花生萌發(fā)期對(duì)低溫脅迫的生理生化響應(yīng)機(jī)制

呂登宇，郝西，苗利娟，于海秋，王玉龍，張俊，董文召，黃冰艷，張新友*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽， 110866；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南省作物分子育種研究院/國家生物育種產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州， 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州， 450002）

花生（Arachis hypogaeaL.）是世界上重要的豆科作物之一，是我國重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物[1]，其種子萌發(fā)是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜調(diào)控途徑，也是生產(chǎn)過程中最重要、最脆弱的一個(gè)階段，生物和非生物脅迫均可對(duì)其生長和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[2～4]，而在花生萌發(fā)和幼苗早期生長期間的低溫脅迫則是制約花生推廣種植的最常見環(huán)境脅迫因子之一[5]。在我國，低溫是影響花生早春及秋季播種的重要因素，可對(duì)花生種子出芽和幼苗生長帶來嚴(yán)重影響[6～8]。本研究探討低溫脅迫對(duì)花生種子萌發(fā)過程中生理生化的影響，為花生耐低溫種植及抗冷性研究提供理論依據(jù)。近年來，隨著花生生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，花生耐低溫研究越來越受到研究者的重視，在花生冷害方面也取得了一定進(jìn)展[9]?；ㄉ劝l(fā)的最低溫度為12～15℃[10]，在低于最適溫度時(shí)，種子活力減弱[11]，在14～23℃范圍內(nèi)花生出苗速度和溫度呈正相關(guān)關(guān)系[12]。低溫影響最常見的癥狀是萌發(fā)率低和萌發(fā)延遲[13]，花生種子吸脹期間，6℃以下低溫脅迫24 小時(shí)以上，發(fā)芽率和胚根伸長均受到影響[14]。長江流域、華南地區(qū)、兩廣地區(qū)及東北地區(qū)季節(jié)性低溫和突發(fā)的極端天氣等易導(dǎo)致花生出苗率降低、出苗時(shí)間延長，甚至“粉籽”、爛種、死苗，直接導(dǎo)致花生減產(chǎn)[15～18]。研究表明，低溫處理提高了花生品種相對(duì)膜透性、丙二醛含量[19]，促使花生幼苗可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖含量增加[20]。鐘鵬等[21]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫誘導(dǎo)了抗氧化酶活性增強(qiáng)，以清除體內(nèi)氧自由基、活性氧等物質(zhì)，進(jìn)而防止植物受到逆境傷害[22～24]。目前對(duì)于花生耐低溫生理生化機(jī)制的研究多集中在出苗后，花生種子萌發(fā)期研究相對(duì)較少[25]，且采用的低溫處理方法和檢測指標(biāo)不同，研究結(jié)果之間難以直接比較和借鑒。本研究采取冷浸法模擬花生在萌發(fā)期突然遭遇短時(shí)間低溫脅迫，利用差異極顯著的感低溫材料與耐低溫材料，通過測定種子露白率、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等一系列生理生化指標(biāo)，對(duì)花生種子萌發(fā)期抗冷性進(jìn)行比較研究，探討花生萌發(fā)期耐低溫脅迫的生理生化響應(yīng)機(jī)制，為花生的抗冷栽培和育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選取耐低溫型品種豫花22 號(hào)和中間型品種漯花16 號(hào)以及低溫敏感型品種泉花6 號(hào)、魯花11 號(hào)為試驗(yàn)材料，供試材料的低溫耐受性于之前試驗(yàn)中獲得[4]（從86 份種質(zhì)中鑒定，含國內(nèi)主栽64 個(gè)品種及育種高代材料22個(gè)品系），以第7 d相對(duì)發(fā)芽率為耐低溫性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，材料描述詳見表1。均選用籽仁飽滿、種皮無破損、均勻一致的種子為供試用種。

表1 品種名稱、類型、來源及萌發(fā)期低溫耐受性Table 1 Name,type,source and low temperature tolerance of varieties at germination stage

