橙皮苷和迷迭香酸組合對脂多糖攻毒大鼠回腸形態(tài)、菌群結構以及炎癥反應的影響

李盼盼 李潤林 吳佳慶 雷銘康 汪 晶* 朱偉云

(1.南京農業(yè)大學動物科技學院，南京 210095；2.國家動物消化道營養(yǎng)國際聯合研究中心，南京 210095)

植物提取物是利用物理或化學方法從天然植物中提取出來的，由于其綠色安全且無明顯毒副作用，并且具有一定的免疫調節(jié)作用[1]，逐漸被應用于豬、禽、反芻動物等的養(yǎng)殖中，發(fā)揮抑菌、抗炎、促進腸道健康等作用[2]。由于單一植物提取物的功能及作用位點較為單一，而復合植物提取物中多種有效活性成分的疊加或協同作用可以在發(fā)揮單一植物提取物原有功能的基礎上增強其作用效果、增加作用靶點，從而更加有效地解決動物生長發(fā)育過程中所面臨的健康問題。

橙皮苷(hesperidin)是一種主要存在于柑橘類植物中的黃烷酮類化合物，水溶性較差。黃酮類化合物的抗氧化活性與其化學結構中的酚羥基有關[3]，它主要通過2種方式來減輕動物機體的氧化反應，一是清除過多的自由基，二是通過激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)/核因子2相關因子2(Nrf2)信號通路來增強細胞的防御功能[4]。研究表明橙皮苷可以提高腸道緊密連接蛋白表達，降低腸道通透性，并且通過抑制核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)的激活，降低炎癥因子水平，緩解腸道炎癥[5-6]。橙皮苷還具有較強的抗菌活性，可以在一定程度上抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的生長，其作用機制可能是通過改變細菌細胞膜通透性來影響細菌生長[7]。迷迭香酸(rosmarinic acid)是一種主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中的水溶性酚酸類化合物，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，它主要通過增加細菌細胞膜通透性、影響細菌蛋白質代謝以及DNA復制等發(fā)揮抑菌作用[8]。植物提取物中酚羥基數目越多，抗氧化能力越強[3]，迷迭香酸化學結構中有4個酚羥基，橙皮苷化學結構中有2個酚羥基，表明迷迭香酸抗氧化能力強于橙皮苷。迷迭香酸發(fā)揮抗氧化作用主要通過減少活性氧的產生，調節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性來實現[9]。目前，橙皮苷或迷迭香酸大多是單獨添加到大鼠結腸炎模型[6,10]、結腸癌模型[11]或炎癥細胞模型[12]中探究其藥理作用。但是橙皮苷的應用有一定的局限性，其分子結構以糖苷形式存在，導致水溶性較差，生物利用度低，不易被腸道上皮細胞吸收利用[13]，通過酸水解對橙皮苷進行脫糖基處理，制備的橙皮素單葡萄糖苷和橙皮素的溶解度顯著增加[14]。我們推測橙皮苷和迷迭香酸配合使用時，酚酸類化合物迷迭香酸不僅能發(fā)揮抗氧化、抑菌、抗炎等功能，還可能為橙皮苷提供酸水解的條件，進而提高橙皮苷的利用效率，從而有助于調節(jié)腸道菌群結構，緩解腸道炎癥反應。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，在細菌死亡或細胞壁破裂時釋放量增加。LPS通過激活Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/NF-κB信號通路刺激腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)等促炎因子的產生，加劇炎癥反應[15]，常被用于構建腸道炎癥模型。因此，本試驗以SD大鼠作為研究對象，通過腹腔注射劑量為500 μg/kg BW的LPS構建急性腸道損傷模型，探究橙皮苷和迷迭香酸組合對LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)、菌群結構以及炎癥反應的影響，旨在為橙皮苷和迷迭香酸組合應用于畜禽養(yǎng)殖中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無特定病原體(SPF)級SD斷奶大鼠購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁育場；橙皮苷和迷迭香酸均購自某科技有限公司，純度≥98%；LPS購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選取體重為(54.65±1.18)g、健康狀況良好的SPF級斷奶SD大鼠共32只，適應7 d后，將大鼠隨機分成4組：LPS組(每日灌胃2 mL無菌生理鹽水)、Hes組(每日灌胃300 mg/kg BW橙皮苷)、RA組(每日灌胃20 mg/kg BW迷迭香酸)、Hes×RA組(每日灌胃150 mg/kg BW橙皮苷+10 mg/kg BW迷迭香酸)。每組4個重復，每個重復2只大鼠(公母各占1/2)。試驗期間各組大鼠均飼喂標準基礎飼糧，自由采食和飲水。動物房溫度在25 ℃左右，相對濕度在60%左右，每天光照和黑暗均為12 h。試驗正試期為14 d，在第13天，所有大鼠腹腔注射劑量為500 μg/kg BW的LPS溶液，12 h后，用乙醚將大鼠麻醉并解剖，采集大鼠回腸食糜和黏膜于液氮中保存，用于后續(xù)分析。動物試驗依照南京農業(yè)大學實驗動物中心管理制度執(zhí)行，試驗方案經該機構動物福利與倫理委員會批準。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 回腸形態(tài)觀察

