遠(yuǎn)安黃茶啤酒抗氧化物質(zhì)的分離與鑒定

楊麗霞，吳殿輝，魯振東，陸 健*

（工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵作用釀制而成的飽含二氧化碳的低乙醇含量酒，被稱為“液體面包”，是世界上歷史最悠久、普及范圍最廣的乙醇飲料之一。大量文獻(xiàn)報(bào)道，啤酒具有抗氧化性，且酚類化合物是啤酒中最主要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，具有較強(qiáng)的自由基清除能力[1-3]。確定啤酒中酚類物質(zhì)的含量和組成與內(nèi)源性抗氧化力之間的關(guān)系一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)。Piazzon等[4]研究表明，不同種類的啤酒之間，總酚含量和各種酚酸含量有較大的差別，丁香酸、芥子酸、咖啡酸和阿魏酸是對(duì)啤酒抗氧化力起主要貢獻(xiàn)的酚酸。Zhao Haifeng等[5]證實(shí)了原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸以及丁香酸和5種抗氧化力評(píng)價(jià)指標(biāo)之間顯著正相關(guān)，且酚類物質(zhì)對(duì)啤酒內(nèi)源性抗氧化力的貢獻(xiàn)在60%以上。

另一方面，茶葉作為人類最佳的天然保健飲料，在我國歷史上有著源遠(yuǎn)流長的飲用紀(jì)錄，且備受人們的青睞。茶葉的抗氧化活性是其功能開發(fā)方面的重要內(nèi)容之一，研究表明茶葉中起抗氧化作用的成分主要有茶多酚及其衍生產(chǎn)物、茶多糖、生物堿、維生素以及微量元素鋅、錳、銅和硒等[6-8]。茶多酚是茶葉抗氧化能力的主要影響因素，其中以兒茶素為主體的黃烷醇類占茶多酚總量的60%～80%，包括表兒茶素（epicatechin，EC）、 表沒食子兒茶素（(-)-epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（(-)-epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）[9]。羅冬蘭等[10]比較了貴州5種茶葉的抗氧化性成分和抗氧化活性，相關(guān)性分析表明，茶多酚與抗氧化性指標(biāo)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。周金偉等[11]分析了不同類型茶葉體外抗氧化能力，結(jié)果也表明抗氧化能力均與茶多酚及兒茶素含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），證實(shí)了酚類物質(zhì)對(duì)茶葉抗氧化能力的影響。因此，在啤酒釀造過程中添加茶葉，可以有效浸取茶葉中的酚類物質(zhì)，提高成品啤酒的抗氧化活性。

目前對(duì)啤酒中抗氧化物質(zhì)的研究，大多是基于文獻(xiàn)報(bào)道的已知化合物，缺乏對(duì)其抗氧化物質(zhì)確切組成的深入研究。茶葉和啤酒中的抗氧化物質(zhì)較多，在明確起主要抗氧化作用的化合物方面存在一定的困難。因此，對(duì)茶啤酒的單體抗氧化物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定具有一定的理論指導(dǎo)意義。前期實(shí)驗(yàn)通過在啤酒中添加31種不同類型的茶葉，并對(duì)成品啤酒的抗氧化活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)安黃茶啤酒的抗氧化活性最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)以遠(yuǎn)安黃茶啤酒為研究對(duì)象，基于體外抗氧化活性為導(dǎo)向的策略[12]，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical-scavenging activity，DSA）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用溶劑萃取、樹脂吸附、半制備高效液相色譜法對(duì)啤酒中的抗氧化物質(zhì)進(jìn)行分離制備，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupoletime-of-flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）鑒定，以明確影響遠(yuǎn)安黃茶啤酒抗氧化活性的關(guān)鍵單體化合物。本研究結(jié)果將有助于深入了解茶啤酒抗氧化物質(zhì)的來源，并促進(jìn)茶葉加工，對(duì)選擇性提高茶啤酒抗氧化活性具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)安黃茶為市售茶樣，2020年產(chǎn)，于-20 ℃貯藏備用；大孔樹脂 西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；加麥Metcalf 江蘇海越麥芽有限公司；澳麥Scope 中糧麥芽有限公司；馬格努門啤酒花、卡斯卡特啤酒花 美國雅基瑪酒花公司；干酵母S-189弗曼迪斯公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性VE）（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 上海麥克林生化科技有限公司；EC、EGC、EGCG、ECG、柯里拉京（corilagin，Cor）、色氨酸（Trp） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水；其他試劑均為市售分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

