Real-time PCR和雙向電泳聯(lián)合鑒別嬰幼兒配方羊乳粉的乳源成分

侯艷梅，楊艷歌，吳 桐，劉鳴暢，王洪越，王丹丹，吳亞君,*

（1.海普諾凱營(yíng)養(yǎng)品有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

羊乳作為特色小眾乳品具有較好的營(yíng)養(yǎng)特性，它的蛋白質(zhì)構(gòu)成、非蛋白氮含量、脂肪酸構(gòu)成和寡糖種類(lèi)與牛乳相比更接近于母乳[1-2]，因此羊乳基嬰幼兒配方奶粉具有特有的營(yíng)養(yǎng)特性和健康益處，日益受到消費(fèi)者歡迎，市場(chǎng)份額也在不斷擴(kuò)大，近些年全球銷(xiāo)量增長(zhǎng)率均保持10%以上[3]。然而奶羊的數(shù)量和日產(chǎn)量都遠(yuǎn)小于奶牛，導(dǎo)致羊乳粉的價(jià)格比牛乳粉高。因此羊乳制品中摻雜牛乳制品的經(jīng)濟(jì)利益欺詐現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。同時(shí)摻雜摻假也會(huì)引入牛源性過(guò)敏成分，增加致敏的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成威脅[4-5]。

我國(guó)《嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品配方注冊(cè)管理辦法》規(guī)定了“產(chǎn)品名稱(chēng)中有動(dòng)物性來(lái)源的，應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品配方在配料表中如實(shí)標(biāo)明使用的生乳、乳粉、乳清（蛋白）粉等乳制品原料的動(dòng)物性來(lái)源。使用的乳制品原料有兩種以上動(dòng)物性來(lái)源時(shí)，應(yīng)當(dāng)標(biāo)明各種動(dòng)物性來(lái)源原料所占比例”[6]。為保證嬰幼兒配方羊乳粉產(chǎn)品的質(zhì)量，有必要開(kāi)發(fā)一種靈敏度高和準(zhǔn)確性好的原料檢測(cè)方法。目前乳制品中乳源鑒定和檢測(cè)的方法較多，有理化方法[7-10]、免疫技術(shù)[11-14]、基因方法[14-19]、蛋白方法[20-24]等?；驒z測(cè)技術(shù)被公認(rèn)是物種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，其中實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）技術(shù)操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，被廣泛用于食品物種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中[25-26]。但real-time PCR法也存在一些限制，如靈敏度雖然高，且適用于各類(lèi)基質(zhì)樣品，但由于核酸可存在于不同的組分中，包括全乳、脫脂乳、乳清等，因此對(duì)于核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品，還需要對(duì)組分來(lái)源進(jìn)行確證。例如采用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)分析樣品的蛋白組成，判定是否含有目標(biāo)物種來(lái)源的蛋白質(zhì)成分，才能對(duì)樣品的真實(shí)性有準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。蛋白質(zhì)是乳品的主要營(yíng)養(yǎng)成分，不同種源的乳品所包含的蛋白質(zhì)組分有所不同，因此依據(jù)乳品的蛋白質(zhì)或多肽指紋進(jìn)行真?zhèn)螜z測(cè)也日益成為乳品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方法。其中雙向電泳法是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量?jī)纱筇匦裕瑢?duì)蛋白進(jìn)行高效分離，所得的圖譜分辨率高、穩(wěn)定性好，可以直觀(guān)地展現(xiàn)不同種類(lèi)、不同來(lái)源蛋白的差異[27]。筆者實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)表了采用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行乳源檢測(cè)的研究[28-29]。但單獨(dú)采用蛋白進(jìn)行檢測(cè)，操作流程復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度不高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求高，不適合作為常規(guī)性檢測(cè)方法。因此實(shí)驗(yàn)認(rèn)為應(yīng)該將DNA方法發(fā)展為一種快速初篩手段，將蛋白檢測(cè)作為確證方法。

本研究首先建立嬰幼兒配方乳粉DNA快速提取方法，采用具有遠(yuǎn)高于蛋白酶K降解能力的嗜熱蛋白酶，通過(guò)溫控設(shè)備一步式獲取DNA，整個(gè)過(guò)程僅需17 min。優(yōu)化建立乳粉中乳源成分快速real-time PCR篩查技術(shù)，不僅減少了檢測(cè)時(shí)間，而且提高了擴(kuò)增效率，包括哺乳動(dòng)物，牛（家牛、水牛、牦牛）、羊（山羊和綿羊通用及單一乳源）以及山羊、綿羊單一物種檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度好。采用快速、簡(jiǎn)便、靈敏的real-time PCR方法對(duì)樣品的乳源進(jìn)行初篩，然后對(duì)于檢出?；虺煞值呐浞饺榉郏僭黾与p向電泳乳源蛋白的檢測(cè)，以αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白作為乳源判別的特征差異蛋白，并依據(jù)乳清蛋白和乳酪蛋白的特性，進(jìn)一步判定樣品中摻雜了牛乳還是牛乳清。通過(guò)以上兩種技術(shù)聯(lián)合，解決以往嬰幼兒配方乳粉檢測(cè)中因配料復(fù)雜，乳源判別困難的瓶頸問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