剪取1 cm左右回腸組織于4%多聚甲醛中固定24 h，經乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，最后再進行蘇木精-伊紅(HE)染色后封片。切片置于虛擬顯微鏡上進行拍照，使用Image-Pro Plus軟件測量絨毛高度以及隱窩深度，并計算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.3.2 回腸黏膜中髓過氧化物酶(MPO)活性和細胞因子含量檢測

稱取0.1 g回腸黏膜樣品制備成10%的勻漿液，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定髓過氧化物酶(MPO)活性和細胞因子(IL-6、TNF-α、IL-10)含量。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，試驗操作按照說明書要求進行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.3.3 回腸食糜微生物16S rRNA測序

按照Zoetendal等[17]的方法進行回腸食糜微生物DNA提取，并利用微量分光光度計(Thermo ND-1000，美國)檢測到的260和280 nm處DNA的比值評價DNA質量。根據16S rRNA的保守區(qū)域設計引物，上游引物319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)用于聚合酶鏈式反應擴增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)[18]。PCR產物基于Illumina-MiSeq PE300平臺進行測序分析。

1.3.4 回腸食糜中微生物代謝產物短鏈脂肪酸(SCFAs)含量測定

使用GC-2014A型氣相色譜儀(氫火焰離子化檢測器，島津，日本)測定回腸食糜中SCFAs的含量。根據Wang等[19]的方法，使用柱長30 m，膜厚0.25 μm，內徑寬0.32 mm的毛細管柱，柱溫設置為140 ℃，進樣口溫度為180 ℃，檢測器溫度為180 ℃，進樣量為0.3 μL。

1.3.5 回腸黏膜中緊密連接蛋白基因和TLR4/MyD88信號通路相關基因mRNA相對表達量測定

回腸黏膜總RNA使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行提取，并使用微量分光光度計(Thermo ND-2000，美國)進行RNA質量以及濃度的檢測。參照說明書將1 μg的總RNA加入到HiScript?Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR試劑盒(Vazyme，南京)的反應體系中，在DNA擴增儀(Long Gene?)上設置反應程序為50 ℃持續(xù)15 min，85 ℃持續(xù)5 s，將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄后的cDNA置于-80 ℃保存。將cDNA加入到ChamQ SYBR qPCR試劑盒(Vazyme，南京)的反應體系中，利用熒光定量PCR儀進行熒光定量。選擇β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算ZO-1、Claudin-1、Occludin、TLR4、MyD88、IRAK1和TRAF6的mRNA相對表達量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 緊密連接蛋白基因和TLR4/MyD88信號通路相關基因的引物序列

1.4 數據統計分析

數據首先使用Excel 2019進行整理，整理后的數據利用SPSS 26.0分析軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異顯著則使用Duncan氏法進行多重比較分析，之后用GraphPadPrism 8、Origin 2021和Excel 2019分別制作成圖表。結果用“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示顯著差異，0.05≤P<0.10表示差異有顯著的趨勢。

2 結果與分析

2.1 LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)的變化

由圖1可以看出，LPS組出現腸絨毛斷裂，腸道上皮受損，Hes×RA組腸絨毛排列整齊，形態(tài)完好。由表3可知，與LPS組相比，Hes組、RA組以及Hes×RA組大鼠回腸的絨毛高度以及絨隱比顯著提高(P<0.05)，回腸隱窩深度沒有顯著變化(P>0.05)。

