飼糧添加蝦青素對69～74周齡蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、抗氧化能力、生殖激素和卵泡數(shù)量的影響

賀維朝 王 浩 張會艷 趙青余 湯超華 秦玉昌 張軍民*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北動物遺傳資源與營養(yǎng)科學(xué)觀測實驗站，北京 100193)

蛋雞的卵泡發(fā)育不同于哺乳動物，產(chǎn)蛋的母雞會形成一系列不同發(fā)育階段的等級前卵泡(小白卵泡、大白卵泡和小黃卵泡)和等級卵泡，每次會在產(chǎn)蛋序列中挑選1個等級卵泡排出體外，發(fā)育成雞蛋[1]。蛋雞卵巢中成熟排卵的卵泡不足5%，剩余未排卵的卵泡最終退化，這一過程稱為閉鎖[2]。蛋雞產(chǎn)蛋率取決于卵巢功能，而老年蛋雞由于卵泡大量消耗[3]、卵泡閉鎖率升高[1]、生殖激素水平降低[4]和氧化應(yīng)激加劇[5]會導(dǎo)致卵巢功能下降。研究顯示，抗氧化劑可以延緩卵巢衰退[6]。

蝦青素是一種天然類胡蘿卜素，作為一種超強(qiáng)的天然抗氧化劑，可清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，減少衰老細(xì)胞的堆積，改善細(xì)胞微環(huán)境和維持機(jī)體氧化還原平衡[7]。蝦青素常見來源為雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)，雨生紅球藻中蝦青素含量占干重的5%，被譽(yù)為天然蝦青素的“濃縮品”[8]。在體外研究中，蝦青素可以抑制脂質(zhì)過氧化，改善牛卵母細(xì)胞成熟，且在牛黃體細(xì)胞中添加蝦青素可促進(jìn)孕酮(PROG)的產(chǎn)生[9-10]，從而促進(jìn)卵子排出。此外，其他天然類胡蘿卜素可以通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶-1(HO-1)通路，有效改善蛋雞卵巢的氧化應(yīng)激[11]。目前蝦青素多研究其抗氧化特性，作為飼料添加劑對蛋雞激素水平和卵巢發(fā)育的影響未見報道?；谖r青素的抗氧化功能，我們擬通過營養(yǎng)調(diào)控外源添加蝦青素的方式，緩解老年蛋雞卵巢衰退。因此，本研究采用雨生紅球藻來源的天然蝦青素，研究其對蛋雞激素水平和卵巢發(fā)育的影響，為改善老年蛋雞生殖系統(tǒng)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗飼糧中添加的蝦青素來源于雨生紅球藻，購自昆明某公司，其中蝦青素含量為2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因素試驗設(shè)計，選取540只體重[(2.02±0.18)kg]相近、體質(zhì)健康的68周齡海蘭褐產(chǎn)蛋雞，按產(chǎn)蛋率無顯著差異(P>0.05)原則分為6個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加15、30、45和60 mg/kg蝦青素的飼糧。飼糧配方參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，結(jié)合《海蘭褐產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)手冊》配制，各組飼糧等代謝能(ME，11.19 MJ/kg)、等粗蛋白質(zhì)(15.70%)，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗預(yù)試期1周，正試期6周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間，舍內(nèi)光照周期16 h(白天)∶8 h(黑夜)，光照強(qiáng)度15 lx；負(fù)壓通風(fēng)結(jié)合自然通風(fēng)，舍溫(18±2)℃，相對濕度45%～60%。采用3層蛋雞籠飼養(yǎng)試驗雞，每籠3只，自由采食和飲水。每日喂料3次，撿蛋1次，每3 d帶雞消毒1次，清糞1次，試驗期內(nèi)常規(guī)免疫。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能

試驗期間，每日按重復(fù)記錄蛋重和產(chǎn)蛋數(shù)，每周統(tǒng)計耗料量1次。計算試驗期內(nèi)的產(chǎn)蛋率、平均日產(chǎn)蛋量、平均蛋重、平均日采食量及料蛋比。

