甘露寡糖對飼喂蕎麥秸稈飼糧灘羊瘤胃真菌菌群的影響

馬秀花 溫紅瑞 馬步倉 楊萬宗 周玉香

(寧夏大學農學院，銀川 750021)

反芻動物瘤胃中真菌雖占比少，但其對飼糧中粗飼料的降解作用卻至關重要，其主要是利用特有的假根系統(tǒng)附著于粗飼料的木質化組織，通過分泌大量纖維素酶、木質素酶和其他水解酶裂解植物木質化組織，以促進其他瘤胃微生物對粗飼料的附著和降解[1]。有研究證實，在無瘤胃細菌存在的條件下，瘤胃真菌能降解粗纖維飼料中干物質的62%[2]。也有研究顯示去除真菌后的瘤胃液可在不影響動物采食量、原蟲和細菌的種類和數量的情況下減慢高纖維飼糧干物質、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的降解速率，而在補充真菌后，這些物質的降解速率又有所上升[3-4]。蕎麥秸稈由于纖維含量高、適口性差、消化吸收率低等特性，直接飼喂不能有效提高動物的生長性能，導致養(yǎng)殖效益低。因此，在無抗背景下開發(fā)蕎麥秸稈高效飼用技術對于畜牧業(yè)有積極影響。甘露寡糖(MOS)為一種新型飼料添加劑，主要通過富含MOS的酵母細胞壁發(fā)酵獲得，具有促進有益菌增殖、吸附病原菌、改善腸道微生態(tài)、提高動物抵抗力等功能。相比抗生素而言，MOS具有無污染、無殘留及無其他副作用等優(yōu)點。本團隊前期研究顯示，在蕎麥秸稈飼糧中添加不同水平MOS對灘羊瘤胃液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度無顯著影響，灘羊瘤胃液pH和NH3-N濃度均在正常變化范圍內，并均可保證灘羊瘤胃內環(huán)境正常，添加2%MOS可增加擬桿菌門、厚壁菌門等瘤胃降解菌群的數量，從而加強灘羊對飼糧中纖維物質的降解功能[5]。本研究在上述結果的基礎上，結合內部轉錄間隔區(qū)(ITS)測序分析技術，探究不同比例MOS在蕎麥秸稈飼糧條件下對灘羊瘤胃真菌菌群結構的影響，從而進一步揭示灘羊瘤胃真菌菌群對纖維物質降解能力。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧組成

本試驗于2019年5—9月在寧夏農墾賀蘭山牛羊產業(yè)(集團)有限公司開展，試驗開始前做好羊舍清潔、消毒等防疫工作。選擇健康無病、體重在30.5 kg左右的寧夏斷奶灘羊羯羊20只，隨機分成4組，每組5只，獨籠飼養(yǎng)?；A飼糧配制參考《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)，飼糧精粗比為30∶70，蕎麥秸稈(0.1%纖維素酶、1.0%麩皮與粉碎后的蕎麥秸稈混合均勻密閉發(fā)酵30 d后使用)與全株玉米青貯以40∶60均勻混合后作為粗飼料?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。CK-3組(對照組)飼喂基礎飼糧，Y1-3、Y2-3和Y3-3組在基礎飼糧基礎上分別添加1%、2%和3%的MOS(MOS由湖南某公司提供，純度>99%，為保證全部被采食，將MOS均勻添加在精料中)。預試期15 d，正試期60 d。每天于07：30和17：30分別飼喂1次，先粗后精，自由飲水。

表1 基礎飼糧組成與營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.2 采集瘤胃液及ITS測序分析

從瘤胃液樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增ITS rDNA的ITS2區(qū)。引物序列為：ITS3_KYO2，5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。切膠回收PCR擴增產物，使用QuantiFluorTM熒光計進行定量測定，制備文庫后進行Illumina HiSeq2500模式PE250測序。測序得到raw reads之后，對低質量reads進行過濾，然后進行組裝和過濾，以保證利用最有效數據聚類成操作分類單元(OTU)。

1.3 數據整理分析

用Excel 2010對試驗數據進行簡單處理，并在SAS 8.2軟件上進行分析，數據用“平均值±標準差“表示。

2 結果與分析

2.1 測序結果分析

2.1.1 OTU數分析

由圖1可知，12個樣本共產生1 144個OTU。CK-3組有274個OTU，Y1-3組有226個OTU，Y2-3組有303個OTU，Y3-3組有341個OTU。4組共享83個OTU。Y1-3組OTU數相對CK-3組有所減少，而Y2-3組、Y3-3組OTU數相對CK-3組有所增加，且以Y3-3組最多。上述結果說明飼糧中添加MOS會影響灘羊瘤胃真菌總數且在本試驗條件下添加3%MOS相對其他添加水平最有益。

