，可以構(gòu)建兩個雜交種親本群，一個親本群由國外和西北春油菜優(yōu)良育種材料構(gòu)成，另一個由長江流域的優(yōu)良育種材料組成。在雜交種親本選育過程中，用其中一個親本群的資源相互雜交或回交轉(zhuǎn)育的方法選育新的不育系和保持系，用另一個親本群的資源相互雜交或回交轉(zhuǎn)育的方法選育新的恢復(fù)系，采用這種方法可以確保不育系與恢復(fù)系之間有較大的遺傳差異。

3.3 春油菜區(qū)資源引進與利用

通過對國內(nèi)外144 份甘藍(lán)型油菜資源的生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗倒性和遺傳差異進行分析，結(jié)果表明，來源于長江中游和長江下游的資源在春油菜區(qū)表現(xiàn)較好，更容易篩選出符合育種目標(biāo)的品種資源?；谶@一結(jié)果，在今后資源引進與利用中，可側(cè)重引進和利用長江中游和長江下游的資源，以提高育種效率。