基于鎳基堿式碳酸鹽修飾電極的無(wú)酶葡萄糖電化學(xué)傳感器構(gòu)建

劉 麗，張智鋒，王松磊,*，李海峰，李懇懇，馬 亮，魏培媛，張 也，武康寧

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430000；3.寧夏華信達(dá)健康科技有限公司，寧夏 靈武 751400）

目前，葡萄糖含量已經(jīng)成為飲料產(chǎn)品的一項(xiàng)重要指標(biāo)，然而不同人群對(duì)葡萄糖的攝入量要求不同[1-2]。當(dāng)人體出現(xiàn)低血糖時(shí)，可以適量攝入葡萄糖含量較高的飲品，以滿(mǎn)足機(jī)體的需求，但當(dāng)人體處于正常生理狀態(tài)時(shí)，如果在短時(shí)間內(nèi)攝入過(guò)多的葡萄糖，可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一些不良的后果，特別是患有糖尿病或肥胖癥的病人，后果則會(huì)非常的嚴(yán)重。因此，為了滿(mǎn)足不同人群對(duì)葡萄糖的需求，對(duì)飲料中葡萄糖含量的監(jiān)測(cè)評(píng)估十分必要。

目前，許多技術(shù)已用于食品中葡萄糖含量的檢測(cè)，如比色法[3]、熒光法[4-5]、色譜分析法[6-7]、質(zhì)譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]和電化學(xué)方法[10-12]等，前幾種方法有其自身的優(yōu)點(diǎn)，但也有設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜等不足，使其在實(shí)際應(yīng)用中受到一定程度的限制。電化學(xué)方法因高靈敏度、低成本、高選擇性而廣泛的用于電催化氧化葡萄糖，電化學(xué)葡萄糖傳感器根據(jù)有無(wú)酶的參與可分為酶基傳感器和無(wú)酶?jìng)鞲衅鱗13-15]，酶基傳感器由于制備工藝復(fù)雜、成本高和穩(wěn)定性差而阻礙了其進(jìn)一步的發(fā)展[16]。相比之下，穩(wěn)定、低成本且高靈敏度的無(wú)酶葡萄糖傳感器引起了廣大研究人員的關(guān)注[17]。近年來(lái)，過(guò)渡金屬氧化物和氫氧化物被認(rèn)為是構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖傳感器的有效材料[18-20]，特別是極具前景的金屬鎳，由于其具有數(shù)量多、低毒性和高的電催化氧化葡萄糖活性的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖傳感器[21-23]。此外，利用碳基材料作為過(guò)渡金屬納米顆粒的基底可以有效改善電子傳導(dǎo)速率并增加活性位點(diǎn)的暴露數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一步水熱法制備了Ni2(CO3)(OH)2納米材料并將其原位生長(zhǎng)于碳紙上，構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖傳感器。以期成功用于2 款市售飲料中葡萄糖的檢測(cè)，為飲料中葡萄糖的檢測(cè)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼茶、功能飲料 市購(gòu)。

碳紙 蘇州晟爾諾科技有限公司；硝酸鎳（Ni(NO3)2g6H2O）、葡萄糖、無(wú)水乙醇、乙二醇、丙酮 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果糖、檸檬酸、乳糖、蔗糖、尿素、氫氧化鈉、抗壞血酸 上海瑞安有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI-660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；SQP分析天平 賽多列斯科學(xué)儀器有限公司；FCH-202數(shù)顯加熱磁力攪拌器 上海弗魯克有限公司；TGL-16M高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DHG-9036A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020真空干燥箱上海精宏有限公司；JP-040ST超聲波清洗器 深圳市浩盟牌清洗設(shè)備有限公司；FYF01水熱反應(yīng)釜 艾析五金專(zhuān)營(yíng)店；Smart Lab X射線(xiàn)衍射儀、SU4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 工作電極的制備

碳紙預(yù)處理：將整張一頁(yè)紙大小的碳紙裁剪成2 cmh3 cm，分別用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水對(duì)碳紙進(jìn)行超聲清洗20 min，然后在60 ℃真空干燥箱中烘干，備用。

