芝麻子粒脂肪酸主要組分的近紅外光譜模型建立及特征分析

袁青麗，苗紅梅，馬琴，琚銘，張欣童，張海洋

（河南省特色油料作物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南 鄭州 450002）

芝麻是我國(guó)重要的特色優(yōu)質(zhì)油料作物，其子粒含有豐富的不飽和脂肪酸（如油酸和亞油酸）以及木酚素等抗氧化物質(zhì)，素有“油料皇后”之稱[1～3]。芝麻屬于小子粒作物，采用傳統(tǒng)的子粒品質(zhì)分析方法往往需要耗費(fèi)較多的子粒樣本，且測(cè)定成本高、周期長(zhǎng)。為實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)芝麻子粒樣本的含油量和脂肪酸主要組分等品質(zhì)性狀，加快芝麻品質(zhì)遺傳育種研究進(jìn)程，建立適于芝麻子粒的無(wú)破損、快速精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)方法十分必要。

近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技術(shù)是20 世紀(jì)80 年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)無(wú)損物理分析技術(shù)[4，5]。有機(jī)化學(xué)物質(zhì)在780～2 526 nm 光譜范圍內(nèi)的吸收特性表明，不同的物質(zhì)在NIRS 區(qū)會(huì)產(chǎn)生不同的光譜。利用NIRS 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品一種或多種組分的定性和定量分析[6]，目前該技術(shù)已在芝麻[7～10]、大豆[11]和油菜[12]等油料作物子粒品質(zhì)（含油量、蛋白質(zhì)含量、含水量等）檢測(cè)上得到了廣泛應(yīng)用。在種子脂肪酸組分測(cè)定方面，何小三等[13]建立了茶油脂肪酸近紅外模型，各脂肪酸含量Q 值均＞0.6，能夠用于茶油樣品品質(zhì)的快速測(cè)定。李建國(guó)等[14]建立了單?；ㄉ舅峤t外模型，為花生高油酸的篩選提供了很大幫助。王鐸等[15]應(yīng)用NIRS 技術(shù)測(cè)定了大豆脂肪酸含量，誤差范圍控制在1.5%左右。在芝麻子粒品質(zhì)和脂肪酸組成成分分析方面，Sato 等[16]最早采用近NIRS 技術(shù)測(cè)定了芝麻脂肪酸主要組分，并對(duì)近紅外光學(xué)圖譜測(cè)定和化學(xué)法測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行了多線性回歸分析和比較，結(jié)果顯示，利用NIRS 技術(shù)可以快速測(cè)定脂肪酸含量，但是粒色對(duì)定標(biāo)模型的準(zhǔn)確性影響較大。前期我們利用NIRS 儀器對(duì)黃白和黑褐芝麻子粒的水分、油分和蛋白質(zhì)含量分別建立了定標(biāo)模型，并用于芝麻品質(zhì)性狀遺傳分析。本研究采用NIRS 法，擬進(jìn)一步進(jìn)行芝麻子粒脂肪酸組分的快速鑒定。

為建立精準(zhǔn)測(cè)定芝麻脂肪酸組分含量的NIRS 技術(shù)方法，本研究選用116 份代表性黃白芝麻種質(zhì)材料，采用改進(jìn)偏最小偏二乘法技術(shù)（MPLS），開(kāi)展了黃白芝麻子粒油酸、亞油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量的定標(biāo)決定系數(shù)（RSQ）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SEC）、交互決定系數(shù)（RSQV）和交互標(biāo)準(zhǔn)偏差（SECV）等參數(shù)比較分析，將氣相色譜法測(cè)定值與NIRS 法預(yù)測(cè)值擬合，建立了精準(zhǔn)的芝麻油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量的NIRS 模型。同時(shí)，利用構(gòu)建的芝麻主要脂肪酸組分NIRS 模型，開(kāi)展了芝麻不同種質(zhì)中主要脂肪酸組分的變化范圍及其關(guān)系分析，以期為今后加快芝麻子粒品質(zhì)特性分析和遺傳育種相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試芝麻種質(zhì)為116 份代表性黃白芝麻，來(lái)自13 個(gè)國(guó)家，其中中國(guó)99份、印度2份、緬甸2份、墨西哥2份、美國(guó)1 份、烏干達(dá)1 份、越南1 份、日本1 份、希臘2份、委內(nèi)瑞拉2 份、土耳其1 份、尼日爾1 份、巴拉圭1份。其粒色涉及白、黃等色，L 值（代表暗亮度）、a 值（代表綠紅度）、b 值（代表藍(lán)黃度） 分別為42.03～67.83、4.02～11.32 和16.82～28.12。均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心種質(zhì)資源庫(kù)保存并提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 子粒脂肪酸組分測(cè)定

