姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲的氧化應(yīng)激、凋亡誘導(dǎo)及線粒體損傷作用

葸靈娟, 張夢(mèng)玘, 林志康, 趙宇俠,*

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院, 上海 200120; 2. 上海健康醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院, 上海 201138)

姜黃素,是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的酚類化合物,被廣泛地用于調(diào)味劑、食品色素及治療炎癥的中草藥.現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)姜黃素具有多種生物活性作用,且價(jià)格低廉、廣泛易得,在臨床上有很好的應(yīng)用前景,如治療炎癥、改善阿爾茲海默癥、改善胰島素抵抗、改善糖尿病腎病的病情、靶向治療癌癥、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、治療泌尿系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝疾病、皮膚疾病等[1-8].然而,隨著姜黃素在食品中、日用化學(xué)品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,其毒性報(bào)道也日漸增多.姜黃素?cái)z入增多,或許對(duì)正常組織細(xì)胞亦有毒性作用,有些或許有可能引起繼發(fā)腫瘤、肝、腎毒性及骨髓抑制、消化道反應(yīng)等不良反應(yīng).

圖 1 姜黃素結(jié)構(gòu)式

近年來,體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)許多腫瘤細(xì)胞株均有明顯的毒性作用,且一般的作用濃度范圍在10～100 μmol/L.同時(shí),也已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)CHO細(xì)胞株、人外周血淋巴細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞(GMC)等正常細(xì)胞也產(chǎn)生一定的毒性作用[9].并且在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中姜黃素毒性已被廣泛證實(shí),包括高劑量姜黃素可以誘發(fā)雌性大鼠、雌雄小鼠致癌[10],姜黃素劑量≥20 mg/kg可導(dǎo)致狗劑量依賴性溶血[11],SD大鼠和Beagle犬經(jīng)單次、多次給予姜黃素,可對(duì)脾、肝、腎產(chǎn)生一定的毒性作用[12],小鼠NOEL劑量(320 mg/kg bw)20倍姜黃素灌喂奧尼羅非魚,可增強(qiáng)奧尼羅非魚血清中SOD活性和前期CAT活性,顯著抑制T-AOC和后期CAT活性,對(duì)奧尼羅非魚產(chǎn)生一定的毒性[13].小鼠經(jīng)口急性毒性姜黃乙醇提取物(ETE),改變小鼠心、肺等臟器重量,降低血中RBC、WBC水平[14]等.大量的研究表明,姜黃素的過量使用可能引起動(dòng)物體內(nèi)組織、臟器的改變及體外細(xì)胞的毒性,并且體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)也探究了其姜黃素毒性的相關(guān)機(jī)制.

以各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞為模型研究姜黃素毒性,評(píng)價(jià)人體健康風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道已經(jīng)有一些確定的結(jié)論,研究發(fā)現(xiàn):姜黃素可通過抑制NF-κB而影響細(xì)胞信號(hào)通路途徑,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖,細(xì)胞在低鈣濃度下,姜黃素可以提高生物體線粒體膜通透性,出現(xiàn)膜電位缺失、線粒體腫脹等,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15].所以姜黃素有可能通過產(chǎn)生過量的活性氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激來影響嗜熱四膜蟲細(xì)胞的增殖、線粒體膜電位的變化,改變細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生微量毒性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.姜黃素用藥安全性及毒性問題值得高度關(guān)注.

姜黃素及相關(guān)產(chǎn)品的大量開發(fā),其最終排放水體也引起生態(tài)系統(tǒng)的安全隱患,以水生生物為模式生物的關(guān)于姜黃素的報(bào)道還很少,嗜熱四膜蟲是重要的單細(xì)胞真核模式生物,隸屬于原生動(dòng)物纖毛門,廣泛分布于世界淡水環(huán)境中.嗜熱四膜蟲對(duì)環(huán)境變化靈敏度高,是進(jìn)行藥物、有機(jī)物、無機(jī)物、水污染物毒理學(xué)評(píng)價(jià)的一個(gè)方便模型[16].嗜熱四膜蟲包含了許多在一些真核生物(包括人類)中保存的基因,不同于其他廣泛使用的單細(xì)胞模型生物.例如,超過800個(gè)人類基因在四膜蟲中有同源基因,但在釀酒酵母中沒有,其中58個(gè)基因與人類疾病有關(guān)[17].在本研究中,嗜熱四膜蟲既可以作為單細(xì)胞生物擔(dān)當(dāng)姜黃素的藥理學(xué)研究,也可以作為水生模式生物評(píng)價(jià)姜黃素的生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn).