用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.163 2 g硝酸鎳，0.900 9 g尿素，加入15 mL溶劑（乙二醇-水，5∶5，V/V），磁力攪拌20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯高溫反應(yīng)釜中，將預(yù)處理的碳紙移入反應(yīng)釜，密閉后放入烘箱，160 ℃高溫下連續(xù)反應(yīng)6 h。待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫后，將碳紙取出用無(wú)水乙醇和去離子水清洗，沖洗掉附著于碳紙表面的沒(méi)有完全生長(zhǎng)的材料，反應(yīng)釜中的溶液經(jīng)離心干燥后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料的表征。將碳紙放入真空干燥箱中60 ℃條件下6 h，得到Ni-CHs/CP電極（圖1）。

圖1 Ni-CHs/CP電極制備流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of Ni-CHs/CP electrode preparation process

1.3.2 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試使用三電極系統(tǒng)，Ni-CHs/CP為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極。設(shè)置電位窗口為0～0.7 V，掃描速率為0.1 V/s，在 0.1 mol/L的NaOH電解液中，對(duì)Ni-CHs/CP電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集自CHI660E電化學(xué)工作站，由Origin 2018繪圖，由Office制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ni-CHs/CP電極材料的表征

由圖2a可知，裸碳紙表面比較光滑，呈三維交織結(jié)構(gòu)。由圖2b、c可知，Ni-CHs納米顆粒將碳紙完全包裹使碳紙表面比較粗糙，增大了與電解液的接觸面積，其結(jié)構(gòu)是由大量小顆粒組成，具有許多納米級(jí)孔隙，增加了活性位點(diǎn)暴露的數(shù)量，從而提升了工作電極的電化學(xué)性能。由圖2d可知，Ni-CHs為顆粒狀，顆粒尺寸相對(duì)均一，約為100～150 nm。

圖2 裸碳紙（a）和不同放大倍數(shù)下的Ni-CHs/CP電極（b～d）掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of bare carbon paper (a) and Ni-CHs/CP at different magnifications (b-d)

由于碳紙自身的衍射峰強(qiáng)度過(guò)高，而無(wú)法明顯觀察到Ni-CHs的衍射峰，因此為了消除碳紙基體對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，對(duì)Ni-CHs粉末進(jìn)行X射線(xiàn)衍射分析，如圖3所示，在14.7°、17.5°、24.2°和34.7°處可觀察到4個(gè)強(qiáng)衍射峰，與鎳的堿式碳酸鹽Ni2(CO3)(OH)2的（020）、（120）、（130）、（-201）晶面（JCPDS No.35-0501）相對(duì)應(yīng)。表明所合成的材料為Ni-CHs。

圖3 Ni-CHs粉末的X射線(xiàn)衍射譜圖Fig.3 XRD spectrum of Ni-CHs powder

Ni-CHs是通過(guò)一步水熱法合成的，根據(jù)文獻(xiàn)[24]推斷其合成機(jī)理如下：

首先，尿素在加熱條件下水解，形成NH3·H2O和CO2（反應(yīng)1），隨后二者轉(zhuǎn)化為OH-和（反應(yīng)2和3），OH-、和Ni2+又形成Ni2(CO3)(OH)2（反應(yīng)4），這與所測(cè)的X射線(xiàn)衍射圖譜一致。

2.2 無(wú)酶葡萄糖傳感器的電化學(xué)表征

2.2.1 循環(huán)伏安曲線(xiàn)

在電化學(xué)工作站中，采用三電極體系考察所制備電極的電化學(xué)行為。分別在0.1 mol/L NaOH電解液和含有5 mmol/L葡萄糖的0.1 mol/L NaOH電解液中進(jìn)行Ni-CHs/CP電極的循環(huán)伏安掃描。