嬰幼兒配方羊乳粉、嬰兒配方牛乳粉、全脂羊乳粉、脫脂羊乳粉、綿羊乳清粉、山羊乳清粉、山羊綿羊乳清粉、牛乳清粉、全脂牛乳粉、脫脂牛乳粉均由委托的乳品企業(yè)提供，水牛乳由廣西水牛研究所提供；牛乳、綿羊乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳均從內(nèi)蒙古的牧場(chǎng)收集；驢乳由青島海關(guān)提供；牦牛乳由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；市售嬰幼兒配方羊乳粉均購(gòu)自北京超市和網(wǎng)商平臺(tái)；其他物種材料（豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂、大鼠、雞、鴨、魚(yú)），以及配方乳粉中常添加的植物源成分（葵花、大豆、椰子、玉米、菜籽），均為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存樣品。

1.1.2 試劑

PDQeX prepGEM Universal DNA提取試劑盒英國(guó)MicroGEM公司；QuickGene DNA Tissue Kit L DNA提取試劑盒 日本Kurabo公司；NucleoSpin?Food德國(guó)Macherey-Nagel公司；DNeasy Mericon Food Kit德國(guó)Qiagen公司；Foodproof?GMO Sample Preparation Kit德國(guó)Biotecon Diagnostics公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix 美國(guó)Applied Biosystems公司；BCA蛋白定量試劑盒 德國(guó)Merck公司；預(yù)染十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel eletropheresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)品（Prestained SDSPAGE Standards，Broad range）、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte 4/6 Ampholyte、Bio-Lyte 5/7 Ampholyte）、IPG預(yù)制膠條（7 cm、pH 4～7）、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷（tris (hydroxymethyl) aminomethane，Tris）溶液（pH 8.8）、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfate，CHAPS） 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 引物探針

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提取哺乳動(dòng)物、牛、家牛、水牛、牦牛、羊、山羊和綿羊以及其他乳源物種和近源物種的生長(zhǎng)激素基因（GH）和cytb基因序列。利用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用Primer Premier 5.0軟件分別在保守區(qū)域設(shè)計(jì)哺乳動(dòng)物通用引物探針，在種間差異區(qū)域設(shè)計(jì)牛、羊、山羊和綿羊的特異性引物探針。其中牛為牛亞科牛族動(dòng)物的統(tǒng)稱(chēng)，包括家牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalus）和牦牛（Bos grunniens），這3種乳在市場(chǎng)上的占有率較高，尤其是牛乳和水牛乳，占全世界乳產(chǎn)量的96%[30]，通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)牛族通用引物探針，可同時(shí)將牛乳、水牛乳、牦牛乳乳源成分?jǐn)U出。同時(shí)由于嬰幼兒配方羊乳粉的主要原料是羊乳，其常見(jiàn)的兩個(gè)亞種是山羊和綿羊，因此實(shí)驗(yàn)首先設(shè)計(jì)了羊的通用引物，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)山羊和綿羊乳源成分的擴(kuò)增。而市場(chǎng)上又有山羊乳和綿羊乳標(biāo)識(shí)的乳粉，因此為了進(jìn)一步滿(mǎn)足標(biāo)簽查驗(yàn)的需求，實(shí)驗(yàn)又分別設(shè)計(jì)了山羊和綿羊引物探針，以進(jìn)一步區(qū)分乳源。具體信息如表1所示，所有引物探針均在上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

7500 Fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；Labsystems Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀、Pico17離心機(jī)（離心力≥12 000hg） 美國(guó)Thermo公司；Mini Protean 3 Cell垂直板電泳儀、PharosFX激光成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；QuickGene Mini8L 日本Kurabo公司；Qubit 2.0核酸蛋白分析儀 美國(guó)Invitrogen公司；組織研磨機(jī) 德國(guó)Qiagen公司；渦旋儀 德國(guó)IKA公司；恒溫混勻儀、微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；離心管、八連排PCR管 美國(guó)Axygen公司；電子天平德國(guó)Sartorius公司；qPCR儀 杭州安塔生物科技有限公司；恒溫水浴鍋 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 快速real-time PCR

