稻蝦共養(yǎng)病蝦腸道細菌群落變化與病原細菌分離及藥物敏感性

石曉媛 王麒 方明棵 王瑩 楊亞珍 朱建強

摘要：病害是影響稻蝦共養(yǎng)農(nóng)民經(jīng)濟收入的重要因素。為明確稻蝦共養(yǎng)發(fā)病塘口中致病菌的種類及其防治方法，以健康蝦和病蝦為研究材料，運用Illumina MiSeq全基因組測序技術(shù)，對健康蝦和病蝦腸道內(nèi)細菌的群落組成進行測定和分析，預(yù)估出病原菌的種類。在此基礎(chǔ)上，使用選擇性培養(yǎng)基對病蝦腸道內(nèi)疑似病原菌進行分離。將分離所獲疑似病原菌注射至健康蝦體腸道內(nèi)，并觀察蝦體死亡情況，最終確定所選病原菌菌株。通過顯微觀察、16S rDNA序列分析，最終確定該病原菌的分類地位。最后利用藥敏性試驗，篩選出對該病原菌有抑制效果的抗生素和中草藥種類。試驗結(jié)果表明，健康蝦與病原蝦腸道內(nèi)的細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異。在門水平上，健康蝦腸道內(nèi)細菌主要是柔壁菌門，其相對豐度為74.23%;而病蝦腸道內(nèi)細菌主要是變形菌門，其相對豐度為67.39%;在屬水平上，健康蝦腸道內(nèi)主要是柔膜菌屬，其相對豐度為48.30%;病蝦腸道內(nèi)主要是非保密氣單胞菌屬，其相對豐度為13.50%。分離結(jié)果顯示，所獲8株細菌均為革蘭氏陰性菌，在選擇性培養(yǎng)基上均呈黃色。病原菌回接感染結(jié)果表明，1.5×108 CFU/mL注射后1 d內(nèi)，致死率高達100%。分子學(xué)鑒定結(jié)果表明，該病原菌為哈夫尼菌屬蜂房哈夫尼菌。該菌對所選的卡那霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素這5種抗生素比較敏感;對黃芩、苦參、艾葉等3種中草藥水提物比較敏感。本研究可為稻蝦共養(yǎng)流行病的診斷及防治，以及小龍蝦的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦;病原微生物;分離鑒定;防治;藥物敏感性;蜂房哈夫尼菌

中圖分類號： S182;S945.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0169-07

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，原產(chǎn)于北美洲，1929年傳入我國，目前是我國主要經(jīng)濟蝦類之一，在淡水甲殼動物養(yǎng)殖中位居第一[1]。由于長期的高密度養(yǎng)殖，以及養(yǎng)殖過程中使用大量的肥料和人工飼料，導(dǎo)致克氏原螯蝦養(yǎng)殖環(huán)境日漸惡化，病害頻繁發(fā)生，嚴重影響了小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和農(nóng)戶的經(jīng)濟收入[2]。

克氏原螯蝦常見的病害有黑鰓病、爛尾病、纖毛蟲病、出血病等[3]。目前報道的病原菌主要有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[4]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[5] 、擬態(tài)弧菌（V. mimicus）[6]、螺原體（Spiroplasma）[7]、白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus）[8]、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）[2]、原螯蝦摩氏摩根菌（Morganella morganii）等[9]。雖然前人對克氏原螯蝦病原菌做過較多的研究，但不同養(yǎng)殖地區(qū)的氣候條件、養(yǎng)殖方式存在著差異，因而病原微生物種類應(yīng)有典型性。

克氏原螯蝦等甲殼類動物的腸道是儲存食物、消化和吸收營養(yǎng)的重要器官。腸道內(nèi)寄生著種類復(fù)雜、數(shù)量龐大的微生物類群。這些微生物對宿主的免疫、消化、吸收等多種生理活動起到了促進作用[10-11]。在健康條件下，腸道微生物類群之間處于平衡狀態(tài)，但在病害發(fā)生時，腸道內(nèi)微生物類群之間的平衡會被打破。因此，研究病害發(fā)生時，小龍蝦腸道微生物的群落組成變化對小龍蝦疾病的診斷和預(yù)防均具有重要意義。