由圖4可知，裸碳紙?jiān)谄咸烟羌尤肭昂笱h(huán)伏安曲線(xiàn)并無(wú)明顯的變化，而當(dāng)負(fù)載了Ni-CHs納米粒子后，可觀察到一對(duì)明顯的氧化還原峰。這是由于Ni-CHs在堿性溶液中二價(jià)鎳離子與溶液中OH-結(jié)合生成三價(jià)鎳離子，即：Ni2(CO3)(OH)2被氧化為NiOOH[25]（反應(yīng)5），此過(guò)程中有電子的轉(zhuǎn)移，所以會(huì)產(chǎn)生峰電流。在加入5 mmol/L葡萄糖時(shí)氧化峰電流響應(yīng)有明顯提高，電流強(qiáng)度為9.56 mA/cm2，是沒(méi)加葡萄糖時(shí)的1.9 倍。這是因?yàn)樵趬A性介質(zhì)中，葡萄糖的氧化通常伴隨著一個(gè)多步驟的過(guò)程，高價(jià)態(tài)的NiOOH參與葡萄糖的氧化，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)自身又被還原為Ni2+（反應(yīng)6），這部分Ni2+在通電條件下在此又被氧化為Ni3+，產(chǎn)生一定的響應(yīng)電流，從而導(dǎo)致Ni2+/Ni3+氧化峰響應(yīng)電流強(qiáng)度的增加。

圖4 裸碳紙（a）和Ni-CHs/CP（b）在有/無(wú)葡萄糖存在下的循環(huán)伏安曲線(xiàn)Fig.4 CV curves of bare carbon paper (a) and Ni-CHs/CP (b) in the presence or absence of glucose

2.2.2 反應(yīng)類(lèi)型的判斷

為考察Ni-CHs/CP的表面動(dòng)力學(xué)過(guò)程，在0.1 mol/L NaOH電解液中，設(shè)置掃描速率為10 ～100 mV/s，由圖5可知，隨著掃描速率的增加，陽(yáng)極峰電流（Ipa）和陰極峰電流（Ipc）的絕對(duì)值均持續(xù)增加。同時(shí)，陽(yáng)極峰電位有一定的正移，陰極峰電位有一定的負(fù)移。這是因?yàn)槠咸烟羌捌溲趸闹虚g產(chǎn)物會(huì)被Ni-CHs/CP的活性位點(diǎn)吸附，從而占據(jù)了工作電極的活性位點(diǎn)使電解質(zhì)溶液中的葡萄糖不能及時(shí)的擴(kuò)散到工作電極表面，導(dǎo)致電極表面極化，使得峰電位有一定的偏移。為了進(jìn)一步研究Ni-CHs/CP電極檢測(cè)葡萄糖時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，對(duì)氧化峰和還原峰電流值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理可得二者與掃描速率平方根呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.998）。表明Ni-CHs/CP在電解質(zhì)溶液中催化氧化葡萄糖的過(guò)程受擴(kuò)散控制。

圖5 不同掃描速率下5 mmol/L葡萄糖在Ni-CHs/CP的循環(huán)伏安圖（A）和峰電流與掃描速率平方根的線(xiàn)性擬合圖（B）Fig.5 CV curves of 5 mmol/L glucose in Ni-CHs/CP at different scanning speeds (A) and linear fitting between peak current and square root of scanning rate (B)

2.2.3 傳感器對(duì)葡萄糖的時(shí)間-電流曲線(xiàn)

采用時(shí)間-電流曲線(xiàn)研究Ni-CHs/CP電極對(duì)葡萄糖的檢測(cè)性能。對(duì)工作電位進(jìn)行優(yōu)化，由圖4b可知，葡萄糖發(fā)生氧化的電位區(qū)間在0.48～0.53 V之間，因此選擇0.48、0.5、0.53 V為工作電壓。在NaOH電解液中從400～1 200 s，每隔100 s加入0.1 mmol/L的葡萄糖溶液，所得不同電位下的時(shí)間-電流曲線(xiàn)如圖6所示。

由圖6可知，當(dāng)電位為0.48 V時(shí)，產(chǎn)生的電流比較穩(wěn)定但電流階梯型最小。電位為0.53 V時(shí)，有較好的電流響應(yīng)，但與0.50 V下的時(shí)間-電流曲線(xiàn)相比其電流響應(yīng)較低，且0.53 V的高電位下，電極表面會(huì)發(fā)生析氧反應(yīng)，產(chǎn)生的氧氣堵塞電子的傳輸通道，從而影響Ni-CHs/CP電極對(duì)葡萄糖的催化氧化性能[26]。所以最終選擇0.50 V為該電極的最佳工作電位。