YQ-PJ-6B型自動(dòng)糖化儀 西安輕機(jī)所光電公司；WFZ UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 蘇州賽恩斯儀器有限公司；SCIENTZ-10N普通型冷凍干燥機(jī)寧波新芝超聲設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜儀、1260半制備型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；UPLC-Q-TOF-MS儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 遠(yuǎn)安黃茶啤酒發(fā)酵

稱取大麥麥芽粉碎過2 目篩后，以料水比1∶3.5（g/mL）注入純凈的自來水，待液化完全后，置于糖化儀中45 ℃糖化30 min，接著于63 ℃糖化70 min，再于72 ℃條件下糖化，直到碘試無反應(yīng)為止，最后于78 ℃保持10 min終止反應(yīng)，糖化結(jié)束，過濾。麥汁煮沸60 min，酒花采用兩次添加法。煮沸開始10 min后，加0.25‰的馬格努門啤酒花；煮沸結(jié)束10 min前，加0.15‰的卡斯卡特啤酒花。定型麥汁濃度控制在12 °P。向冷卻后的麥汁中接入下面啤酒酵母S189，接種量1‰。添加2 g/L的遠(yuǎn)安黃茶后，加發(fā)酵栓于12 ℃發(fā)酵，待日質(zhì)量損失小于0.2 g時(shí)，主發(fā)酵完成。于4 ℃貯存7 d。過濾后備用。

1.3.2 DSA測定

參照嚴(yán)敏等[13]的方法，略作修改。

茶啤酒稀釋80 倍（蒸餾水稀釋）后取2 mL，與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液加入同一10 mL棕色離心管，搖勻，室溫避光靜置30 min，以無水乙醇為空白于517 nm測其吸光度，按式（1）計(jì)算清除率：

式中：Ao為2.0 mL無水乙醇溶液+2.0 mL DPPH-乙醇溶液的吸光度；Ax為2.0 mL啤酒+2.0 mL DPPH-乙醇溶液的吸光度；Axo為2.0 mL啤酒+2.0 mL無水乙醇溶液的吸光度。

以水溶性VE為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=974.81X-5.694 4，R2=0.999（X為VE濃度，Y為相應(yīng)的清除率）。啤酒的DSA以Trolox當(dāng)量計(jì)算，單位為mmol/L。

1.3.3 啤酒前處理

取1 L除氣啤酒，加入4 倍體積的無水乙醇，于4 ℃靜置24 h抽取上清液，將乙醇相（I）和沉淀相（II）在40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并冷凍干燥48 h，計(jì)算各組分得率。凍干組分用100 mL乙醇-水（5∶95，V/V）復(fù)溶后，測定DSA。

1.3.4 有機(jī)溶劑萃取

乙醇相（I）用乙酸乙酯（3h100 mL）萃取。將合并的乙酸乙酯相（組分I-1）和水相（組分I-2）在40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除有機(jī)溶劑，并冷凍干燥48 h，計(jì)算各組分得率。凍干組分用10 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液復(fù)溶后，測定DSA。

1.3.5 大孔樹脂吸附

為提高組分I-2的分離純化效果，利用大孔樹脂進(jìn)一步分離。通過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，從常用的大孔樹脂中選出最佳大孔樹脂，然后用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫分離。