本研究主要針對2020年湖北省荊州地區(qū)稻蝦共養(yǎng)塘口中存在的病害現(xiàn)象進行研究，以期明確病害發(fā)生的原因，找到致病根源微生物，并尋找防治該病原菌的有效措施。該研究可為稻蝦共養(yǎng)生產(chǎn)中病原菌的診斷及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病害和健康克氏原螯蝦體均采自湖北省公安縣沙場村稻蝦塘口。連翹、大蒜、黃柏、黃芩、陳皮、甘草、苦參、野菊花、當歸、紫蘇、蒲公英、丁香、秦皮、夏枯草、魚腥草、艾葉、石榴皮、虎杖等18味中草藥購自荊州市弘衛(wèi)大藥房。抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。細菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix購自生工生物工程（上海）有限公司。氣單胞菌培養(yǎng)基配方：蛋白胨5.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，L-賴氨酸鹽酸鹽3.50 g/L，L-精氨酸鹽酸鹽2.00 g/L，山梨醇3.00 g/L，肌醇2.50 g/L，乳糖1.50 g/L，木糖3.75 g/L，膽鹽3.00 g/L，硫代硫酸鈉10.67 g/L，氯化鈉5.00 g/L，檸檬酸鐵銨0.80 g/L，溴麝香草酚藍0.04 g/L，麝香草酚藍 0.04 g/L，瓊脂12.50 g/L，氣單胞菌培養(yǎng)基添加劑5.00 mL/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦體腸道DNA的提取與16S rDNA擴增

2020年5月16日，從湖北省公安縣沙場村健康稻蝦塘口和發(fā)病塘口中分別采集健康和發(fā)病克氏原螯蝦（以下簡稱為健康蝦、病蝦）各30尾，用75%乙醇擦拭蝦體表面，再用無菌生理鹽水沖洗2～3次，取其腸道物。使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取克氏原螯蝦后腸總DNA，通過Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。用無菌水將DNA稀釋至1 ng/μL用于 16S rDNA的擴增。使用16S V3～V4區(qū)引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）進行擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)。

1.2.2 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后制備文庫，測序使用IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序（single-end）的方法，構(gòu)建小片段文庫進行單端測序。通過對reads剪切過濾，將一致性（identity）大于97%的測序序列歸為1個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進行聚類和物種分析。利用豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)）以及多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）分析病蝦和健康蝦腸道內(nèi)微生物群落的豐度和多樣性。同時在門、綱、目、科、屬5個分類水平上統(tǒng)計每個樣品的物種群落結(jié)構(gòu)和豐度，根據(jù)分析結(jié)果，預(yù)判疑似病原菌的種類。

1.2.3 疑似病原菌的分離與純化

用無菌接種環(huán)挑取病蝦腸道物1環(huán)，接種到疑似病原菌（氣單胞菌）的選擇性培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)24 h后，從培養(yǎng)基上挑取單菌落，純化2～3次后放入 4 ℃ 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 回接感染試驗確定病原菌株

將所有分離菌株分別接種1環(huán)至150 mL氣單胞菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后，用無菌水將每1菌體的菌體濃度分別調(diào)至1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104 CFU/mL等5個濃度梯度。選取室內(nèi)養(yǎng)殖活力較好、無明顯外傷的健康克氏原螯蝦150尾（每尾質(zhì)量大約為12 g），隨機平均分為5組，在每尾克氏原螯蝦第2腹節(jié)處注射各濃度菌懸液100 μL，并以注射無菌生理鹽水100 μL作為對照組，對照同樣重復(fù)30尾。感染病原菌后的蝦體繼續(xù)飼養(yǎng)，記錄感染之后 7 d 內(nèi)各處理組蝦體的臨床癥狀和死亡率。