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為兩個(gè)處理：以2℃浸種48 h 為低溫脅迫處理（LS），以25℃浸種48 h 作為常溫對(duì)照（CK），處理后均轉(zhuǎn)到25℃步入式人工氣候室暗培養(yǎng)7 d。分別在第0 d（干種子）、1 d、2 d（脅迫期）、3 d、5 d、7 d（恢復(fù)期）取花生子葉，液氮速凍，后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于生理生化指?biāo)的測定。每處理選用25粒種子為一個(gè)重復(fù)，3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子露白率、發(fā)芽率的測定 處理后，每天調(diào)查各處理種子的露白數(shù)、發(fā)芽數(shù)，依據(jù)以下公式計(jì)算露白率及發(fā)芽率：

露白率（%）=露白種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100

1.3.2 種子相對(duì)發(fā)芽率的測定 統(tǒng)計(jì)第7 d 發(fā)芽率，依據(jù)以下公式計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率：

式中：

GP2℃：2℃下的發(fā)芽率；

GP25℃：25℃下的發(fā)芽率

1.4 生理指標(biāo)的測定

低溫脅迫24 h時(shí)種子電導(dǎo)率參照牛曉雪等[26]的方法測定；丙二醛（MDA）含量，抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（Ss）、含量均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒（微量法）進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 26.0 進(jìn)行方差顯著性和相關(guān)性分析，采用Microsoft Excel 2016和軟件Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析和相關(guān)圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對(duì)花生種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

由表2得知，不同抗性花生品種在不同溫度處理下，露白率、發(fā)芽率以及相對(duì)發(fā)芽率均存在較大差異。常溫處理（CK）的各花生品種露白率和發(fā)芽率差異不顯著，其露白率和發(fā)芽率均在92%以上；低溫處理的各花生品種露白率和發(fā)芽率差異顯著，耐低溫型品種豫花22號(hào)露白率和發(fā)芽率均顯著高于中間型及敏感性品種，但均低于CK。不同抗性花生品種的相對(duì)發(fā)芽率差異達(dá)顯著水平，耐低溫型品種豫花22號(hào)顯著高于中間型和敏感型品種，為90.67%。

表2 不同溫度處理下各品種露白率和發(fā)芽率情況Table 2 Whitening rate and germination rate of different varieties under different temperatures

2.2 不同溫度處理對(duì)花生種子膜透性的影響

如圖1A 所示，不同抗性花生品種，常溫處理電導(dǎo)率值均高于低溫處理。低溫脅迫24 h 后，各品種電導(dǎo)率值差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），由小到大依次為豫花22 號(hào)、漯花16 號(hào)、泉花6 號(hào)和魯花11 號(hào)。中間型品種漯花16 號(hào)、敏感型品種泉花6 號(hào)、魯花11號(hào)電導(dǎo)率值分別為豫花22號(hào)的1.15倍、1.59倍、2.5 倍。以上結(jié)果說明，低溫脅迫后，耐低溫型品種豫花22號(hào)電解質(zhì)外流最少，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜傷害程度最?。黄浯螢橹虚g型品種漯花16 號(hào)；敏感型品種溶質(zhì)外流較多，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜傷害程度較大。

由圖1B 得知，常溫處理?xiàng)l件下，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長，種子膜脂過氧化反應(yīng)逐漸加快，各品種MDA 含量均大幅增加，在第5 d 達(dá)到峰值后小幅下降，不同抗性品種未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。2℃脅迫48 h，不同抗性花生品種MDA 含量均增加且高于CK，且敏感型品種含量提高幅度大于耐低溫型品種?；謴?fù)常溫后，脅迫處理各品種MDA含量均低于CK，但隨著萌發(fā)時(shí)間的延長，耐低溫型品種豫花22號(hào)MDA 含量仍大幅增加，敏感型品種泉花6 號(hào)、魯花11號(hào)小幅下降，與CK含量變化差異較大。

圖1 低溫脅迫對(duì)不同品種膜透性的影響Fig.1 Effects of low temperature stress on membrane permeability of different varieties

2.3 不同溫度處理對(duì)花生種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖2A 所示，常溫處理?xiàng)l件下，不同抗性花生品種隨處理時(shí)間的延長可溶性糖含量逐漸降低。2℃脅迫48 h，各品種Ss含量均高于CK，由大到小依次為豫花22 號(hào)、漯花16 號(hào)、泉花6 號(hào)和魯花11 號(hào)；隨著脅迫時(shí)間的延長，耐低溫型和中間型品種Ss 含量呈先下降后上升的變化趨勢，敏感型品種Ss 含量一直下降。恢復(fù)常溫后，脅迫處理各品種Ss 累積量存在一定差異，耐低溫型品種豫花22號(hào)Ss含量仍保持著較高的水平。第7d 時(shí)，豫花22 號(hào)Ss 累積量高于其他3個(gè)品種。

