不同提取方法的桑葉提取物對小鼠生長性能、抗氧化和免疫功能的作用研究

黃 慧 夏 鑫* 周應(yīng)軍 劉瑩瑩，3 王賢澤 王 霞 肖定福**

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南今漢藥業(yè)有限公司，長沙 410014；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131)

飼料桑具有適應(yīng)性強、易種植、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等特點，近年來隨著人們對桑葉認識和研究的加深以及對新型飼料資源的開發(fā)研究，桑葉中豐富的營養(yǎng)和活性物質(zhì)逐漸引起了畜牧業(yè)的關(guān)注，已展現(xiàn)出特殊的飼用價值，具有極大的開發(fā)潛力。但由于飼料桑枝葉含有纖維素、木質(zhì)素及單寧、植物凝集素等抗營養(yǎng)因子，且具有一定的澀味，大劑量添加至動物飼糧中會導(dǎo)致適口性下降，畜禽采食量降低，限制了飼料桑在飼糧中的應(yīng)用。飼料桑含有多種活性成分，包括桑葉黃酮、桑葉多酚、桑葉多糖、1-脫氧野尻霉素、槲皮素及其衍生物等生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、降脂、抗病毒、抗炎癥等藥理學(xué)作用[1-2]，然而桑葉不同提取方法活性成分差別大。桑葉正己烷提取物中主要揮發(fā)性組分為十四烷(16.76%)、十二烷(13.20%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(10.26%)、癸烷(9.10%)、十六烷(8.71%)、亞麻醇(7.25%)、十八烷(5.88%)、二十烷(3.26%)、鄰苯二甲酸二丁酯(2.59%)[3]。劉琳[4]從桑葉乙酸乙酯提取物中分離得到12種化合物，鑒定出7種化合物，分別是(6S,9R)-6,9-二羥基-3-氧代-α-紫羅蘭醇、icarisideB1的苷元、東莨菪內(nèi)酯、7-羥基香豆素、Moracin P、Moracin M、十六烷酸。桑葉乙醇提取物中含有多種有機物，主要包括酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)、醇類(0.21%)[5]。唐忠海[6]比較了低(300 mg/kg)、中(600 mg/kg)、高劑量(1 200 mg/kg)桑葉水提物對糖尿病小鼠的病理治療效果，得出1 200 mg/kg桑葉水提物作用效果最好。桑葉粗提物即用桑葉水煮法提取桑葉中復(fù)合有效成分。不同提取方法的桑葉提取物中黃酮、多酚、多糖、1-脫氧野尻霉素、槲皮素等活性成分差異大，對機體的作用效果亦不同，篩選出較好的桑葉提取方法能夠為下一步研究其具體成分、作用機理、桑葉生產(chǎn)質(zhì)量控制打下基礎(chǔ)，為篩選桑葉提取物作為藥物、營養(yǎng)及飼料添加劑開發(fā)提供試驗依據(jù)。因此，本研究探討桑葉正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶物和粗提物對小鼠生長性能、血清生化指標及炎癥細胞因子的作用，旨在初步篩選出對動物作用效果相對較好的提取方法，為桑葉提取物作為飼料添加劑研發(fā)提供前期試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

無特定病原體(SPF)級ICR雄性小鼠體重20～22 g、4周齡，生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2018-0002，購于湖南萊克斯景達實驗動物有限公司。試驗小鼠飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)標準化動物房，控制環(huán)境溫度在(24±1)℃，濕度為(50±10)%，每3 d換1次墊料，自由清潔飲水、采食。按照國家《實驗動物管理條例》執(zhí)行飼養(yǎng)試驗。