1.3.1.1 樣品前處理

液態(tài)乳混勻后冷凍干燥，乳粉直接混勻分裝；其他動(dòng)植物樣品統(tǒng)一用組織研磨儀粉碎，-80 ℃凍存。

1.3.1.2 DNA提取

分別稱(chēng)取50 mg嬰幼兒配方牛乳粉和嬰幼兒配方羊乳粉樣品，用傳統(tǒng)的CTAB法以及5種商業(yè)試劑盒進(jìn)行DNA提取效果比較，部分步驟在說(shuō)明書(shū)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良。其中采用PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒改良后的步驟為：稱(chēng)取50 mg乳粉于1.5 mL離心管中，加入500 μL wash buffer，渦旋振蕩1 min，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，以洗去油脂，然后按照試劑盒配制100 μL提取反應(yīng)體系（10 μL Histosolv，10 μL Orange Buffer，2 μL PrepGEM，78 μL H2O）重懸沉淀并移至PCR單管中，進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)：52 ℃細(xì)胞壁降解5 min，75 ℃細(xì)胞裂解10 min，95 ℃變性2 min，即可獲取DNA。

改良的CTAB法在GB/T 19495.3ü2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 核酸提取純化方法》[31]步驟的基礎(chǔ)上，蛋白酶K量增加1 倍，氯仿去蛋白的步驟重復(fù)1次。NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、DNeasy Mericon食品基因組DNA提取試劑盒、QuickGene DNA多樣本抽提試劑盒、Foodproof?GMO Sample Preparation核酸純化試劑盒改良的步驟為：加入裂解液至樣品自由懸浮于液體中，蛋白酶K量是說(shuō)明書(shū)量的2 倍，所有樣品于65 ℃、500 r/min舒適型恒溫混勻儀中振蕩孵育過(guò)夜，其他步驟按照各說(shuō)明書(shū)操作，獲取的DNA統(tǒng)一用100 μL無(wú)菌ddH2O溶解。用Qubit 2.0核酸蛋白定量?jī)x測(cè)量DNA濃度，用哺乳動(dòng)物引物探針作為內(nèi)參照進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增效率評(píng)估，每份DNA重復(fù)擴(kuò)增3次，-20 ℃保存DNA。

1.3.1.3 real-time PCR

real-time PCR檢測(cè)采用25 μL反應(yīng)體系：12.5 μLTaqMan Fast Advanced Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積25 μL。在7500 Fast real-time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原始反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，35個(gè)循環(huán)。

1.3.1.4 通用性和特異性檢測(cè)

real-time PCR檢測(cè)分別以綿羊奶、山羊奶、牛乳、水牛乳、牦牛乳、駱駝乳、馬奶、驢乳、馬鹿、梅花鹿、豬、狗、兔、狐貍、水貂、大鼠、雞、鴨、魚(yú)、葵花、大豆、椰子、玉米、菜籽的DNA（5 ng/μL）為擴(kuò)增對(duì)象進(jìn)行擴(kuò)增，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)樣品2個(gè)平行重復(fù)。

1.3.1.5 快速real-time PCR程序的建立

為縮短檢測(cè)時(shí)間，建立快速real-time PCR檢測(cè)流程，在上述典型傳統(tǒng)擴(kuò)增程序（設(shè)為①）的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的程序設(shè)為②～⑧。分別采用羊和引物探針對(duì)羊乳和牛乳DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分析擴(kuò)增效果和檢測(cè)時(shí)間，生成圖像時(shí)閾值設(shè)為自動(dòng)。在PCR同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2個(gè)平行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。

②50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，35個(gè)循環(huán)。

③50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)。

④50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火15 s，35個(gè)循環(huán)。

⑤50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火10 s，35個(gè)循環(huán)。

⑥95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火10 s，35個(gè)循環(huán)。

⑦95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火8 s，35個(gè)循環(huán)。

⑧95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火5 s，35個(gè)循環(huán)。

1.3.1.6 絕對(duì)靈敏度分析

將提取的山羊、綿羊、牛樣品的DNA從100 ng/μL開(kāi)始進(jìn)行10 倍比稀釋?zhuān)蛊滟|(zhì)量濃度分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL，共6個(gè)梯度，用篩選好的特異性引物探針進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.1.7 實(shí)際靈敏度分析