1.3.5.1 樹脂的預(yù)處理

使用95%乙醇溶液浸泡大孔樹脂24 h后，使用蒸餾水清洗大孔樹脂，直至流出液無明顯乙醇?xì)馕?、清澈透明、無渾濁物。再經(jīng)1 mol/L的HCl和4%的NaOH溶液重復(fù)處理2次，以去除樹脂在合成過程中的雜質(zhì)，避免對(duì)樣品的吸附造成影響，然后用蒸餾水洗至中性備用。

1.3.5.2 樹脂的篩選

選取6種不同型號(hào)的大孔樹脂，根據(jù)各種大孔樹脂的物理參數(shù)和靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的比較，選出最適合的大孔樹脂來分離純化啤酒中的抗氧化物質(zhì)。將預(yù)處理好的不同類型的樹脂稱取3 g，置于錐形瓶中，分別向每個(gè)錐形瓶中加入10 mL待吸附液，振蕩2 h，使樹脂能充分吸附，最后將吸附后的樹脂過濾出來，測定其DSA，并按照式（2）計(jì)算大孔樹脂的吸附率：

式中：C0為溶液的初始DSA/（mmol/L）；Ca為大孔樹脂達(dá)到吸附平衡時(shí)溶液的DSA/（mmol/L）。

在已吸附飽和的樹脂中，加入10 mL 95%乙醇溶液，振蕩2 h，然后過濾出洗脫液，測定DSA并按式（3）計(jì)算大孔樹脂解吸率：

式中：Cr為洗脫液的DSA/（mmol/L）；V0、Vr分別為上樣液和洗脫液的體積/mL。

1.3.5.3 大孔樹脂洗脫

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)篩選出的大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后采用濕法裝入16 mmh500 mm的層析柱中。將凍干后的I-2組分用蒸餾水分配成質(zhì)量濃度為14.55 mg/mL的溶液，上樣。分別加入體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%、100%的乙醇溶液，按照3 mL/min的流速洗脫，然后將同一梯度的流出液合并濃縮，最后經(jīng)過真空干燥得到I-2-1（不保留相）、I-2-2、I-2-3、I-2-4、I-2-5組分，分別溶解于10 mL 50%乙醇溶液中，測定DSA。

1.3.6 半制備液相色譜分離

組分I-1、I-2-2、I-2-3經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，使用半制備液相色譜儀進(jìn)行分離。Waters 2998紫外檢測器；Xbridge Prep C18色譜柱（10 mmh250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為水（含0.1%甲酸）；B為甲醇（含0.1%甲酸）。流速：3 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：500 μL。

梯度洗脫程序：I-1組分：0～5 min，95% A、5% B；5～20 min，95%～75% A、5%～25% B；20～25 min，75% A、25% B；25～40 min，75%～40% A、25%～60% B；40～45 min，40% A、60% B；45～50 min，40%～0% A、60%～100% B；I-2-2組分：0～5 min，95% A、5% B；5～20 min，95%～85% A、5%～15% B；20～25 min，85% A、15% B；25～30 min，85%～70% A、15%～30% B；30～35 min，70% A、30% B；35～40 min，70%～50% A、30%～50% B；40～50 min，50%～0% A、50%～100% B；I-2-3組分：0～5 min，85% A、15% B；5～20 min，85%～70% A、15%～30% B；20～25 min，70% A、30% B；25～45 min，70%～40% A、30%～60% B；45～50 min，40%～0% A、60%～100% B。

每2 min收集一次，將組分I-1、I-2-2、I-2-3各分成 25個(gè)組分，分別命名為I-1-1～I(xiàn)-1-25、I-2-2-1～I(xiàn)-2-2-25、I-2-3-1～I(xiàn)-2-3-25。收集20個(gè)循環(huán)后，將這些組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑并凍干。凍干組分用4 mL 50%乙醇溶液復(fù)溶后，測定DSA。