1.2 試驗材料

1.2.1 桑葉的來源

飼料桑1.0～1.2 m高時收割機械枝葉，機械切斷后陰干。試驗用桑葉為湖南中桑農(nóng)業(yè)科技有限公司提供的飼料桑。

1.2.2 桑葉提取物的制備

稱取干燥粉碎的桑葉1 000 g于玻璃柱中，根據(jù)極性的不同用3倍體積的正己烷對桑葉進行提取，在正己烷中浸泡30 min后打開玻璃柱底部開關(guān)，使提取液緩慢滴入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，然后用真空干燥箱干燥成固體，用研缽粉碎后裝入自封袋，貼上標簽(以下簡稱提取物A)，放入冰箱保存?zhèn)溆?。然后再用乙酸乙酯、乙?85%)和熱水(60～70 ℃)根據(jù)極性不同依次對桑葉進行提取。將得到的乙酸乙酯桑葉提取液、乙醇(85%)桑葉提取液和熱水(60～70 ℃)桑葉水溶液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，然后用真空干燥箱干燥成固體，用研缽粉碎后裝入自封袋，貼上標簽，乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶物分別記為提取物B、C、D，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 桑葉粗提物的制備

稱取150 kg的干燥桑葉粉加入提取罐，2次加熱回流提?。?)加入750 kg的水提取1.5 h后過濾。2)第1次過濾后的濾渣加入600 kg的水提取1.5 h后過濾。將2次濾液濃縮，并經(jīng)噴霧干燥制成桑葉粗提取物干粉(以下簡稱提取物E)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

酶標儀(Bio-Rad imark)，全自動生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-200)，TASUN-SLT-20-小型中藥滲漉提取系統(tǒng)M404058。

1.4 試驗設(shè)計及飼糧

108只小鼠隨機分為6組：1個對照組(基礎(chǔ)飼糧)和5個試驗組(基礎(chǔ)飼糧+不同桑葉提取物A、B、C、D和E，添加量為1 200 mg/kg)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)3只小鼠，1個小鼠籠喂養(yǎng)1個重復(fù)，個體間體重差異不顯著(P>0.05)。預(yù)試期3 d，第4天進入正試期，正試期為28 d。基礎(chǔ)飼糧為小鼠飼糧，購自江蘇協(xié)同生物工程有限責任公司，其營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.5 指標檢測

1.5.1 生長性能

試驗第28天，小鼠禁食不禁水24 h，以重復(fù)為單位，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)，試驗期間觀察試驗小鼠是否有異?；蛩劳?，并計算死淘率。

1.5.2 血清抗氧化和生化指標

試驗第28天，小鼠禁食不禁水24 h，每組18只小鼠均眼球采血，采集的血液室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，吸取血清保存于-80 ℃待測。使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)的含量；使用全自動生化分析儀檢測血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性及白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和肌酐(CREA)的含量(試劑盒為Mindray)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)和總膽固醇(TC)含量(試劑盒為Elabscience)，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 肝臟中炎癥細胞因子含量

正試期結(jié)束時采用頸椎脫臼法處死，取肝臟樣品用錫箔紙包裹，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。應(yīng)用雙抗體夾心法測定肝臟組織中白細胞介素(IL)-17、IL-2、IL-1、干擾素-γ(INF-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，具體步驟嚴格按照試劑盒(購自江蘇雨桐生物科技有限公司)說明進行操作。

1.6 統(tǒng)計分析

用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行初步整理，用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05判斷為差異顯著，P<0.01判斷為差異極顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉提取物對小鼠生長性能的影響

由表2可知，各組小鼠始重符合試驗要求，各組間無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，各試驗組小鼠末重、ADG和F/G差異不顯著(P>0.05)，但E組有增加趨勢(0.05

表2 桑葉提取物對小鼠生長性能的影響

2.2 桑葉提取物對小鼠血清抗氧化功能的影響

由表3可知，與對照組相比，C、D和E組小鼠血清GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，分別提高了27.22%、19.62%、27.21%；B、D和E組小鼠血清T-SOD活性極顯著提高(P<0.01)，分別提高了66.66%、37.54%、38.77%；各試驗組小鼠血清T-AOC和MDA含量差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加1 200 mg/kg桑葉水溶物和粗提物能提高小鼠抗氧化功能。

表3 桑葉提取物對小鼠血清抗氧化功能的影響

2.3 桑葉提取物對小鼠血清生化指標的影響

由表4可知，各組小鼠血清ALT活性及LDL-C、GLU和UN含量差異不顯著(P>0.05)；B和D組的小鼠血清AST活性顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，A、C、D和E組小鼠血清ALB含量顯著提高(P<0.05)；各試驗組小鼠血清TP含量顯著提高(P<0.05)；B、D、E組小鼠血清HDL-C含量顯著降低(P<0.05)；B和E組血清TG含量顯著降低(P<0.05)；C組血清CREA含量顯著降低(P<0.05)。