1.4.2 樣品采集與制備

在試驗期末，每重復(fù)取3枚雞蛋用于雞蛋品質(zhì)測定。每重復(fù)選取1只雞，翅靜脈采血5 mL，25 ℃ 4 000×g離心10 min，取上清液用于測定雞卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)和PROG 3種生殖激素含量。隨后進(jìn)行屠宰，取卵巢部分組織，放在甲醛溶液(4%)中固定，固定組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片，最后鏡檢。剩余組織液氮凍存，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 蛋品質(zhì)

雞蛋蛋白高度、哈氏單位、蛋黃顏色(羅氏比色單位)測定采用SONOVA蛋品質(zhì)自動分析儀(Egg Analyzer,Orka Technology Ltd.)測定；蛋殼強(qiáng)度采用蛋殼強(qiáng)度測定儀(Egg Force Reader,Orka Technology Ltd.)測定；蛋黃顏色CIELAB值[亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)]采用CR-400色差儀(Chroma Meter,Konica Minolta Investment Ltd.)測定。用雞蛋分離器將蛋黃與蛋清分離，稱量蛋黃重，計算蛋黃占全蛋的百分比(蛋黃比例)。

1.4.4 卵巢抗氧化指標(biāo)

卵巢組織總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)采用D-8PCS紫外分光光度計(Ultraviolet Spectrophotometer,Nanjing Philes Ltd.)測定，丙二醛(MDA)含量采用Infinite F50酶標(biāo)儀(Microplate Reader,Tecan Trading Ltd.)測定。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4.5 血清生殖激素含量

血清中FSH、LH和PROG含量采用Infinite F50酶標(biāo)儀(Microplate Reader,Tecan Trading Ltd.)進(jìn)行測定，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4.6 卵巢卵泡數(shù)量

在光學(xué)顯微鏡100×鏡下觀察組織形態(tài)，進(jìn)行初級卵泡細(xì)胞和次級卵泡細(xì)胞(根據(jù)顆粒細(xì)胞層數(shù)，單層為初級卵泡細(xì)胞，多層為次級卵泡細(xì)胞，只記錄細(xì)胞核直徑≤1 mm的次級卵泡細(xì)胞)計數(shù)，求出每個卵巢上的初級卵泡總數(shù)、次級卵泡總數(shù)和閉鎖次級卵泡數(shù)，并計算次級卵泡閉鎖率[12]。計算公式如下：

P=A×M/(M+L)。

式中：P為卵巢中初級或次級卵泡總數(shù)；A為所查切片平均每張卵泡數(shù)量×切片數(shù)量；M為每張切片厚度；L為初級或次級卵母細(xì)胞核平均直徑。

每例樣本3張HE染色切片，選取1處典型視野，光鏡下觀察不同分組卵巢細(xì)胞形態(tài)，按細(xì)胞直徑分為初級卵泡、小白、大白和小黃卵泡并計數(shù)[13]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；飼糧蝦青素添加水平與測定指標(biāo)的效應(yīng)關(guān)系采用正交多項式中的線性和二次多項式進(jìn)行比較。以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加蝦青素對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，試驗期內(nèi)，與對照組相比，飼糧添加不同水平蝦青素對蛋雞產(chǎn)蛋率均無顯著影響(P>0.05)，各組產(chǎn)蛋率均在89%以上；各組蛋雞平均蛋重、平均日產(chǎn)蛋量、平均日采食量和料蛋比均無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧添加蝦青素對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 飼糧添加蝦青素對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，試驗期內(nèi)，與對照組相比，飼糧添加不同水平蝦青素對雞蛋蛋殼強(qiáng)度和蛋黃比例均無顯著影響(P>0.05)；飼糧添加蝦青素可提高蛋白高度和哈氏單位，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；飼糧添加蝦青素可顯著提高蛋黃顏色(P<0.05)，且60 mg/kg蝦青素添加組蛋黃顏色平均值可達(dá)12.95，同時，蛋黃顏色與蝦青素添加水平呈顯著線性和二次關(guān)系(P<0.05)。與對照組相比，飼糧添加蝦青素顯著降低了蛋黃L*和b*值(P<0.05)，顯著提高了蛋黃a*值(P<0.05)，且蛋黃L*值與蝦青素添加水平呈顯著線性和二次關(guān)系(P<0.05)，蛋黃a*值隨蝦青素添加水平的升高呈顯著線性升高(P<0.05)。