克氏原螯蝦室內(nèi)養(yǎng)殖條件：試驗于2020年6—9月在長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗樓內(nèi)進行。小龍蝦采用白色塑料盆養(yǎng)殖，盆內(nèi)徑長 125 cm、寬 75 cm、高37 cm。試驗用水為當?shù)氐疚r共養(yǎng)塘口水，每箱水深10 cm。每天投喂飼料2次（08：00、19：00），投餌量為蝦體質(zhì)量的3.5%。5 d為1個周期進行換水，溶解氧控制在5.5～5.7 mg/mL范圍內(nèi)，室溫保持在23～25 ℃，箱內(nèi)放置水草及覆蓋物。

1.2.5 病原菌菌株的革蘭氏染色及分子鑒定

將致死率高的濃度梯度菌種接種于氣單胞菌培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落的一小部分進行革蘭氏染色。

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明方法提取革蘭氏染色菌株的總DNA，以27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物進行PCR擴增，采用DNA純化回收試劑盒純化回收16S rDNA產(chǎn)物，然后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得16S rDNA序列在NCBI的GenBank和Blast中進行同源性比對分析，通過MEGA 7等軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[2]。

1.2.6 病原菌對抗生素藥物的敏感性試驗

采用紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。每種藥敏片直徑為6 mm，將1環(huán)病原菌接種至100 mL液體培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)24 h后，用移液槍吸取 100 μL 菌懸液至固體培養(yǎng)基上，并用無菌玻璃棒涂布均勻，然后將藥敏紙片均勻放置于平板上，每個處理放置3個重復(fù)，于培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)18 h后，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標準判定該菌對不同種類抗生素藥物的敏感性。

1.2.7 病原菌對中草藥水提物的敏感性試驗

分別稱取每種中草藥50 g，放入燒杯中，加入蒸餾水 1 000 mL，浸泡30 min，加熱至沸騰以后保持微沸狀態(tài)20 min，然后將其過濾至容器內(nèi)，濾液濃度調(diào)至 1 g/mL。 藥敏試驗采用瓊脂擴散法，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液稀釋至濃度為1×107 CFU/mL，用移液槍吸取100 μL菌懸液至固體培養(yǎng)基上，再用無菌刮鏟將菌液涂抹均勻，然后用打孔器（直徑為6 mm）在平板上均勻打3個孔，挑出孔內(nèi)瓊脂并用空白瓊脂封底，做好標記。在每孔內(nèi)加入100 μL藥液，放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用游標卡尺測定抑菌圈直徑。依據(jù)《中藥藥理學(xué)》中敏感性的判斷標準，抑菌圈直徑≥20 mm屬于極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm 之間為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，沒有抑菌圈為不敏，判定病原菌對各種中草藥水提物的敏感性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康蝦與病蝦腸道內(nèi)細菌多樣性差異

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了微生物的多樣性，而Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)反映了微生物的豐富度。從表1可知，健康蝦與病蝦相比，Simpson和Shannon指數(shù)差異并不顯著，但健康蝦的Chaol和ACE指數(shù)顯著高于病蝦。

2.2 健康蝦與病蝦腸道內(nèi)細菌群落結(jié)構(gòu)差異

在門水平上，健康蝦主要以柔壁菌門（Tenericutes）為主，相對豐度為74.23%;而病蝦主要以變形菌門（Proteobacteria）為主，相對豐度為67.39%（圖1）。在屬水平上，如圖2所示，柔膜菌綱的柔膜細菌（Unclassified Mollicutes）（48.3%）和RsaHF231（18.5%）為健康蝦腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，二者相對豐度共占細菌類群的66.8%;而病蝦腸道內(nèi)這2種菌體含量僅占細菌總量的12.7%。但病蝦中氣單胞菌目的氣單胞菌（Unclassified Aeromonadaceae）相對豐度較高，為13.5%，而在健康蝦中，這種菌幾乎沒有，因此初步推斷該菌為主要致病菌，并做進一步的分離。