圖6 不同電位下連續(xù)添加0.5 mmol/L葡萄糖的時(shí)間-電流曲線(xiàn)Fig.6 Time-current curves with successive addition of 0.5 mmol/L glucose under different potentials

在最佳的工作電位下，依次向勻速攪拌的電解液中加入一定濃度的葡萄糖溶液，得到的時(shí)間-電流曲線(xiàn)如圖7所示。

圖7 Ni-CHs/CP電極的時(shí)間-電流曲線(xiàn)Fig.7 Time-current curve with Ni-CHs/CP electrode

由圖7可知，當(dāng)向體系中加入特定濃度的葡萄糖時(shí)，Ni-CHs/CP電極會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為0.95 μmol/L時(shí)，傳感器對(duì)其產(chǎn)生響應(yīng)。插圖顯示，加入葡萄糖時(shí)電流響應(yīng)在3.5 s內(nèi)就可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，表明Ni-CHs/CP電極對(duì)葡萄糖的響應(yīng)速度較快。對(duì)葡萄糖濃度及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流強(qiáng)度計(jì)算擬合后的線(xiàn)性如圖8所示，擬合方程式為y=0.546 32x+0.720 8（R2=0.994）和y=1.252 8x+0.084 06（R2=0.983）。由此可知Ni-CHs/CP電極催化氧化葡萄糖的線(xiàn)性范圍為0.950 μmol/L～1.023 mmol/L和1.223～2.623 mmol/L，檢測(cè)的靈敏度為1 252 μAgmmol/（Lgcm），基于公式[27]：檢出限（limit of detection，LOD）為3σ/S，其中σ為10 組空白樣品度量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為線(xiàn)性回歸的斜率。計(jì)算出檢測(cè)限為0.31 μmol/L（信噪比為3∶1）。

圖8 Ni-CHs/CP電極的電流強(qiáng)度與葡萄糖濃度的線(xiàn)性擬合圖Fig.8 Linear fitting of current intensity of Ni-CHs/CP electrode versus glucose concentration

由表1可知，Ni-CHs/CP電極具有檢測(cè)范圍較寬、LOD低和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)葡萄糖的檢測(cè)具有較好的應(yīng)用前景。

表1 Ni-CHs/CP傳感器與其他已報(bào)道無(wú)酶?jìng)鞲衅鞯男阅軐?duì)比Table 1 Performance comparison between Ni-CHs/CP sensor and other reported enzyme-free sensors

2.3 傳感器的選擇性及穩(wěn)定性

對(duì)于葡萄糖傳感器的進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用，抗干擾性能和穩(wěn)定性非常的重要。飲料產(chǎn)品中除含有大量水之外，一般還含有乳糖、果糖、抗壞血酸、檸檬酸、蔗糖、食用香精及其他添加劑等。選擇具有代表性的干擾物質(zhì)對(duì)所制備傳感器的選擇性進(jìn)行考察。在0.5 V的工作電位下，通過(guò)時(shí)間-電流法在電解液中邊攪拌邊連續(xù)添加乳糖、氯化鈉、抗壞血酸、檸檬酸、蔗糖、果糖和葡萄糖。如圖9a所示，加入葡萄糖時(shí)工作電極有明顯的電流響應(yīng)，加入稀釋100 倍的干擾物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生的電流響應(yīng)很小，可以忽略不計(jì)。加入同等濃度的干擾物質(zhì)時(shí)，乳糖、氯化鈉、抗壞血酸、檸檬酸、蔗糖產(chǎn)生的電流響應(yīng)非常微弱，果糖的產(chǎn)生的電流響應(yīng)遠(yuǎn)小于葡萄糖的電流響應(yīng)強(qiáng)度僅為葡萄糖的18%，且再次加入葡萄糖所產(chǎn)生的電流強(qiáng)度與第1次加入等量葡萄糖時(shí)產(chǎn)生的電流強(qiáng)度數(shù)值相近，表明干擾組分對(duì)自支撐Ni-CHs/CP電極的影響較小，由此可知Ni-CHs/CP電極對(duì)葡萄糖具有良好的選擇性。