分別按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、10%、50%、100%制備嬰幼兒配方牛乳粉/嬰幼兒配方羊乳粉、脫脂牛乳粉/脫脂羊乳粉、全脂牛乳粉/全脂羊乳粉、牛乳清粉/山羊綿羊乳清粉、牛乳清粉/全脂羊乳粉、牛乳清粉/脫脂羊乳粉模擬摻雜混合樣品，混勻后提取DNA，進(jìn)行realtime PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.2 雙向電泳

前期雙向電泳研究表明山羊乳和綿羊乳的蛋白無(wú)明顯差異，牛乳和羊乳所含蛋白種類(lèi)也基本相同，但在乳清蛋白區(qū)域及乳酪蛋白區(qū)域存在明顯差異，即：牛αS1-酪蛋白和羊αS1-酪蛋白等電點(diǎn)基本相同，但牛αS1-酪蛋白分子質(zhì)量比羊αS1-酪蛋白大；牛αS2-酪蛋白和羊αS2-酪蛋白，牛κ-酪蛋白和羊κ-酪蛋白分子質(zhì)量均相同，但羊αS2-酪蛋白和牛κ-酪蛋白等電點(diǎn)更大。牛β-乳球蛋白和羊β-乳球蛋白分子質(zhì)量相同，但羊β-乳球蛋白等電點(diǎn)大于牛β-乳球蛋白。從而選定牛αS1-酪蛋白、牛αS2-酪蛋白、牛κ-酪蛋白作為乳酪蛋白乳源判別的特征差異蛋白，以此判別嬰幼兒配方羊乳粉中是否添加牛乳成分；并選定β-乳球蛋白作為判定嬰幼兒配方羊乳粉中是添加牛乳清（蛋白）還是羊乳清（蛋白）成分的判別依據(jù)。本研究將聯(lián)合該方法對(duì)本研究中的樣品嬰幼兒配方乳粉和常用配料以及市售配方乳粉的乳源成分進(jìn)行判別。

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

稱(chēng)取1.5 g乳粉樣品及配料置于15 mL離心管中，加10 mL去離子水，渦旋振蕩，至充分溶解。使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)乳粉樣品溶液的總蛋白進(jìn)行測(cè)定，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為20 mg/mL，存于4 ℃。

1.3.2.2 等電聚焦

預(yù)處理樣品渦旋振蕩混勻，吸取10 μL樣品和150 μL水化液（8 mol/L尿素、4% CHAPS、40 mmol/L Tris、100 mmol/L DTT、0.5%兩性電解質(zhì)）混勻，使用IPG膠條進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。條件設(shè)定為50 V主動(dòng)水化8 h；250 V線(xiàn)性30 min；500 V快速30 min；4 000 V線(xiàn)性3 h；4 000 V快速40 000 Vgh。

1.3.2.3 垂直電泳

SDS-PAGE參照文獻(xiàn)[33]相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。其中分離膠為12%，電泳條件為10 mA恒流電泳。電泳結(jié)束，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染液（50%甲醇、10%醋酸、0.25%考馬斯亮藍(lán)R250）染色1 h，用脫色液（25%甲醇、10%醋酸）脫色至凝膠背景消失，用蒸餾水浸泡1 h，隨后用PharosFX激光成像系統(tǒng)拍照，獲取雙向電泳圖譜。

1.3.3 市售樣品乳源檢測(cè)

市售樣品各稱(chēng)取50 mg，采用PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒按照1.3.1.2節(jié)改良步驟進(jìn)行DNA提取，所有DNA質(zhì)量濃度調(diào)制5 ng/μL，采用建立的快速realtime PCR程序進(jìn)行乳源檢測(cè)。?；驒z測(cè)呈陽(yáng)性的樣品再按照上述雙向電泳步驟進(jìn)行乳源蛋白分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

從儀器導(dǎo)出檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)，Excel軟件計(jì)算并繪制圖表。擴(kuò)增圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)儀器自動(dòng)生成，導(dǎo)出圖譜進(jìn)行組合。其中實(shí)際靈敏度的線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)的繪制是以目標(biāo)樣品含量的對(duì)數(shù)（ln值）為X軸，以相應(yīng)的Ct均值為Y軸，繪制散點(diǎn)圖，并添加趨勢(shì)線(xiàn)（對(duì)數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種DNA提取方法比較與一步法DNA快速提取方法的建立