1.3.7 組分I-1-16的二級(jí)半制備液相色譜分離

組分I-1-16經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，使用Waters苯基柱（10 mmh250 mm，5 μm）進(jìn)行二級(jí)液相色譜分離。流動(dòng)相、流速、檢測波長與進(jìn)樣量同1.3.5節(jié)。

洗脫條件：0～5 min，80% A、20% B；5～25 min，80%～40% A、20%～60% B；25～30 min，40%～0% A、60%～100% B。按照色譜峰將組分I-1-16分成兩個(gè)組分，命名為I-1-16-1和I-1-16-2。收集5個(gè)循環(huán)，經(jīng)減壓蒸餾、凍干，用2 mL 50%乙醇溶液溶解后，測定DSA。

1.3.8 化合物鑒定

將選定組分經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，利用UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行化合物鑒定，采用MassLynx V4.1軟件對(duì)質(zhì)譜信息進(jìn)行分析，通過MSFinder與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的樣本進(jìn)行指紋區(qū)和碎片化的比對(duì)，再根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)一步確認(rèn)。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC色譜儀；Waters ACQUITY PDA檢測器；BEH C18反向色譜柱（2.1 mmh150 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；檢測波長200～400 nm；進(jìn)樣量2 μL；柱溫45 ℃。流動(dòng)相：A為乙腈，B為水（0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～5 min，0%～20% A、100%～80% B；5～25 min，20%～40% A、80%～60% B；25～30 min，40%～60% A、60%～40% B；30～32 min，60%～100% A、40%～0% B；32～35 min，100%～0% A、0%～100% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓3 000 V；錐孔電壓20 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；脫溶劑氣流速700 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞能量6/20 eV；離子掃描范圍m/z20～2 000。

1.3.9 化合物定量

取100 mL啤酒經(jīng)1.3.2、1.3.3節(jié)處理后，分別將乙酸乙酯相和水相注入液相色譜儀進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

液相色譜條件：紫外吸收檢測器；Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：20 ℃。流動(dòng)相：A為水（0.1%甲酸）；B為甲醇（0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～15 min，95%～80% A、5%～20% B；15～45 min，80%～40% A、20%～60% B；45～50 min，40%～20% A、60%～80% B；50～52 min，20%～95% A、80%～5% B；52～60 min，95% A、5% B。

建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下（X為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y為對(duì)應(yīng)的峰面積）：EGC：Y=2.589 6X+20.658，R2=0.999 6；EGCG：Y=20.054X+174.95，R2=0.999 2；EC：Y=10.162X+206.45，R2=0.999 4；ECG：Y=25.856X+545.33，R2=0.999 7；Cor：Y=31.344X-179.93，R2=0.999 2?；厥章试?9.5%～94.8%之間，檢測結(jié)果穩(wěn)定，能滿足高效液相色譜檢測要求。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 20分析數(shù)據(jù)，并利用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

通過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)得到6種樹脂對(duì)茶啤酒抗氧化物質(zhì)的吸附和解吸率，結(jié)果如表1所示。X-5型樹脂對(duì)茶啤酒中抗氧化物質(zhì)的吸附效果最好，吸附率達(dá)84.42%，其次是LX-158、LX-17、D101、AB-8、LX-8型。比較各樹脂的解吸率可知，X-5型樹脂的解吸率同樣高于另外5種樹脂。結(jié)合吸附率和解吸率的結(jié)果可知，X-5型樹脂更適用于茶啤酒抗氧化物質(zhì)的分離純化，所以選擇X-5型樹脂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 大孔樹脂的吸附率與解吸率Table 1 Adsorption and desorption rates of different macroporous resins

2.2 茶啤酒抗氧化物質(zhì)的初步分離

根據(jù)物質(zhì)的理化性質(zhì)特征和不同的分離純化原理，可采用不同形式的方法以達(dá)到分離純化效果，常見的方法有溶劑法[14]、膜分離法[15]、大孔樹脂層析法[16]、柱色譜法[17-18]和高速逆流色譜法[19-20]等。本實(shí)驗(yàn)通過乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取和大孔樹脂吸附，對(duì)茶啤酒的抗氧化物質(zhì)進(jìn)行初步分離，具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1。各分離組分的得率和DSA結(jié)果見表2。