1.2.1.1 氣相色譜法（國(guó)標(biāo)法）。（1）油分提取。各芝麻種質(zhì)樣本均取成熟子粒10 g 左右，研磨粉碎，采用傳統(tǒng)索氏抽提法提取油分。（2）脂肪酸組分測(cè)定。參考劉曉穎等[17]的方法，采用氣相色譜法檢測(cè)脂肪酸的主要組成及其含量。氣相色譜條件：色譜柱為HP-88 毛細(xì)管柱（100 mm×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器溫度為280 ℃；空氣流速為450 mL/min，H2流速為40 mL/min；N2流速為2 mL/min；分流比設(shè)定為100 ∶1。升溫程序：初始溫度為180 ℃，以4 ℃/min 升至220 ℃，再以1 ℃/min升溫至240 ℃。進(jìn)樣量1 μL。

1.2.1.2 NIRS 法。將待測(cè)芝麻子粒樣品直接倒入取樣杯中輕輕壓實(shí)，蓋上金屬反射板，使用NIRS 儀（法國(guó)肖邦Spectra Star XT）進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)條件：溫度范圍為10～30 ℃，掃描濕度范圍為30%～70%；波長(zhǎng)分辨率：1 nm；掃描次數(shù)：12 次。光譜散射前處理方法：標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）+去趨勢(shì)矯正（detrend）+一階導(dǎo)數(shù)（1stderivative）。每份樣品重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算平均吸收光譜作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.2 NIRS 檢測(cè)模型外部驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證定標(biāo)模型的可靠性，隨機(jī)選取芝麻種質(zhì)20 份，采用已建好的定標(biāo)模型進(jìn)行NIRS 檢測(cè)。同時(shí)，采用氣相色譜法（國(guó)標(biāo)法）測(cè)定上述樣本的脂肪酸組分。以氣相色譜法測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，利用NIRS 檢測(cè)結(jié)果對(duì)建好的定標(biāo)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Execl、SPSS 和Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻種質(zhì)子粒的脂肪酸組成及其含量（國(guó)標(biāo)法）

檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，芝麻子粒的脂肪酸組分包括油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸，含量分布分別為35.05%～51.79%、31.58%～47.77%、7.17%～11.26%、4.35%～7.26%、0.07%～0.89%、0.45%～0.85%和0.21%～0.54%，平均含量依次為43.87%、40.94%、8.61%、5.45%、0.11%、0.61%和0.29%。表明芝麻子粒脂肪酸的主要組分是油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸含量均相對(duì)較低。

表1 試驗(yàn)芝麻種質(zhì)子粒的脂肪酸組分及其含量Table 1 The fatty acid compositions and contents in sesame germplasm tested

根據(jù)GB 4882—85，偏度系數(shù)=0 時(shí)，數(shù)據(jù)符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布，其中偏度系數(shù)為正數(shù)時(shí)屬于左偏，反之為右偏；偏度系數(shù)＞1 時(shí)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布。4 種主要脂肪酸組分的偏度系數(shù)值為-0.43～0.76，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布；棕櫚油酸、亞麻酸含量的偏度系數(shù)分別為6.35 和1.90，二者數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布。

圖2 不同芝麻種質(zhì)亞油酸含量的分布Fig.2 Distribution of linoleic acid content in different sesame germplasm

圖3 不同芝麻種質(zhì)棕櫚酸含量的分布Fig.3 Distribution of palmitic acid content in different sesame germplasm