圖9 Ni-CHs/CP電極的選擇性（a）和穩(wěn)定性（b）測(cè)試Fig.9 Selectivity (a) and stability (b) of Ni-CHs/CP electrode

在實(shí)際應(yīng)用中，工作電極的穩(wěn)定性也是評(píng)估傳感器性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，采用循環(huán)伏安法在含有5 mmol/L葡萄糖的0.1 mol/L NaOH電解質(zhì)溶液中連續(xù)循環(huán)60次，取第1圈和第60圈作圖，結(jié)果如圖9b所示，Ni-CHs/CP電極循環(huán)第1圈與循環(huán)60圈相比峰值電流強(qiáng)度幾乎保持不變，表明此工作電極對(duì)葡萄糖的檢測(cè)具有良好的循環(huán)穩(wěn)定性。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ni-CHs/CP電極的實(shí)用性，對(duì)市售的2 款飲料進(jìn)行檢測(cè)。利用加標(biāo)回收率評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用時(shí)間-電流曲線(xiàn)進(jìn)行加標(biāo)后樣品的電化學(xué)檢測(cè)。取10 μL 0.12 mmol/L的樣品1加入連續(xù)攪拌的0.1 mol/L NaOH電解液中，隨后每隔100 s連續(xù)添加10 μL（0.05、0.10、0.15 mmol/L）的葡萄糖，記錄到的電流-時(shí)間曲線(xiàn)如圖10a所示，當(dāng)待測(cè)液加入到電解液體系中時(shí)在極短的時(shí)間內(nèi)響應(yīng)電流就可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。圖10b表明，工作電極表面產(chǎn)生的電流強(qiáng)度和所添加葡萄糖濃度之間呈現(xiàn)較好的線(xiàn)性關(guān)系，擬合方程式為y=0.590 92x+0.095 43，相關(guān)系數(shù)R2=0.990，以同樣的方法對(duì)樣品2進(jìn)行加標(biāo)回收。表2為根據(jù)圖10b的線(xiàn)性曲線(xiàn)計(jì)算出的葡萄糖濃度，與GB 5009.8ü2016《食品中果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》中高效液相色譜法檢測(cè)食品中葡萄糖的測(cè)定結(jié)果一致，加標(biāo)回收率為95.65%～105.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.12%～5.86%，表明Ni-CHs/CP電極在實(shí)際樣品葡萄糖檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景，為葡萄糖的檢測(cè)提供新的思路。

表2 飲料中葡萄糖的檢測(cè)Table 2 Results of determination of glucose in beverage samples

圖10 Ni-CHs/CP在實(shí)際樣本中連續(xù)添加0.05 mmol/L葡萄糖時(shí)的電流-時(shí)間曲線(xiàn)（a）和電流強(qiáng)度-葡萄糖濃度的線(xiàn)性擬合圖（b）Fig.10 Current-time curve of Ni-CHs/CP when 0.05 mmol/L glucose was continuously added to the actual sample (a) an linear fitting of current intensity versus glucose concentration (b)

3 結(jié) 論

基于鎳基堿式碳酸鹽對(duì)葡萄糖良好的電催化性能，本研究制備N(xiāo)i2(CO3)(OH)2納米粒子，通過(guò)水熱法原位生長(zhǎng)于碳紙基底上成功構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖傳感器。在0.950 μmol/L～1.023 mmol/L和1.223～2.623 mmol/L范圍內(nèi)修飾電極峰電流強(qiáng)度與葡萄糖濃度存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，LOD可達(dá)0.31 μmol/L。利用此法對(duì)市售2 款飲料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與GB 5009.8ü2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》中高效液相色譜法檢測(cè)食品中葡萄糖的測(cè)定結(jié)果一致。與已報(bào)道的其他葡萄糖檢測(cè)方法相比較，該檢測(cè)方法電極具有制備簡(jiǎn)單、快速、靈敏的特點(diǎn)，為飲料中葡萄糖的檢測(cè)提供了新的思路。