表2 各分離組分的得率和DSATable 2 Yields and DPPH radical-scavenging activity of each extract

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Experimental scheme for this study

茶啤酒經(jīng)醇沉后，得到乙醇相（I）和沉淀相（II），凍干后的得率為15.66 g/L和19.68 g/L，其DAS分別為4.51 mmol/L和0.19 mmol/L。表明茶啤酒的抗氧化物質(zhì)主要存在于組分I，而組分II多為蛋白質(zhì)、多糖和無機(jī)鹽類物質(zhì)，不作進(jìn)一步研究。對(duì)組分I采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相（I-1）和水相（I-2），DSA分別為2.82 mmol/L和1.78 mmol/L，表明疏水性化合物比水溶性化合物具有更高的抗氧化活性。然而，考慮到組分I-2的得率很高（14.55 g/L），對(duì)茶啤酒抗氧化活性的貢獻(xiàn)不可忽視，后續(xù)將對(duì)這2個(gè)組分分別進(jìn)行研究。組分I-2通過X-5型大孔樹脂進(jìn)一步分離純化后，得到5個(gè)組分，其中組分I-2-3的DSA最高，為0.79 mmol/L，其次是組分I-2-2，為0.49 mmol/L，采用半制備液相色譜繼續(xù)分離。

2.3 抗氧化物質(zhì)的半制備液相色譜分離

半制備液相色譜分離是應(yīng)用較為廣泛的分離制備方法[21-22]，本實(shí)驗(yàn)利用半制備液相色譜儀對(duì)組分I-1、I-2-2、I-2-3進(jìn)行一級(jí)分離并對(duì)各收集組分進(jìn)行DSA分析，結(jié)果如圖2所示。共計(jì)得到75個(gè)組分，以DSA≥0.1 mmol/L為依據(jù)，篩選得到I-1-12、I-1-15～I(xiàn)-1-19和I-2-3-8這7個(gè)抗氧化活性較高的組分。其中，組分I-1-16的DSA最高，為1.056 mmol/L，是茶啤酒中的關(guān)鍵抗氧化組分，但使用UPLC-Q-TOF-MS分析后發(fā)現(xiàn)該組分含有2個(gè)化合物，為了確定起抗氧化作用的最關(guān)鍵化合物，利用苯基柱進(jìn)行二級(jí)分離，得到2個(gè)組分，命名為I-1-16-1和I-1-16-2。對(duì)這2個(gè)組分進(jìn)行分析，DSA依次為0.924 mmol/L和0.132 mmol/L，表明組分I-1-16-1為影響茶啤酒抗氧化活性的最主要成分。下一步將對(duì)各組分中所含的主要化合物進(jìn)行鑒定。

圖2 組分I-1（A）、I-2-2（B）、I-2-3（C）、I-1-16（D）的半制備色譜圖和對(duì)應(yīng)的DSAFig.2 Semi-preparative RP- HPLC separation and DPPH radicalscavenging activity of fraction I-1 (A), I-2-2 (B), I-2-3 (C), and sub-fraction I-1-16 (D)