表3 飼糧添加蝦青素對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 飼糧添加蝦青素對蛋雞卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，試驗期內(nèi)，與對照組相比，飼糧添加不同水平蝦青素對蛋雞卵巢T-AOC無顯著影響(P>0.05)；60 mg/kg蝦青素添加組蛋雞卵巢T-SOD活性顯著提高(P<0.05)，且卵巢T-SOD活性隨蝦青素添加水平的升高呈顯著線性升高(P<0.05)；飼糧添加蝦青素可顯著降低卵巢MDA含量(P<0.05)，且卵巢MDA含量與蝦青素添加水平呈顯著線性和二次關(guān)系(P<0.05)。

表4 飼糧添加蝦青素對蛋雞卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 飼糧添加蝦青素對蛋雞血清生殖激素含量的影響

由表5可知，試驗期內(nèi)，與對照組相比，飼糧添加不同水平蝦青素可顯著提高蛋雞血清FSH和LH含量(P<0.05)，其中45 mg/kg蝦青素添加組血清FSH和LH含量最高；飼糧添加蝦青素同樣顯著提高血清PROG含量(P<0.05)，其中45 mg/kg蝦青素添加組血清PROG含量最高。蛋雞血清FSH、LH和PROG含量與蝦青素添加水平呈顯著線性和二次關(guān)系(P<0.05)。

表5 飼糧添加蝦青素對蛋雞血清生殖激素含量的影響

2.5 飼糧添加蝦青素對蛋雞卵巢卵泡數(shù)量的影響

由表6可知，試驗期內(nèi)，與對照組相比，飼糧添加不同水平蝦青素可顯著提高蛋雞卵巢初級卵泡和次級卵泡數(shù)量(P<0.05)，顯著降低卵巢次級卵泡閉鎖率(P<0.05)，其中60 mg/kg蝦青素添加組卵巢次級卵泡閉鎖率最低。等級前卵泡的對比結(jié)果顯示，與對照組相比，飼糧添加蝦青素可顯著提高卵巢小白卵泡、大白卵泡和小黃卵泡數(shù)量(P<0.05)，其中60 mg/kg蝦青素添加組卵巢等級前卵泡數(shù)量最多。蛋雞卵巢卵泡數(shù)量隨蝦青素添加水平的升高呈顯著線性升高(P<0.05)，卵巢次級卵泡閉鎖率隨蝦青素添加水平的升高呈顯著線性降低(P<0.05)。

表6 飼糧添加蝦青素對蛋雞卵巢卵泡數(shù)量的影響

3 討 論

3.1 飼糧添加蝦青素對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

Heng等[14]在飼糧中分別添加20、40、80和160 mg/kg的蝦青素，試驗結(jié)果顯示飼糧中添加蝦青素對蛋雞平均蛋重和料蛋比無顯著改善作用。在本試驗中，飼糧添加蝦青素后，蛋雞的生產(chǎn)性能指標(biāo)均無顯著變化，原因可能是蝦青素對蛋雞的消化吸收沒有顯著影響，所以產(chǎn)蛋率沒有發(fā)生顯著變化，進(jìn)而料蛋比無顯著差異[15]。此外，由于蝦青素的生物學(xué)功能多以抗氧化為基礎(chǔ)[16]，而生產(chǎn)性能與飼糧中蛋白質(zhì)和能量代謝的相關(guān)程度較高。因此，飼糧添加的蝦青素通常對蛋雞生產(chǎn)性能無顯著影響或是有小幅改善作用[17]。

3.2 飼糧添加蝦青素對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

蛋白高度和哈氏單位與蛋清中的卵黏蛋白關(guān)系密切[18]，而蝦青素作為一種脂溶性類胡蘿卜素主要存在于蛋黃中。前人研究顯示，飼糧添加蝦青素對雞蛋哈氏單位和蛋殼強(qiáng)度均無顯著影響[14]，本試驗與前人結(jié)果一致。蛋黃顏色是消費(fèi)者購買雞蛋的重要指標(biāo)，消費(fèi)者往往更青睞蛋黃顏色深的雞蛋。蝦青素作為天然色素，可以用于蛋黃著色，并且蛋黃顏色與蝦青素添加水平呈正相關(guān)[19]。本試驗結(jié)果與前人研究相似，蛋黃顏色隨蝦青素添加水平的升高顯著升高，60 mg/kg蝦青素添加組蛋黃顏色最高。通過CIELAB值進(jìn)一步分析蛋黃顏色可知，蛋黃中的蝦青素主要提高了蛋黃顏色的a*值，同時降低了L*和b*值。這是因為蛋黃顏色主要受飼糧中脂溶性色素的影響[20]，當(dāng)飼喂玉米-豆粕型飼糧時，玉米黃質(zhì)是形成蛋黃顏色的主要因素。蝦青素暗紅色的特性使蛋黃顏色a*值升高，降低了玉米黃質(zhì)L*和b*值的表現(xiàn)，在二者共同作用下使羅氏比色單位提高[17,21]。