圖1 各組大鼠回腸組織切片

表3 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)的影響

2.2 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物及其代謝產物的變化

2.2.1 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物多樣性的變化

使用ACE指數、Chao1指數、Shannon指數以及Simpson指數分析LPS攻毒大鼠食糜微生物的alpha多樣性。其中，ACE指數和Chao1指數代表微生物豐富度，Shannon指數和Simpson指數代表微生物多樣性。從表4可以看出，與LPS組相比，Hes組、RA組、Hes×RA組大鼠回腸食糜微生物的ACE指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均沒有顯著變化(P>0.05)。大鼠回腸食糜微生物的beta多樣性分析基于操作分類單元(OTU)水平采用Bray-Curtis的距離算法進行主坐標分析(PCoA)。如圖2所示，LPS組、Hes組、RA組和Hes×RA組的微生物聚類分開，4組間呈現出顯著差異(R=0.661 3，P=0.001 0)。

表4 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物α多樣性的影響

圖2 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物beta多樣性的影響

2.2.2 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物組成的變化

如圖3-A所示，在門水平，大鼠回腸食糜微生物中優(yōu)勢菌門主要是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。對門水平上相對豐度較高的3個菌門進行顯著性分析，結果顯示，與LPS組相比，Hes組和Hes×RA組Actinobacteria的相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3-C)，Hes組、RA組和Hes×RA組變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3-D)，Hes組、RA組和Hes×RA組Firmicutes的相對豐度有所提高但差異不顯著(P>0.05，圖3-E)。在屬水平，大鼠回腸食糜微生物中相對豐度前30的菌屬如圖3-B所示，LPS組的優(yōu)勢菌屬主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，其他3組的優(yōu)勢菌屬均為Lactobacillus。對屬水平上的相對豐度較高的3個菌屬進行顯著性分析，結果顯示，與LPS組相比，Hes組、RA組和Hes×RA組Lactobacillus的相對豐度顯著升高(P<0.05，圖3-F)，Corynebacterium的相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3-G)；此外，Hes組和Hes×RA組鏈球菌屬(Streptococcus)的相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3-H)。

Firmicutes:厚壁菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Cyanobacteria：藍藻門；Desulfobacterota：脫硫桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobiota：疣微菌門；Others：其他；Lactobacillus：乳桿菌屬；Corynebacterium：棒狀桿菌屬;Streptococcus：鏈球菌屬；Romboutsia：羅姆布茨菌屬；Akkermansia：阿克曼氏菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Aerococcus：氣球菌屬；Jeotgalicoccus：熱球菌屬；Rothia：羅氏菌屬；Enterorhabdus：腸桿菌屬；Facklamia：費克藍姆菌屬；unclassified_c_Bacilli：未分類的桿菌綱；unclassified_p_Firmicutes：未分類的厚壁菌門；unclassified_o_Lactobacillales：未分類的乳酸桿菌目；Leucobacter：亮桿菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；norank_f_Lachnospiraceae：未命名的毛螺菌科；Clostridium_sensu_stricto_1：致狹窄梭狀芽孢桿菌1；Glutamicibacter：谷氨酸桿菌屬；Eubacterium_brachy_group：短真桿菌屬；Oligella：寡源桿菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Dubosiella：杜氏乳桿菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；unclassified_k_norank_d_Bacteria：未分類未命名的細菌；Psychrobacter：嗜冷桿菌屬；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類的毛螺菌科；Brachybacterium：短桿菌屬。

2.2.3 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物代謝產物SCFAs含量的變化

對LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物代謝產物SCFAs含量進行檢測，結果如表5所示。與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸食糜中乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸的含量顯著提高(P<0.05)，RA組丙酸的含量顯著提高(P<0.05)；此外，Hes×RA組丁酸的含量有增加的趨勢(P=0.081)。