表4 桑葉提取物對小鼠血清生化指標的影響

2.4 桑葉提取物對小鼠肝臟炎癥細胞因子含量的影響

由表5可知，與對照組相比，A、C、D、E組肝臟IL-17含量極顯著升高(P<0.01)，肝臟IL-2含量極顯著下降(P<0.01)，A、C、D組肝臟IL-1β和IFN-γ含量極顯著升高(P<0.01)，A組肝臟TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。

表5 桑葉提取物對小鼠肝臟細胞因子含量的影響

3 討 論

3.1 桑葉提取物對小鼠生長性能的影響

桑葉中含有的抗營養(yǎng)因子會使畜禽的養(yǎng)分消化受到影響，同時也會影響飼糧的適口性，大量添加反而會使畜禽生長性能降低。桑葉提取物可以降低畜禽的血糖、血脂，抑制有害菌，增強畜禽的抗氧化能力，也可使桑葉中有效成分進一步加以分離、純化，充分發(fā)揮其功效。曲培濱[7]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮有利于犢牛的生長性能，尤其是能夠顯著提高犢牛的體長和增重效果。因此適量的桑葉提取物添加到畜禽飼糧中以提高其生長性能，提高經(jīng)濟效益。

桑葉正己烷提取物主要含有脂肪醇類和甾體類化合物[8]，植物甾醇、脂肪酸及其衍生物均具有一定的抑菌效果[9]。劉琳[4]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉乙酸乙酯提取物中含有香豆素類、萜類、苯基苯并呋喃類、脂肪酸類單體化合物。桑葉乙醇提取物主要含有酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)和醇類(0.21%)，具有一定的抑菌作用，同時對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)和羥自由基(·OH)具有一定清除能力[5]。揮發(fā)油又名精油，存在于植物的枝葉或種子中，具有芳香氣味且不溶于水，是桑屬植物含有的多種類型的化合物中的一種。本研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加1 200 mg/kg桑葉不同提取物對小鼠生長性能無明顯作用，可能是受提取方法、添加量、動物品種等因素影響，而基礎(chǔ)飼糧中添加1 200 mg/kg桑葉粗提物顯著提高了小鼠采食量，推測可能是桑葉粗提物中的精油通過特有的氣味刺激神經(jīng)誘發(fā)食欲[10]。

3.2 桑葉提取物對小鼠血清抗氧化功能的影響

3.3 桑葉提取物對小鼠血清生化指標的影響

血清ALT和AST活性可以在一定程度上反映機體肝臟和心臟的健康狀況。桑葉多糖與桑葉提取物1-脫氧野尻霉素(DNJ)具有降血脂和血糖的作用。張入飛等[27]研究表明，桑葉多糖能夠使試驗性糖尿病大鼠的胰島素含量顯著升高，從而降低血糖和血脂。Li等[28]發(fā)現(xiàn)桑葉多糖與DNJ的混合治療具有促胰島素表達的作用，對異糖原誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的肝臟GLU代謝具有調(diào)節(jié)作用。適量桑葉DNJ水提液可以增加脂肪分解代謝酶的活性，加速脂肪動員，促進脂肪消耗[29]。ALB由肝臟合成，血清TP和ALB含量的高低能直接反映機體蛋白質(zhì)合成代謝的強弱[30]，TP含量越高則體蛋白合成效率越高。CREA是動物肌肉分解的主要產(chǎn)物，是腎臟功能強弱的主要評價指標，能反映機體蛋白質(zhì)分解程度的強弱，而UN是蛋白質(zhì)分解的最終產(chǎn)物，含量的高低可以反映飼糧蛋白質(zhì)利用率的高低[31]。當動物機體血液中TC含量過高時會導(dǎo)致血液黏度增加，造成TC堆積血液流通受阻，誘發(fā)動脈粥樣硬化，損傷機體健康。槲皮素衍生物可促進肝臟脂質(zhì)代謝，降低血漿脂質(zhì)含量，抑制肝臟和脂肪細胞引起的脂肪積累[32]。槲皮素已被證明可以改善血脂異常，上調(diào)脂肪細胞基因表達，從而增加脂質(zhì)β氧化[33]。研究發(fā)現(xiàn)對高脂飲食小鼠灌胃適量桑葉水提物，不僅可以抑制脂肪合成，還增加了機體的脂肪分解[34]。經(jīng)過桑葉提取液處理的高脂血癥大鼠降低了血清TC、TG和標準化脂蛋白含量，對高脂血癥大鼠肝臟、腎臟和腦脂質(zhì)過氧化均有抑制作用，對血脂有潛在的治療作用[31]。本研究結(jié)果表明，添加桑葉各提取物的小鼠血清ALT活性及LDL-C、GLU和UN含量無顯著差異，表明飼糧添加桑葉各提取物對小鼠肝臟和心臟無不良影響；添加桑葉正己烷提取物、乙醇提取物、水溶物和粗提物的小鼠血清TP和ALB含量顯著提高，表明桑葉提取物有利于小鼠體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、體內(nèi)代謝及機體健康；飼喂桑葉乙酸乙酯提取物、水溶物、粗提物的小鼠血清HDL-C含量顯著降低，桑葉乙酸乙酯提取物和粗提物顯著降低了血清TG含量，表明桑葉乙酸乙酯提取物和粗提物能改善脂質(zhì)代謝，與前面的研究報道結(jié)果一致；桑葉乙醇提取物顯著降低了小鼠血清CREA含量，表明其可以有效保護腎臟免受損傷。