圖4 不同芝麻種質(zhì)硬脂酸含量的分布Fig.4 Distribution of stearic acid content in different sesame germplasm

對(duì)116 份樣本的油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量分布變化進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1～4）顯示，油酸和亞油酸含量的峰值分別在44.0%和42.0%左右，棕櫚酸和硬脂酸含量的峰值則集中在8.5%和5.5%左右；且4 種主要脂肪酸組分在116 份樣本中均表現(xiàn)出了明顯的梯度變化，符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布特征。

圖1 不同芝麻種質(zhì)油酸含量的分布Fig.1 Distribution of oleic acid content in different sesame germplasm

2.2 芝麻種質(zhì)子粒的NIRS 分析

掃描結(jié)果（圖5）顯示，在光波800～2 600 nm 范圍內(nèi)，不同芝麻種質(zhì)子粒樣品形成的NIRS 曲線趨勢(shì)相同，體現(xiàn)了材料的同質(zhì)性；但不同種質(zhì)子粒樣品的吸光度峰值并不完全一樣，說(shuō)明不同樣本間脂肪酸組分存在差異。

圖5 不同芝麻種質(zhì)子粒近紅外吸收光譜圖Fig.5 NIRS spectra of different sesame germplasm

2.3 NIRS 檢測(cè)模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證

為進(jìn)一步分析光譜曲線及吸光度峰值與子粒脂肪酸組分含量的關(guān)系，采用Unity Scientific program 軟件，使用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）+去趨勢(shì)矯正（detrend）+一階導(dǎo)數(shù)（1st derivative）光譜處理和改進(jìn)偏最小偏二乘法技術(shù)（MPLS）數(shù)據(jù)處理對(duì)樣本的原始光譜圖進(jìn)行分析，建立了芝麻子粒油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸的定標(biāo)模型。根據(jù)理想模型衡量原則[18]，RSQ 和RSQV越接近于1、SEC/SECV 越小，模型越理想。

定標(biāo)結(jié)果（表2）顯示，油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸的RSQ、SEC、RSQV、SECV、SEC/SECV 分別為0.780～0.986、0.169～0.462、0.562～0.941、0.288～0.713 和0.578～0.728，差異均較大，其中，亞油酸含量的RSQ 和RSQV 最高，SEC/SECV 最小，所建模型相關(guān)性最好；油酸含量的RSQ 和RSQV 分別為0.981和0.919，均接近于1，所建模型相關(guān)性較好；棕櫚酸、硬脂酸的RSQ 和RSQV 均相對(duì)較低，SEC/SECV分別為0.587 和0.727，所建模型相關(guān)性相對(duì)較差。

表2 NIRS 定標(biāo)模型參數(shù)分析Table 2 Parameter analysis of NIRS calibration model

2.4 NIRS 檢測(cè)模型外部驗(yàn)證

隨機(jī)選取芝麻種質(zhì)20 份，分別采用已建好的定標(biāo)模型進(jìn)行NIRS 檢測(cè)。同時(shí)，采用氣相色譜法（國(guó)標(biāo)法）測(cè)定上述樣本的4 種主要脂肪酸組分。以氣相色譜法測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，利用NIRS 檢測(cè)結(jié)果對(duì)建好的定標(biāo)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，2 種方法的芝麻種質(zhì)油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量絕對(duì)誤差范圍分別為-1.18%～1.49%、-0.78%～3.10%、-0.49%～0.61%和-1.75%～-1.01%。驗(yàn)證樣品中，油酸和亞油酸含量較為均勻地分布在回歸線兩側(cè)（表6 和7），外部驗(yàn)證決定系數(shù)R2分別為0.948 0 和0.936 8，表明NIRS 檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了樣本子粒的油酸和亞油酸含量；硬脂酸含量和棕櫚酸含量外部驗(yàn)證系數(shù)R2分別為0.458 0 和0.662 8，樣品數(shù)據(jù)較為分散（表8 和9），表明這2 個(gè)指標(biāo)的NIRS 預(yù)測(cè)值與國(guó)標(biāo)法測(cè)定值相關(guān)性相對(duì)較差。