表5 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸食糜代謝產物的影響

2.2.4 LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物及其代謝產物的相關性分析

對LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物與其代謝產物SCFAs進行了皮爾森相關性分析(Pearson’s correlation analysis)，如圖4所示。相關性分析顯示，乙酸含量與Proteobacteria、Streptococcus相對豐度呈顯著負相關(P<0.05)；丙酸含量與Firmicute、Lactobacillus相對豐度呈顯著正相關(P<0.05)，與Actionbacteria、Proteobacteria、Corynebacterium相對豐度呈顯著負相關(P<0.05)；丁酸含量與Lactobacillus相對豐度呈顯著正相關(P<0.05)。

紅色表示正相關，藍色表示負相關，*表示顯著相關。

2.3 LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應以及緊密連接蛋白的變化

2.3.1 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中MPO活性以及細胞因子含量的變化

如表6所示，與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中MPO活性顯著降低(P<0.05)，而Hes組、RA組則沒有顯著變化(P>0.05)。在細胞因子方面，與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P<0.05)；Hes組回腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)；Hes組、RA組和Hes×RA組回腸黏膜中TNF-α含量無顯著變化(P>0.05)。

表6 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸黏膜中MPO活性以及細胞因子含量的影響

2.3.2 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白相關基因mRNA相對表達量的變化

表7顯示的是LPS攻毒大鼠回腸黏膜中3種緊密連接蛋白基因mRNA相對表達量的變化。與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中Claudin-1和Occludin的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，ZO-1的mRNA相對表達量有增加的趨勢(P=0.064)。Hes組和RA組回腸黏膜中ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對表達量與LPS組相比沒有顯著變化(P>0.05)。

表7 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白相關基因mRNA相對表達量的影響

2.4 LPS攻毒大鼠回腸黏膜中TLR4/MyD88信號通路相關基因mRNA相對表達量的變化

如表8所示，與LPS組相比，Hes×RA組回腸黏膜中IRAK1和TRAF6的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；Hes組和RA組回腸黏膜中IRAK1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。Hes組、RA組和Hes×RA組回腸黏膜中TLR4和MyD88的mRNA相對表達量與LPS組相比沒有顯著變化(P>0.05)。

表8 橙皮苷、迷迭香酸及其組合對LPS攻毒大鼠回腸黏膜中TLR4/MyD88信號通路中相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 橙皮苷和迷迭香酸組合改善LPS攻毒大鼠回腸形態(tài)

腸道形態(tài)通常被用作評價腸道上皮完整性，主要通過絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比的變化來直觀地反映試驗處理對動物健康的影響。絨毛高度增加表明腸道與營養(yǎng)物質接觸面積擴大，有助于提高大鼠的消化吸收效率[20]。腸道絨毛來源于隱窩，隱窩深度的降低說明細胞更新減少，細胞增殖率降低，用于細胞增殖、更新所需要的能量減少，有利于動物生長發(fā)育[21-22]。有研究表明，給小鼠口服橙皮苷可以顯著改善葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)誘導的結腸組織損傷，減輕炎性細胞浸潤以及充血等現象[6]，而200 mg/kg的迷迭香酸顯著緩解了由三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠結腸炎癥狀，并縮小了結腸組織潰瘍面積[10]。此外，Kamboh等[23]研究指出，LPS攻毒導致肉雞小腸絨毛高度降低，隱窩深度增加，而染料木黃酮和橙皮苷以劑量依賴的方式顯著提高了21日齡肉雞十二指腸和回腸絨毛高度和絨隱比，并改善了免疫功能。在本研究中，LPS攻毒導致大鼠回腸組織損傷，腸絨毛出現明顯斷裂，腸道上皮被破壞。無論是橙皮苷、迷迭香酸還是其組合，均顯著增加了LPS攻毒大鼠回腸的絨毛高度和絨隱比，并使隱窩深度有所降低。這表明橙皮苷、迷迭香酸及其組合可以改善LPS攻毒導致的大鼠腸道形態(tài)損傷，并通過提高絨毛高度、降低隱窩深度，來促進大鼠的消化吸收和生長發(fā)育。