3.4 桑葉提取物對小鼠肝臟炎癥細胞因子含量的影響

IL-17為促炎性細胞因子，可協(xié)同炎性因子放大炎性效應(yīng)，與機體的炎癥和免疫性疾病等有關(guān)[35]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的主要細胞因子之一，主要通過刺激肝臟產(chǎn)生急性期蛋白參與急性期反應(yīng)，具有調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要因子，適量的TNF-α能介導(dǎo)保護反應(yīng)，但過量則會激活中性粒細胞的吞噬功能，導(dǎo)致細胞損傷。IL-1β主要是由活化的單核/巨噬細胞分泌的多功能細胞因子，在免疫反應(yīng)過程中，能刺激T淋巴細胞分泌IL-2并表達其受體。IL-2、IFN-γ是由TH1細胞分泌的細胞因子，主要參與細胞免疫，主要介導(dǎo)細胞免疫和遲發(fā)性超敏反應(yīng)，并輔助B細胞產(chǎn)生吞噬有關(guān)的抗體。機體在正常情況下，這些炎性細胞因子的產(chǎn)生是機體應(yīng)對病毒或病菌入侵或組織損傷的有益反應(yīng)，但體內(nèi)含量過高則表示機體產(chǎn)生了過度的免疫反應(yīng)，對機體健康產(chǎn)生不利影響[36]。陳曉蘭等[37]比較了不同桑葉提取物對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖作用，結(jié)果表明在桑葉提取物有助于免疫功能的增強。本試驗結(jié)果表明，試糧中桑葉各提取物使小鼠肝臟IL-17、IL-1β和IFN-γ含量明顯升高，IL-2含量顯著下降，激活了免疫反應(yīng)，其有效成分及作用機理有待進一步研究。

4 結(jié) 論

綜合考慮不同方法提取的桑葉提取物的作用效果，本研究初步得出桑葉粗提物效果最好，具體作用效果如下：

① 飼糧中添加桑葉粗提物能夠促進小鼠采食；

② 飼糧中添加桑葉水溶物和粗提物能夠顯著提高小鼠血清GSH-Px和T-SOD活性，提高小鼠抗氧化能力；

③ 飼糧中添加桑葉粗提物顯著提高了小鼠血清中TP和ALB含量，顯著降低HDL-C和TG含量，有效改善小鼠脂質(zhì)代謝；

④ 飼糧中添加桑葉各提取物能夠使小鼠肝臟IL-17、IL-1β和IFN-γ含量明顯升高，IL-2含量顯著下降，激活免疫反應(yīng)。

由此可見，桑葉粗提物可促進小鼠采食，提高小鼠抗氧化能力，激活免疫反應(yīng)，改善脂質(zhì)代謝。