表3 氣相色譜法與NIRS 法測(cè)定的脂肪酸含量比較Table 3 Comparison of fatty acid content between GC-MS and NIRS （%）

圖6 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質(zhì)油酸含量測(cè)定結(jié)果的相關(guān)分析Fig.6 Correlation analysis of oleic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖7 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質(zhì)亞油酸含量測(cè)定結(jié)果的相關(guān)分析Fig.7 Correlation analysis of linoleic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖8 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質(zhì)棕櫚酸含量測(cè)定結(jié)果的相關(guān)分析Fig.8 Correlation analysis of palimtic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖9 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質(zhì)硬脂酸含量測(cè)定結(jié)果的相關(guān)分析Fig.9 Correlation analysis of stearic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

3 結(jié)果與討論

NIRS 技術(shù)分析速度快、效率高，當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧、食品、石油、化工等領(lǐng)域[19，20]。在芝麻[21]、大豆[22]、花生[23]、油菜[12]、亞麻籽[24]、向日葵[25]等油料作物的油分和蛋白質(zhì)等品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)方面均有所應(yīng)用，為育種工作提供了較好的數(shù)據(jù)支持[26，27]。

芝麻子粒中的脂肪酸主要組分為油酸和亞油酸，占脂肪酸總量的70%以上；其次是硬脂酸和棕櫚酸；棕櫚油酸、亞麻酸和花生酸含量相對(duì)較少[28]。為了準(zhǔn)確檢測(cè)芝麻子粒的脂肪酸主要組分，本研究選擇來(lái)自13 個(gè)國(guó)家的116 份代表性黃白芝麻種質(zhì)的成熟子粒進(jìn)行了NIRS 檢測(cè)和模型分析，與已有研究[8，29]相比，所用材料來(lái)源廣（來(lái)自13 個(gè)國(guó)家）、數(shù)量多（116份）、粒色范圍寬（L 值42.03～67.83）[30]，為后期模型應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究采用傳統(tǒng)索氏抽提法提取子粒油分，應(yīng)用氣相色譜法檢測(cè)脂肪酸組分及其含量，結(jié)果顯示，116 份黃白芝麻子粒中，脂肪酸的主要組分為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，含量分布范圍分別為35.05%～51.79%、31.58%～47.77%、7.17%～11.26%和4.35%～7.26%，各指標(biāo)最高值與最低值差別均較大。表明本研究所用試驗(yàn)樣本代表性強(qiáng)，有利于構(gòu)建可靠的檢測(cè)模型。芝麻子粒中的油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量較高，而棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸含量（均＜1%）相對(duì)較低，因此，在進(jìn)行NIRS 模型構(gòu)建和評(píng)價(jià)時(shí)針對(duì)4 個(gè)主要組分進(jìn)行。

本研究結(jié)果顯示，在構(gòu)建的NIRS 模型中，芝麻亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量的RSQ 分別為0.986、0.981、0.898 和0.780。尤其亞油酸和油酸含量的NIRS 模型能夠很好地反映出不同樣本中2 個(gè)脂肪酸組分的真實(shí)含量，其中亞油酸含量的RSQV（0.941） 最高、SEC/SECV （0.577） 最小，所建模型相關(guān)性最好。棕櫚酸和硬脂酸的RSQV 分別為0.748和0.562，SEC/SECV 分別為0.587 和0.727，所建模型相關(guān)性較油酸和亞油酸略差，這可能與芝麻子粒中硬脂酸（4.35%～7.26%）和棕櫚酸含量（7.17%～11.26%）較低以及含量在子粒不同部位分布不均勻[31]有關(guān)。

選擇20 份芝麻種質(zhì)樣本，對(duì)基于116 份樣本建立的NIRS 模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，結(jié)果顯示，樣本中4種主要脂肪酸組分含量的預(yù)測(cè)值與國(guó)標(biāo)法測(cè)定值的絕對(duì)誤差均控制在1.50%以內(nèi)，表明采用NIRS 模型能夠快速、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)黃白芝麻子粒的主要脂肪酸組成含量。此方法快速提高了脂肪酸含量的測(cè)定效率，也為脂肪酸含量高、中、低水平的篩選提供了幫助。