由圖2B 得知，常溫處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間的延長，各品種可溶性蛋白（SP）含量整體呈緩慢下降的趨勢。低溫處理?xiàng)l件下，耐低溫型品種豫花22號(hào)以及中間型品種漯花16號(hào)SP含量逐漸下降，敏感型品種泉花6號(hào)、魯花11號(hào)呈先下降后上升的趨勢，脅迫結(jié)束時(shí)，不同抗性花生品種SP含量由小到大順序?yàn)樵セ?2號(hào)、漯花16號(hào)、魯花11號(hào)和泉花6號(hào)，且均低于CK?；謴?fù)期中，各品種SP含量均高于CK，SP含量在第3 d時(shí)達(dá)到峰值，后逐漸降低，至第7 d耐低溫型品種和中間型品種已恢復(fù)正常，SP 含量與對(duì)照基本一致，而敏感型品種SP含量則還顯著高于CK。

圖2 低溫脅迫對(duì)不同品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on the content of osmotic adjustment substances in different varieties

2.4 不同溫度處理對(duì)花生種子抗氧化酶活性的影響

如圖3A 所示，常溫處理?xiàng)l件下，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長，各品種超氧化物歧化酶（SOD）活性小幅度波動(dòng)，不同抗性品種未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。低溫脅迫期，各品種SOD 活性由高到低依次為豫花22 號(hào)＞漯花16 號(hào)＞泉花6 號(hào)＞魯花11 號(hào)；隨脅迫時(shí)間的延長，耐低溫型品種豫花22 號(hào)和中間型品種漯花16 號(hào)SOD 活性大于CK，呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢；敏感型品種泉花6 號(hào)、魯花11 號(hào)SOD 活性則一直上升且小于CK?；謴?fù)期后，耐低溫型品種豫花22 號(hào)SOD 仍保持著較高活性，中間型品種漯花16 號(hào)次之，敏感型品種泉花6號(hào)、魯花11號(hào)則活性較低。

由圖3B 可知，常溫和脅迫處理過程中，各品種過氧化物酶（POD）活性均呈逐漸上升趨勢。處理過后，CK處理各品種在第5 d時(shí)活性達(dá)到峰值；低溫處理各品種表現(xiàn)不一，第5～7 d，低溫處理各品種POD活性大小依次為豫花22 號(hào)、漯花16 號(hào)、泉花6 號(hào)和魯花11 號(hào)；其中耐低溫型品種豫花22 號(hào)變化趨勢與CK 一致，至第5 d，已恢復(fù)至與對(duì)照基本一致，而中間型和敏感型品種則不能恢復(fù)至正?；钚源笮?，且敏感型品種SOD 活性在恢復(fù)期也一直處于較低水平（圖3A）。

如圖3C 所示，常溫處理?xiàng)l件下，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，各品種過氧化氫酶（CAT）活性呈先下降后上升的趨勢。低溫脅迫過程中，各品種隨脅迫時(shí)間的延長CAT 活性均逐漸降低，但不同抗性品種下降幅度不同，耐低溫型品種豫花22號(hào)下降幅度最大為58.42%，中間型品種漯花16 號(hào)次之為57.92%，敏感型品種泉花6 號(hào)、魯花11 號(hào)分別為47.37%、50.81%?；謴?fù)期后，耐低溫型品種豫花22 號(hào)CAT活性仍保持著較高水平，而中間型和敏感型品種活性則較低，與CK差異也較大。

圖3 低溫脅迫對(duì)不同品種抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on antioxidant enzyme activities of different varieties

3 討論與結(jié)論

低溫是限制許多重要大田作物生產(chǎn)力和地理分布的主要因素之一，是影響作物種子萌發(fā)，生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要因素之一[27，28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫處理顯著降低了花生種子的露白率、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率，延長了萌發(fā)時(shí)間，相比中間型和敏感型品種，耐低溫型品種在低溫條件下具有較高的露白率、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率。說明篩選出耐低溫種質(zhì)，對(duì)低溫區(qū)花生生產(chǎn)和耐低溫新品種選育有較大意義。