基因檢測(cè)限制快速應(yīng)用的主要瓶頸在于傳統(tǒng)DNA提取耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，因此建立一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA提取方法是快速篩查需要解決的首要問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)選用6種提取方法：CTAB法、PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒、NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、DNeasy Mericon食品基因組DNA提取試劑盒、QuickGene DNA多樣本抽提試劑盒、Foodproof?GMO Sample Preparation核酸純化試劑盒，并進(jìn)行改良，以嬰幼兒配方牛乳粉和嬰幼兒配方羊乳粉為研究對(duì)象，比較DNA提取效果、提取時(shí)間、擴(kuò)增效率，結(jié)果如圖1所示。采用PDQeX的DNA提取質(zhì)量濃度最高，嬰幼兒配方牛乳粉為5.2 ng/μL、嬰幼兒配方羊乳粉為63.20 ng/μL。采用4種柱層析試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度差別不大，CTAB最低。從擴(kuò)增效率看，CTAB擴(kuò)增效果最低，PDQeX和4種柱層析試劑盒擴(kuò)增效果差異不大，其中牛乳的Ct值在22.2～23.5之間，羊乳的Ct值在18.8～20.13之間。從提取時(shí)間看，CTAB耗時(shí)最長(zhǎng)，約3 h，4種試劑盒耗時(shí)差別不大，約130～150 min，而PDQeX僅需溫控反應(yīng)一步式獲取DNA，時(shí)間僅需17 min，大大縮短了提取時(shí)間。綜上，PDQeX所用的時(shí)間最短，操作步驟最簡(jiǎn)便，提取效率高，可以滿(mǎn)足檢測(cè)需求，因此后續(xù)研究均采用此一步法進(jìn)行DNA的快速提取。

圖1 6種提取方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉DNA效果分析Fig.1 Operational efficiencies of six DNA extraction methods for infant formula

2.2 real-time PCR方法檢測(cè)乳源成分方法的建立

2.2.1 引物探針設(shè)計(jì)與特異性篩選

考慮到乳粉在生產(chǎn)過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)噴霧干燥、高溫殺菌等加工處理，可能導(dǎo)致DNA斷裂或者降解，為保證能從不同加工程度的乳制品中檢測(cè)出目標(biāo)動(dòng)物成分，實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物探針的時(shí)候?qū)U(kuò)增靶序列控制在150 bp以?xún)?nèi)，設(shè)計(jì)的哺乳動(dòng)物內(nèi)參照靶序列為82 bp左右，牛族靶序列為81 bp，羊靶序列為79 bp，山羊靶序列為139 bp，綿羊靶序列為136 bp。引物和探針序列見(jiàn)表1。

為對(duì)待測(cè)樣品的DNA進(jìn)行質(zhì)量控制，根據(jù)常見(jiàn)的乳源（綿羊、山羊、家牛、水牛、牦牛等）均為哺乳動(dòng)物的特性，設(shè)計(jì)了哺乳動(dòng)物通用引物探針，real-time PCR通用性檢測(cè)結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的哺乳動(dòng)物引物探針可以將所有哺乳動(dòng)物源性成分?jǐn)U出，擴(kuò)增Ct值在24～30之間，表明通用性和覆蓋性較好，其他非哺乳動(dòng)物物種均無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，表明擴(kuò)增的特異性較好，可以作為乳源成分DNA質(zhì)控檢測(cè)的內(nèi)參照，PCR結(jié)果如圖2A所示。設(shè)計(jì)的牛引物探針可將牛乳、牦牛乳、水牛乳擴(kuò)出，平均Ct值分別為25.71f0.08、25.92f0.09、26.18f0.21。其他常見(jiàn)畜禽魚(yú)物種（豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂、大鼠、雞、鴨、魚(yú)），以及配方乳粉中常添加的植物源成分（葵花、大豆、椰子、玉米、菜籽）未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，表明牛引物探針覆蓋性和特異性良好，結(jié)果如圖2B所示。

羊通用引物探針可同時(shí)擴(kuò)增綿羊乳和山羊乳，平均Ct值分別為24.14f0.07和24.41f0.08，對(duì)其他常見(jiàn)畜禽魚(yú)以及嬰幼兒配方乳粉中常添加的植物源成分無(wú)非特異擴(kuò)增，表明羊的引物探針覆蓋性和特異性良好，結(jié)果如圖2C所示。山羊和綿羊這兩對(duì)引物探針?lè)謩e僅能特異性擴(kuò)增山羊或綿羊成分，綿羊平均Ct值為20.15f0.09，山羊平均Ct值為26.34f0.17，特異性良好，結(jié)果分別如圖2D和2E所示。

圖2 real-time PCR引物探針特異性分析Fig.2 Specificity of primers and probes used for real-time PCR