2.4 物質(zhì)的鑒定

采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)DSA較高的組分I-1-12、I-1-15、I-1-16-1、I-1-16-2、I-1-17～I(xiàn)-1-19和I-2-3-8進(jìn)行分析，按照提取離子色譜圖、確定母離子大小、查看質(zhì)譜碎片信息、MSFinder搜庫等步驟對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒定。以組分I-1-12為例對(duì)鑒定過程進(jìn)行說明，利用MassLynx軟件分析，其色譜圖及總離子流圖如圖3A、B所示。該組分在負(fù)離子模式下具有很強(qiáng)的響應(yīng)，提取m/z305離子后的總離子流圖呈單峰，且峰形對(duì)稱（圖3C）。對(duì)2種碰撞能量（6 eV和20 eV）下該離子的質(zhì)譜信息（圖4）進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，碰撞能量越高，碎片離子越豐富，因此以20 eV碰撞能量下的質(zhì)譜信息為判斷依據(jù)。由圖4B可看出，有2個(gè)離子峰[M-H]-和[2M-H]-存在，m/z分別為305.060 4和611.138 4。易判定m/z305.060 4為母離子。此外，該化合物還含有m/z125.023 3、179.033 9、261.076 8的碎片離子。利用MSFinder進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該化合物與EGC的分子質(zhì)量和質(zhì)譜信息能夠完全匹配（圖5）。因此，可確定母離子m/z305.060 4的化合物是EGC。

圖3 組分I-1-12的色譜圖及離子流圖Fig.3 Chromatogram and ion current chromatogram of fraction I-1-12

圖4 m/z305.060 4的母離子質(zhì)譜圖Fig.4 Parent ion mass spectra of m/z 305.060 4

圖5 碎片離子比對(duì)結(jié)果Fig.5 Comparative results of fragment ions

其他化合物的分析參照上述步驟，鑒定得到另外7個(gè)化合物，結(jié)果見表3，圖6為各化合物的質(zhì)譜圖。EGCG、EC和ECG同樣為黃烷醇類化合物，是茶葉中的主要抗氧化成分[23]?？Х纫?、黃嘌呤生物堿化合物，是茶葉的主要呈味物質(zhì)和生理活性成分，具有祛除疲勞、興奮神經(jīng)、強(qiáng)心、促進(jìn)新陳代謝、利尿解毒等功效[24]以及潛在的抗氧化能力[25]。物質(zhì)5初步鑒定為1,2,6-三沒食子酰-β-D-葡萄糖（1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose，1,2,6-TGGP），屬于天然水解單寧類物質(zhì)，是茶葉中的特異成分，在消炎、抑制耐藥性病原菌等方面具有明顯作用[26]。關(guān)于1,2,6-TGGP抗氧化活性的研究鮮見報(bào)道，但其結(jié)構(gòu)類似物1,4,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖的抗氧化活性已被證實(shí)[27]。物質(zhì)7、8經(jīng)鑒定分別為Cor和Trp，均在云南鳳慶“大山茶”里有過報(bào)道[28]。

表3 茶啤酒抗氧化組分的UPLC-Q-TOF-MS分析Table 3 UPLC-Q-TOF-MS analysis of antioxidant fractions extracted from beer with tea

圖6 各個(gè)峰提取離子后的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of each peak after ion extraction

2.5 單體化合物的抗氧化活性貢獻(xiàn)

鑒于上述得到的8種化合物中，咖啡因?yàn)楣苤破罚?,2,6-三沒食子酰-β-D-葡萄糖無標(biāo)樣在售，因此對(duì)其余6種化合物的抗氧化活性做實(shí)踐評(píng)價(jià)。將6種化合物溶于甲醇-水（50∶50，V/V）中配成1 mg/mL的溶液，然后同無茶啤酒和遠(yuǎn)安黃茶啤酒測定DSA，結(jié)果見表4。遠(yuǎn)安黃茶啤酒具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其DSA為4.78 mmol/L，明顯高于無茶啤酒（1.97 mmol/L）。除Trp外，EGC、EGCG、EC、ECG和Cor都具有自由基清除活性。在相同濃度下，不同化合物對(duì)DPPH自由基的響應(yīng)不同，其中，EGCG顯示了最高的DSA，而Cor顯示了最低的DSA。對(duì)兒茶素類化合物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，它們清除DPPH自由基的能力順序?yàn)镋GCG＞ECG＞EGC＞EC，這主要源于酚羥基之間的相對(duì)位置對(duì)自由基清除速率的影響，酚羥基處于鄰位的化合物與自由基的反應(yīng)速率要高于處于間位的[29]。