本研究擬利用不同濃度姜黃素作用于嗜熱四膜蟲細(xì)胞建立細(xì)胞毒性模型,探究姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞的毒性作用及相關(guān)機(jī)制,為姜黃素臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù).考察其對(duì)嗜熱四膜蟲的形態(tài)變化及細(xì)胞數(shù)量的生長的影響,并進(jìn)行對(duì)活性氧(ROS)的測(cè)定、乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定和線粒體膜電位(JC-1)的測(cè)定,最后觀察到細(xì)胞凋亡的情況來檢測(cè)姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞的毒性,為理解姜黃素的毒性活性成分及其作用機(jī)制提供線索.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞嗜熱四膜蟲SB210株系,來源于中科院水生生物研究所繆偉實(shí)驗(yàn)室組饋贈(zèng),由本實(shí)驗(yàn)室保種培養(yǎng).

1.2 試劑與儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋(申安LDZX-50KBS),電子天平(PL602-L北京賽多利斯天平有限公司),超凈臺(tái)(Haier HCB-900V),恒溫振蕩培養(yǎng)箱(一恒BPN-190CH),高速離心機(jī)(Eppendorf H1650-W德國),快速細(xì)胞分析儀(Multisizer 4eBeckman),光學(xué)顯微鏡(Leica),熒光酶標(biāo)儀(SpectraMax?iD5),流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Allegra 64R).

姜黃素購自上海源葉生物科技有限公司(貨號(hào):B20614,相對(duì)分子質(zhì)量:368.38),蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖均購自碧云天生物技術(shù)研究所;NaOH購自國藥集團(tuán).二甲基亞砜、乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)、線粒體膜電位試劑盒(JC-1)、活性氧試劑盒(ROS)均來自碧云天生物技術(shù)研究所,Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國BD公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL于離心管中,7 000 g離心5 min去除上清,用4 ℃預(yù)冷的1×PBS洗3次,最后加入100 μL的1×PBS懸浮細(xì)胞,取10 μL的細(xì)胞懸浮液滴到載玻片上,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定,蓋上載玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.3.2快速細(xì)胞分析儀檢測(cè)姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞密度的變化 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃,150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL細(xì)胞液體系加入到粒度儀儀器上的杯中稀釋檢測(cè)嗜熱四膜蟲數(shù)量的變化.每次吸10 mL,檢測(cè)3次,然后計(jì)算1 mL體系中四膜蟲的數(shù)量計(jì)算總得母液體系中的四膜蟲數(shù)量.本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[18].

1.3.3熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)嗜熱四膜蟲細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,將細(xì)胞懸浮離心,裝載探針液(1∶1 000)避光孵育搖晃20 min,1×PBS洗3次,熒光酶標(biāo)儀定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長488 nm,525 nm發(fā)射波長,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.4乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測(cè) 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,測(cè)定前1 h給樣品最大酶活性孔加入LDH釋放劑,加入量為原培養(yǎng)液體積的10%,反復(fù)吹打幾次混勻,然后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育.達(dá)到預(yù)定時(shí)間后,分別各組吸取1 mL于離心管中及無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔,400 g離心5 min,取上清,分別取每管上清液120 μL加入96孔板,隨即樣品測(cè)定,每孔分別加入60 μL LDH檢測(cè)工作液,混勻,室溫避光孵育30 min,然后在490 nm處檢測(cè)吸光度.令RLDH為LDH釋放率,A0為樣品對(duì)照孔的吸光度，A1為處理樣品的吸光度，A2為細(xì)胞最大酶活性的吸光度，則