2.2.2 快速real-time PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

為縮短檢測(cè)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)建立了快速real-time PCR檢測(cè)流程，以嬰幼兒配方牛乳粉和嬰幼兒配方羊乳粉的DNA為模板，以牛和羊引物探針為代表對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行分析。如圖3所示，羊源性檢測(cè)結(jié)果表明，從反應(yīng)程序①～⑧，擴(kuò)增的Ct值幾乎保持不變，都在21左右，且擴(kuò)增效率還稍有升高，Ct值從21.65提前到21.27。牛的擴(kuò)增結(jié)果顯示，從反應(yīng)程序①～⑤，擴(kuò)增時(shí)間逐漸縮短，擴(kuò)增效率卻逐漸提高，Ct值從26.16提前到25.50，之后再縮短檢測(cè)時(shí)間擴(kuò)增效率開(kāi)始逐漸下降，到第⑧個(gè)反應(yīng)程序時(shí)Ct值升至28.88。綜合上述結(jié)果，以反應(yīng)程序⑤作為快速real-time PCR檢測(cè)的最優(yōu)反應(yīng)程序，此時(shí)不僅擴(kuò)增時(shí)間縮減到28 min 26 s，比反應(yīng)程序①的反應(yīng)時(shí)間74 min 58 s縮減了47 min左右，且擴(kuò)增效率還有所提高，Ct值可減少1左右，因此后續(xù)均采用該程序進(jìn)行快速real-time PCR檢測(cè)。

圖3 快速real-time PCR檢測(cè)體系優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of fast real-time PCR detection system

2.2.3 靈敏度分析

6個(gè)梯度濃度的DNA快速real-time PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果顯示：羊和綿羊的引物探針在DNA模板量為10 pg/μL時(shí)，尚有良好的擴(kuò)增，此時(shí)平均Ct值分別為32.66f0.11和32.29f0.24；當(dāng)?shù)椭? pg/μL時(shí)，在特定的循環(huán)數(shù)內(nèi)，不再有擴(kuò)增，因此初步確定羊和綿羊的絕對(duì)靈敏度為10 pg/μL，結(jié)果如圖4C、D所示。哺乳動(dòng)物、牛和山羊引物探針檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度達(dá)到100 pg/μL時(shí)，仍有良好的擴(kuò)增，此時(shí)平均Ct值分別為32.16f0.12：33.07f0.04、30.73f0.09；但當(dāng)DNA模板量低至10 pg/μL時(shí)，牛的Ct值超出35，哺乳動(dòng)物和山羊雖然有擴(kuò)增，平均Ct值分別為34.94f0.72和34.28f0.10，但熒光信號(hào)ΔRn值較低，已經(jīng)接近閾值，因此初步確定哺乳、牛和山羊的絕對(duì)靈敏度為100 pg/μL，結(jié)果如圖4A、B、E所示。根據(jù)儀器自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，哺乳動(dòng)物、牛、羊、山羊和綿羊的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996、0.992、0.998、0.997、0.996（結(jié)果未提供），線(xiàn)性關(guān)系良好。因此確定本研究設(shè)計(jì)的哺乳動(dòng)物、牛和山羊源性成分最低絕對(duì)靈敏度為100 pg/μL，羊和綿羊成分最低絕對(duì)靈敏度為10 pg/μL。

圖4 乳源成分real-time PCR檢測(cè)絕對(duì)靈敏度分析Fig.4 Sensitivity of detection of milk-derived ingredients by real-time PCR

2.2.4 常見(jiàn)嬰幼兒配方粉及乳源配料模擬添加牛源性成分靈敏度分析

按照1.3.1.7節(jié)方法進(jìn)行實(shí)際靈敏度檢測(cè)。采用篩選的PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒快速提取樣品DNA，檢測(cè)結(jié)果顯示，乳清、脫脂乳粉、全脂乳粉以及嬰幼兒配方中的牛源性成分檢出限均可達(dá)1%，線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)R2均在0.9以上（圖5），可滿(mǎn)足適合用于實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。

圖5 嬰幼兒配方羊乳粉及其常用配料中牛源性成分檢測(cè)實(shí)際靈敏度分析Fig.5 Sensitivity of detection of bovine milk-derived ingredients in infant formula and common milk powder and whey products