3.3 飼糧添加蝦青素對蛋雞卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激是卵巢衰老過程中的主要因素[22]。抗氧化指標(biāo)是評判機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要參考依據(jù)，氧化自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御之間的動態(tài)平衡是維持穩(wěn)態(tài)的重要前提[23]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種有效的酶促抗氧化劑，SOD通過催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，從而減輕超氧陰離子自由基對機(jī)體的損害[24]。SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[25]。蝦青素可以通過優(yōu)先結(jié)合超氧陰離子自由基等促氧化物質(zhì)，通過自身環(huán)氧化和共軛雙鍵斷裂增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能[26-27]。本試驗中，與對照組相比，飼糧添加60 mg/kg蝦青素可以顯著提高蛋雞卵巢T-SOD活性，從而提高卵巢清除氧自由基的能力。MDA是非酶系統(tǒng)攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，是反映細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)[28]。Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠飼喂游離蝦青素粉末可以降低血漿和肝臟中MDA含量，并且使肝臟中過氧化氫酶活性以及谷胱甘肽含量顯著提高。本試驗中，與對照組相比，飼糧添加蝦青素使得蛋雞卵巢中MDA含量顯著降低，且60 mg/kg蝦青素添加組卵巢MDA含量最低，表明蝦青素可以有效抑制卵巢中的脂質(zhì)過氧化。

3.4 飼糧添加蝦青素對蛋雞血清生殖激素含量和卵巢卵泡數(shù)量的影響

蛋雞是一個生殖系統(tǒng)高頻率使用的模型，蛋雞卵泡發(fā)育不同于哺乳動物，產(chǎn)蛋時會形成一系列的優(yōu)勢卵泡，逐個發(fā)育成熟。蛋雞由產(chǎn)蛋高峰期逐漸轉(zhuǎn)為高峰后期時，進(jìn)入等級發(fā)育的卵泡數(shù)量減少、卵泡閉鎖率升高和老齡化會導(dǎo)致產(chǎn)蛋率急劇下降[10,30]。本試驗中，飼糧添加蝦青素顯著提高了蛋雞卵巢卵泡數(shù)量，顯著降低了卵巢次級卵泡閉鎖率。這可能是老齡化導(dǎo)致蛋雞卵巢卵泡質(zhì)量下降，從而放大了蝦青素的抗氧化特性。生殖激素合成的主要場所是線粒體，并且大部分合成酶都在線粒體內(nèi)膜上[31]。蝦青素作為一種抗氧化劑能緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙[32]。PROG作為一種生殖激素，在本試驗中，與對照組相比，試驗組蛋雞血清PROG含量顯著提高，說明蝦青素可能對卵巢中線粒體起到一定保護(hù)作用。下丘腦-垂體-卵巢軸被認(rèn)為是卵泡發(fā)育成熟的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，這一調(diào)控途徑激素發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[33]。本試驗中，飼糧添加蝦青素顯著提高了蛋雞血清FSH和LH這2種生殖激素含量，這可能是蝦青素首先影響卵巢軸PROG的分泌，并通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)刺激FSH和LH釋放。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，飼糧添加蝦青素對69～74周齡蛋雞生產(chǎn)性能無顯著影響，但可以顯著增強(qiáng)卵巢抗氧化能力，提高血清生殖激素水平，增加卵巢中的卵泡數(shù)目，降低次級卵泡閉鎖率；其中，60 mg/kg蝦青素添加水平對于增強(qiáng)蛋雞抗氧化能力和改善卵泡數(shù)量效果最好。