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.5細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的測(cè)定 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,每組吸取1 mL細(xì)胞液于離心管中,將細(xì)胞液7 000 g離心5 min,棄掉上清液,加入提前配好的JC-1工作液,避光孵育搖晃20 min,離心棄上清,用1×的JC-1染色緩沖液洗滌2次,600 g,4 ℃離心4 min,再加入1倍的JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞.流式細(xì)胞儀和熒光分光光度計(jì)定量觀察熒光強(qiáng)度的變化.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.6Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將生長至對(duì)數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲細(xì)胞接種于15 mL培養(yǎng)瓶中26 ℃、150 rpm條件下于恒溫?fù)u床無菌培養(yǎng)液過夜后,將不同質(zhì)量濃度的姜黃素分別加入15 mL錐形瓶中(終質(zhì)量濃度:0、0.625、1.25、2.5 μg/mL)刺激2 h,離心5 min、2 000 rmp,用4 ℃的1×PBS洗滌3次,離心5 min,加入300 μL的Binding buffer懸浮細(xì)胞,在加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后避光室溫孵育15 min,上流式儀器之前5 min加入PI染料,置于冰上操作,再補(bǔ)加300 μL Binding buffer,檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖變化的影響與空白對(duì)照組相比,姜黃素處理組的嗜熱四膜蟲的細(xì)胞數(shù)量依次降低并且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng),濃度越大,姜黃素的毒性越大,抑制嗜熱四膜蟲細(xì)胞數(shù)量的變化生長.處理組(0.625、1.25、2.5 μg/mL)分別抑制了16%、32%、37%(P<0.001).說明姜黃素有明顯的抑制嗜熱四膜蟲增殖的效應(yīng)(如圖2).

圖2 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖變化的影響

2.2 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞形態(tài)的影響與空白對(duì)照組相比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)細(xì)胞形態(tài)基本無明顯現(xiàn)象,姜黃素(2.5 μg/mL)處理組細(xì)胞數(shù)量明顯變少,細(xì)胞形態(tài)由橢圓變?yōu)閳A形,逐漸變小皺縮,里面的細(xì)胞出現(xiàn)空囊泡的形態(tài),如圖3中箭頭所指.

圖 3 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲形態(tài)學(xué)影響(光學(xué)顯微鏡×100)

2.3 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞活性氧的影響與空白對(duì)照組相比,姜黃素處理后的嗜熱四膜蟲細(xì)胞2 h后,姜黃素處理組(0.625 μg/mL)不能夠引起嗜熱四膜蟲細(xì)胞內(nèi)的ROS增加(P>0.05),在姜黃素處理組(1.25、2.5 μg/mL)條件下隨著濃度的增加嗜熱四膜蟲細(xì)胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度增大,分別增加了35%、44%(P<0.05).說明ROS的生成量增加(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果表明高濃度條件下姜黃素能夠促進(jìn)ROS的產(chǎn)生(圖4).

圖 4 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞ROS的影響

2.4 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞LDH釋放的影響與空白對(duì)照組相比,姜黃素(0.625、1.25、2.5 μg/mL)處理組隨著藥物質(zhì)量濃度的增大,釋放在培養(yǎng)液里的乳酸脫氫酶(LDH)逐漸增多,呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng).從數(shù)據(jù)可以看出低濃度的姜黃素藥物組(0.625 μg/mL)和空白對(duì)照組相比釋放的低于姜黃素處理組(1.25、2.5 μg/mL),而質(zhì)量濃度最大姜黃素處理組(2.5 μg/mL)釋放的最多,說明姜黃素破壞了嗜熱四膜蟲細(xì)胞膜提高了膜通透性,使得細(xì)胞內(nèi)部的乳酸脫氫酶(LDH)釋放到了細(xì)胞培養(yǎng)液中.在這3個(gè)質(zhì)量濃度的條件下,姜黃素能夠影響嗜熱四膜蟲的細(xì)胞膜影響嗜熱四膜蟲細(xì)胞的生長,三者與對(duì)照組相比增加了10%、17%、45%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5).

注:與空白對(duì)照組相比,*P<0.05與空白對(duì)照組相比,**P<0.01;***P<0.001

2.5 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞線粒體膜電位的影響熒光分光光度計(jì)結(jié)果分析,JC-1聚合物最大發(fā)射波長為595 nm,在這個(gè)條件下,嗜熱四膜蟲體內(nèi)的線粒體膜電位處于高電位,產(chǎn)生的紅色熒光強(qiáng)度強(qiáng),隨著姜黃素的濃度增大,紅色熒光強(qiáng)度逐漸降低,姜黃素處理組(2.5 μg/mL)的紅色熒光強(qiáng)度最弱,說明姜黃素的作用能夠影響嗜熱四膜蟲線粒體膜電位去極化.結(jié)合流式細(xì)胞儀對(duì)紅綠色熒光光強(qiáng)度的比值結(jié)果分析,在姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)的條件下嗜熱四膜蟲能夠保持線粒體膜電位的穩(wěn)定變化,不破壞線粒體膜電位的動(dòng)態(tài)平衡.