2.3 方法聯(lián)合檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉及常用配料的乳源成分

聯(lián)合前期研究已建立的乳源蛋白雙向電泳蛋白檢測(cè)方法[29]，采用建立的real-time PCR基因檢測(cè)方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉乳源檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)以收集的10 份嬰兒配方粉及常用原料真實(shí)樣品為研究對(duì)象，進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果對(duì)比分析。檢測(cè)結(jié)果對(duì)比顯示：1）牛乳清可檢出?；虺煞郑p向電泳可檢出牛乳清蛋白，未檢出牛乳酪蛋白成分。2）山羊乳清可檢出羊和山羊基因成分，綿羊乳清可檢出羊和綿羊基因成分，山羊綿羊乳清可檢出羊、綿羊、山羊基因成分；3種乳清雙向電泳檢測(cè)均可檢出羊乳清蛋白，均未檢出乳酪蛋白成分。3）全脂牛奶粉和脫脂牛奶粉可檢出?；虺煞郑p向電泳可同時(shí)檢出牛乳清蛋白和牛乳酪蛋白成分。4）全脂羊乳粉和脫脂羊乳粉可檢出羊和山羊基因成分，雙向電泳可同時(shí)檢出羊乳清蛋白和羊乳酪蛋白成分。5）嬰兒配方牛奶粉可檢出?；虺煞?，雙向電泳可同時(shí)檢出牛乳清蛋白和牛乳酪蛋白成分。6）嬰兒配方羊奶粉可檢出羊和山羊基因成分，雙向電泳可同時(shí)檢出羊乳清蛋白和羊乳酪蛋白成分；未檢出牛乳清蛋白和牛乳酪蛋白成分。詳細(xì)結(jié)果如表2所示，典型樣品雙向電泳特征圖譜詳見(jiàn)圖6。通過(guò)兩種方法對(duì)收集的真實(shí)樣品的結(jié)果對(duì)比分析，雙向電泳的結(jié)果和核酸結(jié)果完全一致；并且雙向電泳的結(jié)果可以區(qū)分乳蛋白的來(lái)源，對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果是一個(gè)重要的補(bǔ)充。

表2 嬰幼兒配方乳粉及常用原料的乳源成分檢測(cè)Table 2 Results of milk-derived ingredient detection in infant formula,whey powder and milk powder

圖6 典型樣品雙向電泳特征蛋白圖譜Fig.6 Two-dimensional electrophoresis maps of typical milk powder samples

2.4 快速real-time PCR與雙向電泳聯(lián)合在市售嬰幼兒配方粉樣品乳源成分檢測(cè)中的應(yīng)用

抽檢的20 份嬰幼兒配方粉羊奶粉，其中8 份配料表標(biāo)識(shí)乳清蛋白來(lái)源為羊源，5 份為牛源，3 份標(biāo)識(shí)含乳清但未標(biāo)識(shí)乳源來(lái)源，4 份配料表標(biāo)識(shí)無(wú)乳清蛋白配料，聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。采用建立的方法提取樣品DNA，快速real-time PCR程序進(jìn)行初篩，羊基因檢測(cè)結(jié)果顯示：所有樣品均檢出羊源性成分；有10 份檢出山羊成分，未檢出綿羊成分；有1 份檢出綿羊成分，未檢出山羊成分；其余9 份同時(shí)檢出山羊和綿羊成分，但其中有2 份配料標(biāo)識(shí)是純山羊或純綿羊，即10%的樣品羊源性標(biāo)識(shí)不一致。?；驒z測(cè)結(jié)果顯示有11 份檢出牛源性成分，對(duì)這11 份?；驒z測(cè)呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)一步采用雙向電泳檢測(cè)，以確證其蛋白來(lái)源，結(jié)果顯示10%的樣品同時(shí)檢出牛乳酪蛋白和牛乳清蛋白，可能摻雜了牛乳；9 份檢出牛乳清成分，去除5 份已標(biāo)識(shí)乳清來(lái)源為牛源的樣品，即20%的樣品檢出牛乳清摻雜成分。綜合real-time PCR和雙向電泳的檢測(cè)結(jié)果，8 份嬰幼兒配方粉羊奶粉檢出與標(biāo)簽不符的乳源成分，占比40%。

表3 市售嬰幼兒配方羊奶粉中乳源成分檢測(cè)Table 3 Results of detection of milk-derived ingredients in infant formula

3 討 論

3.1 建立嬰幼兒配方羊乳粉DNA快速提取方法的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

為實(shí)現(xiàn)嬰幼兒配方羊乳粉樣品DNA的快速提取，實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行篩選，通過(guò)CTAB法、一步法、吸附柱法的比較，最終選擇PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒。該技術(shù)采用具有遠(yuǎn)高于蛋白酶K降解能力的獨(dú)特嗜熱蛋白酶，其提取流程也不同于任何現(xiàn)有的核酸提取方法：不使用磁珠或吸附柱，也不使用SDS或CTAB，僅依靠溫控反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)一步式獲取DNA。這樣既去除了磁珠法/吸附柱法中吸附、洗脫、洗滌等需要反復(fù)移液操作而造成回收損失的環(huán)節(jié)，又在快速提取的同時(shí)，保證高回收率。樣品前處理簡(jiǎn)便、快速，可在17 min內(nèi)獲取乳粉DNA，簡(jiǎn)化了提取步驟，提高了DNA提取效率，可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求。