2.3 疑似病原菌的分離

將病蝦腸道物接種于氣單胞菌選擇培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)24 h后，共獲得8株菌體（編號為N1～N8）。如表2所示，這8株菌體菌落均呈現(xiàn)黃色、圓形、表面光滑、邊緣平整、菌落突起的特征，革蘭氏染色為陰性，因此推斷這8株菌可能為同一菌種。

2.4 疑似病原菌的回接感染驗證

由于所分離的8株疑似病原菌，菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果相同，因此選擇N1菌株作為回接感染的出發(fā)菌株，以注射方式感染健康蝦，注射后蝦體出現(xiàn)不同程度的死亡，死亡率隨菌液濃度的增大而增加。高濃度試驗組（1.5×108 CFU/mL）在注射后1 d內(nèi)，小龍蝦發(fā)生急性死亡現(xiàn)象，死亡率高達100%。1.5×107 CFU/mL注射組在3 d內(nèi)死亡率達到90%，隨后的4 d未見蝦體死亡。1.5×106 CFU/mL 注射組感染5 d后，死亡率達56.67%，而1.5×105 CFU/mL和1.5×104 CFU/mL注射組死亡率較低。各處理組的小龍蝦發(fā)病癥狀均類似于分離前病蝦癥狀，表現(xiàn)為蝦體活力下降、攝食量降低、尾彈反應(yīng)減弱、應(yīng)激能力變差等。感染試驗中注射生理鹽水的對照組未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況（表3），表明分離的菌株N1為導(dǎo)致本次蝦體發(fā)病和死亡的致病菌之一。

2.5 病原菌N1菌株的分類地位確定

利用Blast工具將N1菌株所得16S rDNA序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知微生物的 16S rDNA 序列進行同源性比對后發(fā)現(xiàn)，該菌株16S rDNA序列與Gen Bank中的部分序列有較高的相似性（100%）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示菌株N1（以S00664X1表示）的16S rDNA基因與JX267126.1聚為同一分支，同源性為100%，根據(jù)江楓的研究可知，細菌的16S rDNA序列相似度大于98%，可將它們菌體認定為是相同的種[13]，因此該菌株被認定為蜂房哈夫尼菌（圖3）。

2.6 病原菌N1菌株對抗生素藥物的敏感性試驗結(jié)果

病原菌對所選11種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果表明，菌株N1對卡那霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等4種抗生素較為敏感，對氯霉素中介，對慶大霉素、新霉素、青霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素等6種藥物耐藥（表4）。

2.7 病原菌N1菌株對中藥水提物的敏感性試驗結(jié)果

瓊脂擴散法試驗結(jié)果表明，病原菌N1菌株對黃芩極度敏感，對苦參、艾葉高度敏感，對甘草中度敏感，對當歸低敏，對其他13種中藥水提液不敏感（表5）。

3 討論與結(jié)論

克氏原螯蝦因其營養(yǎng)豐富，商業(yè)價值高被廣泛養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖面積和密度的增加導(dǎo)致克氏原螯蝦疾病感染日益嚴重[14-15]。有關(guān)小龍蝦致病菌的報道也越來越多，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、擬態(tài)弧菌、弗氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌[16]。本試驗從病蝦腸道中分離出的主要病原菌為蜂房哈夫尼菌。蜂房哈夫尼菌是一種常見的革蘭氏陰性菌，該菌存在于蔬菜、植物以及哺乳動物的胃腸道環(huán)境中，可以直接引發(fā)感染或者在一些慢性病癥的條件下引起疾病發(fā)生[17]。王霞研究發(fā)現(xiàn)，蜂房哈夫尼菌可以引起人的化膿性腦膜炎[18]。趙淑芳等報道，蜂房哈夫尼菌能感染棘胸蛙致其產(chǎn)生嚴重的腹瀉和腹脹等腸道類疾病[19]。閆艷新等報道，蜂房哈夫尼菌能夠引起人類泌尿系統(tǒng)和呼吸道的感染，甚至?xí)饠⊙Y的發(fā)生[20]。蜂房哈夫尼菌還能引起錦鯽體表出現(xiàn)血點、腸道腫脹潰爛的癥狀，也會引起小白鼠身體抽搐、眼睛分泌黃色黏稠物，以及胃部脹氣、腸部腫脹等一系列的癥狀[21]。本研究發(fā)現(xiàn)蜂房哈夫尼菌能夠感染克氏原螯蝦，引起其活力下降、攝食量降低、尾彈反應(yīng)減弱、應(yīng)激能力變差，進而發(fā)生死亡。