3.2 橙皮苷和迷迭香酸組合調節(jié)LPS攻毒大鼠回腸食糜菌群結構以及微生物代謝產物

腸道微生物和腸道上皮相互作用，共同維持腸道屏障的完整性[24]。腸道上皮受損可能會導致病原微生物侵襲，打破腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡。為進一步探究橙皮苷和迷迭香酸組合對LPS攻毒大鼠腸道微生物的影響，我們對LPS攻毒大鼠回腸食糜微生物進行了16S rRNA高通量測序分析。本研究中，與LPS組相比，Lactobacillus的相對豐度在Hes組、RA組以及Hes×RA組均顯著升高。有研究表明，含有迷迭香酸的油菜花粉提取物可以通過提高Lactobacillus等有益菌的相對豐度，降低擬桿菌屬(Bacteroides)等潛在致病菌的相對豐度來調整腸道菌群結構，改善DSS誘導的小鼠結腸炎[25]。相關細胞試驗發(fā)現蘋果提取物中的酚類物質可以增加加氏乳桿菌R(LactobacillusgasseriR)和干酪乳桿菌FMP(LactobacilluscaseiFMP)在Caco-2和HT29-MTX腸上皮細胞的黏附[26]。這些研究結果與本文結果一致。在本研究中，橙皮苷和迷迭香酸組合可能通過增加Lactobacillus的黏附，進而影響腸道中條件致病菌以及其他菌屬的生長，促進Lactobacillus的增殖。此外，與LPS組相比，回腸食糜微生物中Corynebacterium的相對豐度在Hes組、RA組以及Hes×RA組顯著降低，Streptococcus的相對豐度在Hes組和Hes×RA組顯著降低。研究發(fā)現，Streptococcus通過激活炎癥小體來刺激白細胞介素-1β(IL-1β)的產生，導致化膿性炎癥[27]；Corynebacterium是革蘭氏陽性菌，感染后會導致免疫力下降，部分Corynebacterium細菌還可能誘發(fā)人畜共患病[28]。因為橙皮苷(黃烷酮類物質)和迷迭香酸(酚酸類物質)均屬于多酚類物質[29]，多酚類物質中的羥苯基結構使得其具有一定的抑菌作用[30]，所以回腸食糜微生物中潛在致病菌相對豐度降低可能與橙皮苷和迷迭香酸的抑菌作用有關[8,31]。綜上所述，橙皮苷和迷迭香酸組合可以通過促進有益菌定植，減少潛在致病菌的定植來調控腸道微生物區(qū)系，有助于保持腸道的微生態(tài)平衡。

SCFAs是由腸道微生物分解代謝復雜碳水化合物所產生的，一方面可以為腸道上皮細胞提供能量來源，另一方面可以通過降低部分細胞因子含量，抑制巨噬細胞和中性粒細胞的增殖，來減輕機體炎癥反應[32]。在本研究中，與LPS組相比，橙皮苷和迷迭香酸組合顯著提高了回腸食糜中微生物代謝產物乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸的含量，RA組丙酸含量顯著提高，Hes組SCFAs含量沒有顯著變化。前人研究表明，橙皮苷可以調節(jié)糖尿病模型小鼠腸道微生物群的結構，增加糞便中SCFAs的含量，特別是顯著增加丁酸的含量[33]。這與本研究結果相似，本試驗中Hes×RA組丁酸含量有增加的趨勢，但差異不顯著。乳酸菌可以促進腸上皮細胞吸收SCFAs[34]，皮爾森相關性分析也發(fā)現丙酸、丁酸含量與Lactobacillus相對豐度呈顯著正相關，乙酸含量與Proteobacteria、Streptococcus相對豐度呈顯著負相關，丙酸含量與Actionbacteria、Proteobacteria、Corynebacterium相對豐度呈顯著負相關，表明SCFAs含量增加可能與回腸食糜微生物中Lactobacillus等有益菌的相對豐度增加和Proteobacteria、Actionbacteria、Streptococcus、Corynebacterium相對豐度降低有關。有研究表明乙酸和丙酸可以通過抑制結腸癌細胞系中TNF-α介導的NF-κB信號通路的激活來減輕炎癥反應[35]。我們推測橙皮苷和迷迭香酸組合促進微生物代謝產物SCFAs生成，可能有助于緩解LPS攻毒所誘導的腸道炎癥。