3.2 聯(lián)合real-time PCR和雙向電泳進(jìn)行嬰幼兒配方羊乳粉乳源檢測(cè)的必要性

本研究建立的嬰幼兒配方羊乳粉中牛、羊、山羊、綿羊成分檢測(cè)real-time PCR方法，可對(duì)嬰幼兒配方羊乳粉的乳源成分進(jìn)行快速初判，且方法的靈敏度較高（檢出限1%），即便含有微量牛乳源也會(huì)被檢出，說(shuō)明該方法在檢測(cè)的過(guò)程中不會(huì)造成假陰性和漏檢的情況。由于嬰兒配方乳粉是含有乳清、脫脂乳粉、全脂乳粉等復(fù)雜配料的混合制品，本研究推出聯(lián)合雙向電泳技術(shù)對(duì)乳源進(jìn)行判別和確證的技術(shù)。采用該方法不僅可以區(qū)分牛乳和羊乳，還可依據(jù)乳清中不含酪蛋白的特性，進(jìn)一步區(qū)分牛成分是來(lái)源于牛乳還是牛乳清。但相比于基因技術(shù)，雙向電泳技術(shù)對(duì)手工操作依賴(lài)較大，并且操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、靈敏度稍低，且無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分山羊和綿羊乳，因此需要聯(lián)合基因的方法先對(duì)乳源進(jìn)行快速初判，排除合格樣品，再針對(duì)檢出?；虻臉悠凡捎秒p向電泳對(duì)乳源進(jìn)行復(fù)核和確證。這樣不僅提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也解決了以往配方乳粉中由于基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致乳源判別困難的問(wèn)題，為配方乳產(chǎn)品乳源檢測(cè)提供有利的技術(shù)支撐。

3.3 市售嬰幼兒配方羊乳粉抽查結(jié)果顯示存在乳源摻雜現(xiàn)象

線(xiàn)上線(xiàn)下市售嬰幼兒配方羊乳粉的抽檢結(jié)果表明，30%的產(chǎn)品摻雜了牛乳來(lái)源成分，其中10%的樣品同時(shí)檢出牛乳酪蛋白和乳清蛋白，20%檢出牛乳清蛋白。同時(shí)檢出牛乳酪蛋白和乳清蛋白的產(chǎn)品屬于牛乳摻雜，違反了有關(guān)嬰幼兒配方羊乳粉的要求。檢出牛乳清蛋白的產(chǎn)品，20%未在配料表中進(jìn)行乳源說(shuō)明。依據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)法規(guī)，例如國(guó)際食品法典委員會(huì)公布的標(biāo)準(zhǔn)Codex Stan 72-1981嬰兒配方及特殊醫(yī)用嬰兒配方食品（2015修訂版）[32]和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局第26號(hào)令[7]，嬰幼兒配方乳粉中動(dòng)物源或植物源配料以及食品添加劑應(yīng)當(dāng)標(biāo)出其種名，上述未在配料表中進(jìn)行標(biāo)注以及檢出非標(biāo)識(shí)乳源成分的產(chǎn)品不符合相關(guān)規(guī)定。

4 結(jié) 論

建立了一步法DNA快速提取流程和快速real-time PCR檢測(cè)方法。從DNA提取到real-time PCR擴(kuò)增，整個(gè)流程可在50 min內(nèi)完成檢測(cè)，可以區(qū)分牛、羊、綿羊、山羊乳源物種成分，實(shí)際靈敏度達(dá)1%?？梢詮浹a(bǔ)雙向電泳法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度不足、無(wú)法區(qū)分綿羊和山羊成分的不足。對(duì)?；驒z測(cè)呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)一步采用雙向電泳法可對(duì)乳源成分進(jìn)行復(fù)核和確證，并依據(jù)乳清蛋白和乳酪蛋白的特性，可判定樣品摻雜成分是牛乳或牛乳清，能彌補(bǔ)real-time PCR法無(wú)法區(qū)分組分來(lái)源的不足。通過(guò)聯(lián)合兩種經(jīng)典方法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、彌補(bǔ)不足，解決了以往利用單一檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)配方乳粉時(shí)存在的精準(zhǔn)度和靈敏度限制的問(wèn)題，以及出現(xiàn)的指標(biāo)重疊，難以下結(jié)論，甚至誤判的情況。為乳粉企業(yè)進(jìn)行原料質(zhì)控，政府實(shí)行監(jiān)管和標(biāo)簽查驗(yàn)提供良好的技術(shù)支撐。