表4 啤酒和6種單體化合物的DSATable 4 DPPH radical-scavenging activity of different beers and six compounds

為進(jìn)一步說明EGC、EGCG、EC、ECG和Cor對(duì)啤酒抗氧化活性的貢獻(xiàn)，對(duì)其在啤酒中的含量進(jìn)行研究，結(jié)果如表5所示。遠(yuǎn)安黃茶啤酒中的EGC、EGCG、EC和ECG含量均明顯高于無茶啤酒，分別為（按含量降序）：EGCG（108.636 mg/L）、EGC（68.66 mg/L）、ECG（24.51 mg/L）和EC（14.05 mg/L），與Zhao Caining等[30]得到的茶葉中的兒茶素類化合物含量排序結(jié)果一致。此外，無茶啤酒中未檢測到ECG和Cor，說明這5種物質(zhì)全部或者絕大部分源于茶葉原料。結(jié)合表4單體化合物的DSA，可以得到EGC、EGCG、EC、ECG和Cor在遠(yuǎn)安黃茶啤酒中的理論DSA依次為0.80、1.34、0.16、0.30 mmol/L和0.01 mmol/L，對(duì)遠(yuǎn)安黃茶啤酒的抗氧化活性貢獻(xiàn)值分別為16.74%、28.03%、3.35%、6.28%和0.21%，總貢獻(xiàn)值為54.61%，可說明這5種單體化合物是影響遠(yuǎn)安黃茶啤酒抗氧化活性的主要物質(zhì)。

表5 啤酒中5種單體化合物的抗氧化活性貢獻(xiàn)Table 5 Contributions of five compounds in different beers to their antioxidant activity

3 結(jié) 論

抗氧化活性對(duì)茶啤酒的功能性及風(fēng)味穩(wěn)定性具有重要的影響，本研究基于抗氧化活性為導(dǎo)向的策略對(duì)遠(yuǎn)安黃茶啤酒的抗氧化組分進(jìn)行分離，利用UPLC-Q-TOF-MS共鑒定到8個(gè)化合物，其中4個(gè)黃烷醇類化合物（1、3、4、6）、1個(gè)嘌呤堿類化合物（2）、1個(gè)單寧類化合物（5）、1個(gè)酚酸類化合物（7）以及1個(gè)氨基酸類化合物（8）。對(duì)部分化合物進(jìn)行了單體抗氧化活性和定量研究，結(jié)果表明EGC、EGCG、EC、ECG和Cor均具有顯著的抗氧化活性，其中，ECG和Cor僅存在于遠(yuǎn)安黃茶啤酒，且遠(yuǎn)安黃茶啤酒中EGC、EGCG和EC的含量分別是無茶啤酒中的15.29、722.40 倍和10.48 倍，說明遠(yuǎn)安黃茶啤酒的抗氧化活性在很大程度上由茶葉的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)決定。此外，5種物質(zhì)對(duì)遠(yuǎn)安黃茶啤酒抗氧化活性的貢獻(xiàn)為：EGCG＞EGC＞ECG＞EC＞Cor。EGCG是影響茶啤酒抗氧化活性的最主要物質(zhì)，這與EGCG是茶葉中最主要的兒茶素，約占兒茶素總量的50%～80%，且具有比VE和VC更強(qiáng)的抗氧化作用的結(jié)果一致[30-31]。本實(shí)驗(yàn)可以為開發(fā)遠(yuǎn)安黃茶深加工產(chǎn)品提供理論依據(jù)，為啤酒產(chǎn)業(yè)選擇性生產(chǎn)具有高抗氧化活性的茶啤酒產(chǎn)品提供指導(dǎo)。然而，這5種物質(zhì)并不能代表遠(yuǎn)安黃茶啤酒抗氧化活性的全部，因此，有必要對(duì)其他分離組分進(jìn)行鑒定，以更深入地了解抗氧化物質(zhì)及其對(duì)茶啤酒抗氧化活性的影響。