流式細(xì)胞儀分析,與空白對(duì)照組對(duì)比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)在2 h這個(gè)時(shí)間段內(nèi)不能夠引起嗜熱四膜蟲細(xì)胞的線粒體膜電位發(fā)生去極化(P>0.05),而姜黃素處理組(2.5 μg/mL)這個(gè)質(zhì)量濃度條件下才能引起線粒體膜電位發(fā)生去極化,引起線粒體膜電位的降低(P<0.05),產(chǎn)生了輕微的毒性作用,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖6).

注:與空白對(duì)照組相比,*P<0.05

2.6 姜黃素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞分析,由于PI和FITC在488 nm激發(fā)光的激發(fā)下可以發(fā)出橙色和綠色熒光,儀器收集熒光信號(hào)并進(jìn)行分析,熒光強(qiáng)弱就代表熒光染料標(biāo)記的多少.Annexin-V與PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖7所示.

注:與空白對(duì)照組相比,**P<0.01,***P<0.001

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,在與對(duì)照組相比,姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)在2 h這個(gè)時(shí)間段內(nèi)不能引起嗜熱四膜蟲細(xì)胞產(chǎn)生凋亡(P>0.05),FITC-Annexin-V與PS結(jié)合能力弱,而在這兩個(gè)質(zhì)量濃度的條件下不能使細(xì)胞膜外翻,在這2個(gè)濃度的處理?xiàng)l件下PI的熒光強(qiáng)度比較弱,而姜黃素處理組(2.5 μg/mL)這個(gè)濃度條件下能夠引起嗜熱四膜蟲細(xì)胞的凋亡,凋亡率7.42%(P<0.001),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)合圖7分析,與對(duì)照組相比,細(xì)胞膜被破壞,發(fā)生外翻,使得FITC-Annexin-V與PS結(jié)合,PI因與DNA結(jié)合量比較少,熒光強(qiáng)度弱,所以姜黃素(2.5 μg/mL)在這個(gè)條件下對(duì)嗜熱四膜蟲產(chǎn)生了毒性作用.

3 討論

在我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥文化中,姜黃素常被用于驅(qū)蚊蟲、祛風(fēng)活血、行氣活血、通經(jīng)止痛等,具有良好的醫(yī)療保健效果.姜黃素因深厚的藥用價(jià)值與生物活性而備受關(guān)注,但姜黃素尚未被批準(zhǔn)用作藥物.關(guān)于姜黃素的臨床使用的安全性以及其潛在的毒性還需要更深入廣泛的研究支持,同時(shí)姜黃素的大量生產(chǎn)使用也帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),其對(duì)于水生生態(tài)的擾動(dòng)和毒性也值得關(guān)注.本研究以嗜熱四膜蟲為模式生物,研究姜黃素的藥物毒性作用豐富其臨床應(yīng)用的安全性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù),同時(shí)嗜熱四膜蟲作為水生模式生物,其毒性效應(yīng)也能為姜黃素可能的水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù).

本研究選定質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5 μg/mL的姜黃素在急性毒性實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)出計(jì)量依賴效應(yīng),2.5 μg/mL的姜黃素導(dǎo)致四膜蟲細(xì)胞數(shù)量生長抑制率達(dá)到37%.這與以往研究的姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、293細(xì)胞和SK-MEL-20細(xì)胞的生長具有抑制作用,抑制率隨姜黃素濃度的增加而增大,呈明顯的量效關(guān)系,生長受到抑制對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性的結(jié)果相似[9,19],雌性Swiss小鼠和Wistar大鼠分別進(jìn)行體內(nèi)研究姜黃素的毒性,發(fā)現(xiàn)高劑量(質(zhì)量濃度5%)的小鼠和大鼠均出現(xiàn)明顯的體重增長減緩,相對(duì)或絕對(duì)的肝重量改變和肝臟毒性如局部壞死(或伴再生的);而在低劑量(質(zhì)量濃度0.2%或1%)14 d組中僅小鼠出現(xiàn)了肝臟毒性[20].體外細(xì)胞還研究發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅顯著增加阿霉素、博萊霉素等抗癌藥物和Y射線誘導(dǎo)體外中國地鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)染色體畸變的發(fā)生率,而且單獨(dú)的姜黃素15 mg/mL也能引起CHO細(xì)胞染色體畸變[21].實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明姜黃素的使用過程中在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞具有毒性作用.有研究說姜黃素可誘導(dǎo)DNA損傷,可使細(xì)胞周期時(shí)相改變,影響細(xì)胞的增殖,可能也是本研究中影響細(xì)胞增殖的機(jī)制[22].