CK-3：CK-3組 CK-3 group；Y1-3：Y1-3組 Y1-3 group；Y2-3：Y2-3組 Y2-3 group；Y3-3：Y3-3組 Y3-3 group。下圖同 the same as below。

2.1.2 樣本稀釋曲線

Shannon指數可反映所測樣品中微生物的多樣性。圖2為灘羊瘤胃真菌Shannon稀釋曲線，當測序量達到40 000 reads時Shannon稀釋曲線已基本保持穩(wěn)定，說明測序深度已覆蓋了樣本中大部分真菌種類。圖3為灘羊瘤胃真菌覆蓋度曲線，當測序量達到40 000 reads時，覆蓋度已超過0.99，說明本試驗中測序量及測序深度合理，當前的測序量足夠進行真菌菌群多樣性分析。

圖2 灘羊瘤胃真菌Shannon稀釋曲線

圖3 灘羊瘤胃真菌覆蓋度曲線

2.2 Alpha多樣性分析

Chao1指數、Ace指數反映物種的豐度，Shannon指數、Simpson指數反映物種的多樣性。由表2可知，Y2-3組、Y3-3組Chao1指數、Ace指數顯著大于Y1-3組、CK-3組(P<0.05)；4組間Simpson指數、Shannon指數差異顯著(P<0.05)，3個試驗組均高于CK-3組且以Y3-3組最高?？傮w而言，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的菌群豐度及多樣性較CK-3組明顯提高且Y3-3組影響最大。上述結果說明，本試驗條件下，飼糧中添加MOS可明顯提高灘羊瘤胃真菌菌群的數量，而3%對于增加瘤胃真菌菌群豐度及多樣性為最優(yōu)添加比例。

表2 Alpha多樣性指數

2.3 Beta多樣性分析

2.3.1 UPGMA聚類分析

6.酒店加強自身的人員管理。酒店應注意實習學生的薪資安排，對于滿足崗位要求的學生給予標準的績效工資，使實習學生感受到酒店的公平對待；注意人際環(huán)境的管理，提高實習生的工作積極性，滿足實習生的心理歸屬感；重視入職培訓，以便于實習生更好地適應崗位的需求與工作環(huán)境，更快的轉換自身角色，成為酒店的工作人員[3]。

在研究微生物分類問題中，根據各樣本豐度差異的統(tǒng)計結果，UPGMA分類樹可對所測樣本進行聚類分析。利用Mothur軟件，樣本中物種組成越相似的樣本越靠近且有越短的共同分支。

由圖4可知，與CK-3組瘤胃真菌菌群組成相比，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組瘤胃真菌菌群組成靠近，說明添加MOS可改變?yōu)┭蛄鑫刚婢何锓N組成，其中3%MOS對其影響最大。

CK-3-1、CK-3-2、CK-3-3為CK-3組的3個樣本，Y1-3-1、Y1-3-2、Y1-3-3為Y1-3組的3個樣本，Y2-3-1、Y2-3-2、Y2-3-3為Y2-3組的3個樣本，Y3-3-1、Y3-3-2、Y3-3-3為Y3-3組的3個樣本。圖5同。

2.3.2 主坐標分析(PCoA)

PCoA通過降維方式將復雜樣本簡化分析主要樣本距離，可直觀地觀察到個體或者群體之間的差異，樣本間的距離可反映其物種組成差異的大小，距離越短，差異越小。圖5為基于Unweighted Unifrac距離的PCoA，圖中PCo1為第1主成分，表示分離樣品20.63%的方差；PCo2為第2主成分，表示分離樣品12.70%的方差。與CK-3組相比，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組間距離更近，其中Y1-3組、Y3-3組相比Y2-3組真菌菌群相似性更高，說明添加MOS可影響瘤胃真菌菌群組成。

圖5 基于Unweighted Unifrac距離的主坐標分析

2.4 灘羊瘤胃真菌菌群結構差異分析

2.4.1 MOS對灘羊瘤胃真菌菌群在門水平上相對豐度的影響

將試驗得到的有效序列在不同分類水平上進行物種注釋及組間秩和檢驗統(tǒng)計分析。如圖6、表3所示，在門水平上共注釋得到12個菌門，相對豐度都在1%以上。子囊菌門(Ascomycota)、黃藻門(Anthophyta)、擔子菌門(Basidiomycota)為4組共有的優(yōu)勢菌門，且上述菌門的相對豐度4組間無顯著差異(P>0.05)，但在數值上Y1-3組子囊菌門、黃藻門的相對豐度較其他組稍高，CK-3組擔子菌門的相對豐度較其他組高。Y3-3綠藻門(Chlorophyta)的相對豐度較其他組高，但4組間無顯著差異(P>0.05)。Y1-3組未分類菌門的相對豐度顯著高于Y2-3組(P>0.05)。