測序結(jié)果表明，健康蝦與病蝦相比 Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)差異并不顯著;但健康蝦的Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于病蝦。表明病蝦和健康蝦腸道內(nèi)微生物類群相似度不高，差異明顯。健康蝦腸道細菌的優(yōu)勢類群是柔壁菌門，相對豐度為74.23%;病蝦腸道細菌類群主要為變形菌門，相對豐度為67.39%，其中γ-變形菌綱氣單胞菌和β-變形菌綱伯克霍爾德氏菌科非保密伯克霍爾德氏菌屬為優(yōu)勢菌群，該研究結(jié)果與郁維娜等的研究結(jié)果[22]不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)，病蝦和健康蝦腸道內(nèi)微生物多樣性差異不明顯，這與郁維娜等的研究結(jié)果[22]一致。但本研究發(fā)現(xiàn)病蝦腸道內(nèi)細菌類群主要為γ-變形菌綱和β-變形菌綱，而郁維娜等的研究認為，病蝦中主要是γ-變形菌綱。分析原因認為，本研究材料為淡水小龍蝦，而郁維娜等的研究對象為淡水凡納濱對蝦，凡納濱對蝦樣品采自寧波市瞻岐椿霖對蝦養(yǎng)殖場（29.53°N，121.5°E），另外養(yǎng)殖地區(qū)和養(yǎng)殖習(xí)慣與本研究中的也不盡相同。

施用抗菌藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細菌性疾病使用最多亦是最有效的方法，由于養(yǎng)殖戶缺乏流行病的診斷和防治技術(shù)，導(dǎo)致抗菌藥物種類使用不當，抗菌物質(zhì)濫用等現(xiàn)象較為普遍，造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌產(chǎn)生多重耐藥性，無法做到有針對性的科學(xué)用藥。另外，藥物會在水產(chǎn)動物體內(nèi)發(fā)生殘留影響人類的健康，破壞生態(tài)的平衡以及影響小龍蝦的健康養(yǎng)殖[23]。而許多中草藥中含有豐富的生物堿、皂莢、多糖、蒽醌類等免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以強化機體能力抵御病原體[24]。它們不僅具有天然、無毒副、無殘留等特點，還能補充機體營養(yǎng)，提高機體免疫力[25-26]，起到抗菌、抗病的作用，達到藥物性和營養(yǎng)性的兼并效果[27]，因此用中草藥來治療細菌性疾病逐漸受到人們的重視，同時也鼓勵采用抗生素中草藥聯(lián)合來抑制病原細菌的發(fā)生[28-29]。本試驗結(jié)果表明，該菌對黃芩、苦參、艾葉等中草藥比較敏感。另外，該菌對不同種類的抗菌藥物耐受性不同，該菌對喹諾酮類抗生素中的諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星高度敏感，對氨基糖苷類抗生素的卡那霉素比較敏感，對氯霉素類抗生素中的氯霉素有一定程度的抑制作用。

本試驗雖找到了病害發(fā)生的主要微生物根源，篩選出了幾種能有效防治該病原菌的抗生素和中草藥種類，可為病原菌的診斷及其防治提供一定幫助。但針對所選抗生素和中草藥聯(lián)合防治還未開展研究。另外，關(guān)于蜂房哈夫尼菌對克氏原螯蝦致病性相關(guān)的報道甚少，因此對于該病原菌的致病機制以及有效防治手段還需進一步研究闡明。

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