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失衡,引起細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷作用的過程.關(guān)于姜黃素的氧化應(yīng)激的報(bào)道中,姜黃素在氧化性損傷過程中可能起雙重作用,抗氧化作用可能與氧化應(yīng)激損傷作用并行[23].抗氧化作用一直是姜黃素被廣泛報(bào)道的保健作用.大量研究表明,姜黃素能清除超氧離子及氫氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明姜黃素通過抑制ROS的生成而減輕苯并毗或過氧化氫引起的損傷;另一方面,姜黃素的毒性研究中又有很多關(guān)于其氧化應(yīng)激的報(bào)道,姜黃素能使人胃黏膜細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞ROS水平升高,進(jìn)而造成DNA損傷[9,24].

本研究中ROS的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),姜黃素在(1.25、2.5 μg/mL)的條件下,能夠促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,而超過一定量的ROS會(huì)進(jìn)一步與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變.通過測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，增加細(xì)胞膜通透性.說明在本研究的濃度范圍內(nèi)姜黃素能夠通過氧化應(yīng)激破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),同時(shí)形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn),姜黃素處理組(2.5 μg/mL)嗜熱四膜蟲的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化,細(xì)胞膜是完整的,但是里面出現(xiàn)了空囊泡的的現(xiàn)象.

研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切,氧化損傷被證實(shí)是細(xì)胞凋亡的誘因之一.細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一系列內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡過程,是多細(xì)胞有機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細(xì)胞衰老、調(diào)控機(jī)體發(fā)育的重要機(jī)制[25].線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一,細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量ROS,線粒體既是ROS的主要來源,也是ROS氧化損傷的主要靶位,過量ROS導(dǎo)致線粒體分裂融合障礙,而損傷的線粒體可以通過產(chǎn)生過量ROS產(chǎn)生細(xì)胞毒性[26].線粒體作為細(xì)胞中特殊的結(jié)構(gòu),是多種環(huán)境毒物作用的敏感靶點(diǎn),線粒體功能障礙可導(dǎo)致一系列疾病,如缺血再灌注損傷、敗血癥和諸多糖尿病并發(fā)癥等[27].

凋亡與線粒體及ROS之間的機(jī)制很復(fù)雜,本課題只是簡(jiǎn)單初步的研究發(fā)現(xiàn),在2.5 μg/mL下姜黃素能夠引起線粒體膜電位的降低同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,研究結(jié)果中出現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象,低質(zhì)量濃度的姜黃素處理組(0.625、1.25 μg/mL)沒有誘導(dǎo)上述現(xiàn)象,而線粒體又是細(xì)胞凋亡的通路之一,所以推測(cè)凋亡很有可能是通過線粒體途徑來起作用,低濃度水平的氧化應(yīng)激壓力細(xì)胞能夠自我修復(fù)平衡,在較高濃度下才會(huì)發(fā)生線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.

綜上所述,姜黃素存在一定的毒性,毒性體現(xiàn)在:嗜熱四膜蟲細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞膜的破壞、線粒體膜電位的影響、凋亡的誘導(dǎo),但是這個(gè)現(xiàn)象存在濃度效應(yīng),不同的濃度體現(xiàn)的損傷范圍和效應(yīng)不同,對(duì)不同的細(xì)胞器有不同的效果,所以在使用姜黃素的使用過程中要注意姜黃素的使用濃度范圍,低濃度的姜黃素沒有表現(xiàn)出明顯的毒性,但是也會(huì)有一定量的誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,所以低濃度的姜黃素沒有產(chǎn)生表觀毒性,但是長期的累積效應(yīng)會(huì)不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性,會(huì)不會(huì)對(duì)生態(tài)產(chǎn)生破壞,需要進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證.本研究初步闡明了姜黃素的毒性作用及機(jī)制,說明姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)存在毒性效應(yīng),為姜黃素的臨床用藥及安全合理應(yīng)用提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).更為精確完整的毒性機(jī)制尚需大量的研究繼續(xù)驗(yàn)證.