表3 門水平相對豐度

圖6 門水平物種注釋

2.4.2 MOS對灘羊瘤胃真菌菌群在屬水平上相對豐度的影響

結合圖7和表4可知，在屬水平上，有11種相對豐度較高的真菌菌屬，Y1-3組曲霉屬(Aspergillus)的相對豐度顯著高于其他3組(P<0.05)；Y3-3組未分類菌屬的相對豐度顯著高于Y1-3組、Y2-3組(P<0.05)；其余菌屬的相對豐度4組間均差異不顯著(P>0.05)。在數值上，CK-3組蟲草屬(Cordyceps)、紅菇屬(Russula)、念珠菌屬(Candida)、柯達酵母屬(Kodamaea)的相對豐度較其他組稍高，Y1-3組Populus的相對豐度較其他組略高，Y2-3組軟棗獼猴桃屬(Actinidia)、青霉菌屬(Penicillium)、Brassica的相對豐度較其他組稍高，Y3-3組圓孢霉屬(Staphylotrichum)的相對豐度較其他組高。

表4 屬水平相對豐度

圖7 屬水平物種注釋

2.4.3 灘羊瘤胃真菌菌群功能預測

采用FUNGuild預測飼糧中添加不同水平MOS的各組灘羊瘤胃真菌菌群的營養(yǎng)型，結果見圖8和表5。圖8顯示各組灘羊瘤胃真菌菌群可鑒定為病原-腐生-共生營養(yǎng)型(0～0.01%)、腐生-病原-共生營養(yǎng)型(0.04%～6.10%)、腐生-共生營養(yǎng)型(0.10%～2.25%)、病原營養(yǎng)型(1.02%～5.62%)、病原-腐生營養(yǎng)型(1.38%～4.94%)、腐生營養(yǎng)型(30.10%～47.69%)、病原-共生營養(yǎng)型(10.15%～23.19%)、共生營養(yǎng)型(1.44%～6.43%)及未分類營養(yǎng)型(30.65%～42.63%)，腐生營養(yǎng)型為主要營養(yǎng)類型。由表5可知，Y1-3組病原營養(yǎng)型、腐生-病原-共生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型的豐度相對于其他組最少，其中腐生-病原-共生營養(yǎng)型的豐度顯著低于Y2-3組(P<0.05)，而腐生營養(yǎng)型較其他組最多；Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組共生營養(yǎng)型、病原-共生營養(yǎng)型的豐度相對于CK-3組有所減少；Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組腐生-共生營養(yǎng)型的豐度相對于CK-3組有所增加，其中Y2-3組與CK-3組的差異達到顯著水平(P<0.05)。

圖8 功能豐度熱圖

表5 功能豐度水平

3 討 論

3.1 MOS對灘羊瘤胃真菌菌群多樣性的影響

本研究結果顯示Y3-3組OTU數最多，總體測序量及測序深度合理。對于Alpha多樣性分析，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的真菌菌群豐度及多樣性較CK-3組明顯提高且Y3-3組影響最大，說明本試驗條件下添加MOS可提高灘羊瘤胃真菌菌群的多樣性，其中3%MOS對于增加瘤胃真菌菌群豐度及多樣性效果最優(yōu)。由Beta多樣性分析可知，與CK-3組瘤胃真菌菌群組成相比，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組瘤胃真菌菌群組成相近，說明添加MOS可改變?yōu)┭蛄鑫刚婢何锓N組成，其中3%MOS對其影響最大。通過PCoA，與CK-3組相比，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組間距離更近，其中Y1-3組、Y3-3組瘤胃真菌菌群相似性相比Y2-3組更高，說明添加MOS可影響瘤胃真菌菌群組成。整個試驗期內，瘤胃液真菌數量在各試驗組間均一直處于較高水平?？偠灾?，本試驗條件下，飼糧中添加MOS可增加灘羊瘤胃真菌菌群多樣性且3%為增加真菌菌群多樣性最優(yōu)添加水平。