電導(dǎo)率是衡量植物在逆境中細(xì)胞質(zhì)膜傷害的程度，在許多植物研究中被用作鑒定耐低溫能力的指標(biāo)之一[29,30]。本項(xiàng)研究中，2℃低溫脅迫24 h后，不同抗性花生品種電導(dǎo)率值由小到大順序?yàn)樵セ?2號(hào)、漯花16號(hào)、泉花6號(hào)和魯花11號(hào)，且耐低溫品種豫花22 號(hào)顯著低于其他3 個(gè)品種，花生品種的耐低溫性與電導(dǎo)率值的大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與張子戌等[31]研究結(jié)果一致。低溫脅迫過程中，花生種子內(nèi)丙二醛（MDA）含量隨處理時(shí)間延長逐漸增加，不同抗性品種MDA含量增加幅度不同，敏感型品種增加幅度更大，說明其細(xì)胞膜受傷害程度更高。恢復(fù)期中，各品種MDA 含量均低于CK，耐低溫型品種豫花22 號(hào)隨著萌發(fā)進(jìn)程MDA 含量仍大幅增加，中間型及敏感型品種增加幅度較小，說明低溫脅迫雖對(duì)各花生品種細(xì)胞膜均造成傷害，但不同抗性品種受傷害程度有所不同。

本研究可以看出，低溫處理?xiàng)l件下，可溶性糖（Ss）、可溶性蛋白（SP）的含量與植物的抗冷性密切相關(guān)，其含量增加可增強(qiáng)抗冷性。低溫處理后，Ss積累量增加，且越耐低溫品種Ss 累積量越高；SP 變化趨勢與Ss 存在一定差異,各花生品種萌發(fā)期遭遇低溫脅迫后，敏感型品種SP累積量高于耐低溫型品種。復(fù)溫后，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長，耐低溫型品種和中間型品種Ss積累量高于敏感型品種；各品種SP積累量均高于CK，且敏感型品種累積量更高。由此表明，各花生品種萌發(fā)期遭遇低溫脅迫后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)主動(dòng)積累更多可溶性物質(zhì)，以降低細(xì)胞滲透勢，增加細(xì)胞吸水能力，維持膨壓，從而避免原生質(zhì)在低溫逆境脅迫下受到脫水傷害[32]。

本研究結(jié)果表明，各花生品種萌發(fā)期遭遇低溫脅迫，隨著脅迫時(shí)間的延長，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性上升，過氧化氫酶（CAT）活性下降。其中SOD 以及CAT 活性變化幅度較大，POD 變化幅度較小，說明種子在萌發(fā)期遭遇低溫脅迫后，SOD 及CAT 可能發(fā)揮著更大的作用，即抗冷性越強(qiáng)的品種SOD 活性越高，郝晶等[33]、高利英等[4]的研究也得出這一結(jié)論?；謴?fù)期中，抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性表現(xiàn)出相同的趨勢，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長，抗冷性越強(qiáng)的花生品種其酶活性越高。由此表明，各花生品種萌發(fā)期遭遇低溫脅迫后，種子內(nèi)部會(huì)迅速啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)，通過SOD、POD、CAT 等抗氧化酶的協(xié)同作用來清除因低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧等物質(zhì)，抵御逆境傷害[34～37]，抗冷性越強(qiáng)的品種其酶活性越高。

本研究針對(duì)在花生萌發(fā)期突然遭遇的低溫冷害，以不同抗冷性花生品種在萌發(fā)期遭遇低溫脅迫以及脅迫后恢復(fù)常溫條件的種子萌發(fā)作為研究對(duì)象，測定種子內(nèi)部生理指標(biāo)的變化動(dòng)態(tài)，結(jié)果存在較大差異。這在一定程度上解釋了春播花生在萌發(fā)期突然遭遇短時(shí)間低溫逆境后種子萌發(fā)過程中主要的生理變化及內(nèi)部的聯(lián)系，試驗(yàn)結(jié)果為今后春播花生的抗冷栽培及耐低溫機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。