3.3 橙皮苷和迷迭香酸組合減輕LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應

MPO是中性粒細胞浸潤的標志[12]。在本研究中，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中MPO活性顯著降低，而單一植物提取物的Hes組和RA組沒有顯著變化，說明橙皮苷和迷迭香酸組合能顯著減輕回腸組織炎性細胞浸潤程度。與LPS組相比，Hes×RA組大鼠回腸黏膜中促炎因子IL-6的含量顯著降低，抑炎因子IL-10的含量顯著提高，Hes組IL-6的含量顯著降低，RA組TNF-α、IL-10、IL-6的含量無顯著變化，說明橙皮苷和迷迭香酸組合可以通過降低促炎因子含量，提高抑炎因子含量來減輕LPS攻毒大鼠的腸道炎癥反應，并且效果優(yōu)于單一植物提取物，這可能是因為橙皮苷的生物利用度較低，迷迭香酸與其配合為橙皮苷脫糖基提供了酸水解的條件，提高了橙皮苷的利用效率。有研究表明，在LPS誘導炎癥的HepG2細胞中，橙皮苷以劑量依賴的方式降低IL-6的基因表達[36]，此結果在DSS誘導的結腸炎小鼠中也得到證實，研究發(fā)現結腸炎小鼠每天灌胃40 mg/kg橙皮苷(純度>98%)可以顯著降低結腸中MPO的活性及TNF-α、IL-6的含量，顯著升高IL-10的含量[6]。此外，迷迭香酸可以顯著降低1,2-二甲基肼(DMH)誘導的結腸癌大鼠結腸黏膜中促炎因子TNF-α和IL-6的產生，具有一定的抗炎活性[11]，這與本研究結果一致。LPS作用于細胞表面受體，激活多種細胞內信號通路，如TLR4/MyD88信號通路、NF-κB抑制物激酶(IKK)/NF-κB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等，促使炎癥因子表達，引發(fā)炎癥反應[37]。在本研究中，與LPS組相比，橙皮苷、迷迭香酸及其組合顯著降低了LPS攻毒大鼠回腸黏膜中IRAK1的mRNA相對表達量，TLR4和MyD88的mRNA相對表達量也有所降低，并且Hes×RA組TRAF6的mRNA相對表達量顯著降低。炎癥因子的減少與TLR4/MyD88信號通路被抑制有關[38-39]，這說明橙皮苷和迷迭香酸組合可能是通過抑制TLR4/MyD88信號通路的激活來減少炎癥因子的產生，從而減輕LPS攻毒大鼠回腸炎癥反應。

3.4 橙皮苷和迷迭香酸組合改善LPS攻毒大鼠回腸腸道屏障功能

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成成分，能夠造成腸道屏障受損，破壞腸道緊密連接，導致腸道通透性增加，從而加重腸道炎癥[40]。ZO-1、Claudin-1和Occludin等緊密連接蛋白在腸道上皮緊密連接中發(fā)揮重要作用，有助于維持緊密連接結構的穩(wěn)定，調節(jié)腸道通透性，并且研究證實它們在炎癥性腸病中的表達量會顯著降低[41-42]。已有研究表明，橙皮苷可以提高Caco-2細胞中緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對表達量，降低腸道通透性[6]；迷迭香酸可以通過提高IPEC-J2細胞的物理屏障蛋白Claudin-1和Occludin的表達、降低炎癥因子IL-6和IL-8的表達來減輕霉菌毒素所誘導的氧化應激[43]，也可以通過提高黏蛋白2(Muc2)以及ZO-1的表達來改善結腸炎小鼠的機械屏障[10]。在本研究中，與LPS組相比，Hes×RA組LPS攻毒大鼠回腸黏膜中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的mRNA相對表達量顯著提高，且ZO-1的mRNA相對表達量也有增加的趨勢，單獨添加橙皮苷或迷迭香酸對ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA相對表達量無顯著影響。這說明給LPS攻毒大鼠灌胃橙皮苷和迷迭香酸組合可以提高回腸黏膜中緊密連接蛋白的mRNA相對表達量，有助于改善腸道屏障功能，從而緩解腸道炎癥。

4 結 論

橙皮苷和迷迭香酸組合有助于改善LPS攻毒引起的大鼠回腸形態(tài)損傷，調節(jié)菌群結構，減輕炎癥反應，改善腸道屏障功能，從而提高大鼠腸道健康狀況。