3.2 MOS對灘羊瘤胃真菌菌群結構的影響

瘤胃真菌對于飼糧中纖維的降解主要是利用厭氧真菌優(yōu)先附著于植物表面，通過真菌假根對植物細胞壁的降解作用進入植物維管組織內對其進行降解，使植物內部的成分暴露，更加利于其他微生物與植物底物的接觸，從而利于植物纖維的降解[6-7]。瘤胃中的真菌可產生纖維素酶，其可降解植物中的果膠和結構碳水化合物等物質，同時具備降解蛋白質和淀粉的能力。本試驗結果顯示，在門水平上，子囊菌門、黃藻門、擔子菌門為4組共有的優(yōu)勢菌門，但它們的相對豐度在4組間差異不顯著，Y1-3組、Y3-3組子囊菌門的相對豐度較CK-3組分別增加10.03%、8.26%。有研究者表示超過98%的已知真菌都屬于子囊菌門和擔子菌門[8]。韓旭峰[9]在陜西絨山羊的研究中發(fā)現不同精粗比飼糧組瘤胃真菌中優(yōu)勢菌門均為子囊菌門。子囊菌門是真菌中最大的一類菌群[10]，以腐生菌為主，可降解難以降解的纖維素和木質素[11]。這側面說明本試驗添加1%或3%MOS有利于飼糧中纖維的降解。而有研究表示子囊菌門的增加與植物收獲前牧草的植物病原體[12]、貯藏過程中可能發(fā)生的子囊菌門霉菌(特別是曲霉菌和鐮刀菌)污染有關[13]，具體原因還需進一步探究。韋玥瑞[14]選擇苜蓿青干草、苜蓿青干草加精料、玉米秸稈、玉米秸稈加精料為試驗飼糧分析內蒙古絨山羊瘤胃微生物多樣性，發(fā)現玉米秸稈及其補飼組的次級優(yōu)勢菌門是擔子菌門。本試驗結果表明，在屬水平上，Y1-3組曲霉屬的相對豐度顯著高于其他3組。有研究發(fā)現給山羊飼喂不同飼糧后瘤胃真菌中優(yōu)勢菌屬均為曲霉屬[14]，其對致病菌有一定的抑制作用[15]。CK-3組蟲草屬、紅菇屬、念珠菌屬、柯達酵母屬的相對豐度較其他組稍高。蟲草屬隸屬于子囊菌門，有些可作為重要的食藥用真菌[16-17]，有些富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、N6-(2-羥乙基)腺苷和噴司他汀等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)、降血脂及清除自由基等多種藥理學功效[18]。王晟楠[19]研究了5種鹿科動物胃內微生物組成差異，發(fā)現念珠菌屬在梅花鹿胃內的占比最高，為6.09%。Y2-3組軟棗獼猴桃屬、青霉菌屬、Brassica的相對豐度較其他組稍高。青霉屬和曲霉菌屬參與土壤難溶性磷的溶解，可有效提高植物對磷的獲取，是溶磷微生物的重要類群[20]。Y3-3組未分類菌屬的相對豐度顯著高于Y1-3組和Y2-3組，說明有關真菌菌群具體組成還需要進一步探究。

3.3 飼喂添加不同水平MOS飼糧的灘羊瘤胃真菌菌群功能預測

反芻動物的消化過程依靠細菌、古菌、真菌共同作用，真菌在瘤胃內以腐生、共生、寄生等形式將有機物分解成二氧化碳釋放。作為腐生生物，真菌產生的多種酶可將氮元素從有機物中分解釋放。在反芻動物消化過程中，木質素影響反芻動物采食的適口性，并限制了瘤胃內微生物對纖維素的降解和攝取[21]，真菌比細菌具有更強的木質素降解能力[22]，反芻動物胃內真菌菌群可降低木質素帶來的負面影響。本試驗中，飼喂添加不同水平MOS飼糧的灘羊真菌營養(yǎng)型的豐度不同。Y1-3組病原營養(yǎng)型、腐生-病原-共生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型的豐度相對其他組最少，而腐生營養(yǎng)型的豐度較其他組多，這可能與子囊菌門多為腐生菌有關，從而更利于纖維的降解。病原營養(yǎng)型真菌主要從宿主獲取營養(yǎng)來源，易造成植物病害，而共生營養(yǎng)型真菌則對植株生長和品質等產生有益作用[23]，說明Y1-3組灘羊的瘤胃真菌菌群功能可能更有利于植物的降解與瘤胃健康的維系。

4 結 論

本試驗條件下，蕎麥秸稈飼糧中添加3%MOS相較其他組更有利于增加灘羊瘤胃真菌菌群的多樣性；對灘羊瘤胃真菌菌群進行的功能預測顯示，添加1%MOS時灘羊瘤胃真菌菌群可能更有利于植物纖維的降解與瘤胃健康的維系。