董 浩,徐 燕,吳家大,冼燕萍,楊 娟,于立梅,錢 敏,曾曉房,*,白衛(wèi)東,*
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東 州 510225;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣東 廣州 510225;3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,食品安全預(yù)警研發(fā)中心,廣東 廣州 510447)
雜環(huán)胺是富含蛋白質(zhì)的食品在熱加工過程中由蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類以及其他物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)或裂解反應(yīng)而生成的一類致癌、致突變化合物[1-2]。迄今已經(jīng)從食品中分離和鑒定出約30種雜環(huán)胺,主要常見于油炸、油煎、燒烤類肉制品中[3-4]。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)和生成途徑的不同,雜環(huán)胺可分為兩大類,分別為氨基咪唑氮雜芳烴類和氨基咔啉類,其中氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺在200 ℃以下加熱條件下就能形成,而氨基咔啉類雜環(huán)胺一般在200 ℃以上由氨基酸或蛋白質(zhì)受熱降解生成[5]。人體若攝入過多含有雜環(huán)胺的食物,將可能導(dǎo)致體內(nèi)肝臟、胃腸道、膀胱、皮膚以及口腔等多種器官產(chǎn)生病變[6]。因此,肉制品熱加工過程中雜環(huán)胺的控制受到眾多相關(guān)研究人員的關(guān)注[7-9]。
肉制品中雜環(huán)胺的生成受到多種因素影響,如肉種類、烹調(diào)方式、加熱溫度和時間、前體物和脂質(zhì)種類以及水分含量等,通過選擇合適的烹調(diào)方式和加工條件能夠一定程度減少雜環(huán)胺的生成[10]。大量研究表明,水煮等低溫烹飪方式相對于油炸等高溫烹飪方式會產(chǎn)生更少的雜環(huán)胺[11-16]。但由于油炸或者油煎過程能夠提升肉的風(fēng)味,增進(jìn)食欲,因此油煎等烹飪方式深受消費(fèi)者喜愛。加熱溫度和時間是影響雜環(huán)胺種類和含量的主要因素,降低加工溫度、減少加工時間可有效降低雜環(huán)胺在肉制品中的生成[17]。雖然烹飪方式、加熱溫度、加熱時間等因素對肉制品中雜環(huán)胺的影響研究已有較多報道[18-22],但研究多集中在加工條件對氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺生成的影響,且加工鍋具、食用油等熱加工條件對肉制品中雜環(huán)胺種類和含量的研究還相對較少[23-24]。
因此,本實(shí)驗(yàn)以2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole,MeAαC)、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole,AαC)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(1-methyl-9H-pyrido[3,4-b]indole,Harman)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(9H-pyrido[3,4-b]indole,Norharman)、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]-吲哚(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]-indole,Trp-P-1)和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole,Trp-P-2)6種氨基咔啉類雜環(huán)胺為研究對象,建立一種同時測定豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測方法。重點(diǎn)研究加工條件(如油煎時間、油種類、鍋具、肉餅尺寸等)對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成的影響,以期為烹飪條件的合理選擇和肉制品熱加工過程中雜環(huán)胺的減控提供數(shù)據(jù)支撐和方法指導(dǎo)。
排酸后冷鮮豬肉,購自廣州市海珠區(qū)家樂福超市。
MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于0.995) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國Merck公司;甲酸、乙酸銨(均為色譜純) 美國CNW公司;氨水(分析純) 國藥化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。
StrataTM-X-C固相萃取柱(60 mg/3 mL) 美國Phenomenex公司;Ulimate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive Focus四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 美國Thermo Fisher Scientific公司;MS3digital渦旋混合器美國IKA公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;N-EVAP 112水浴氮吹儀 美國OA公司;KQ-500E超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;KDC-40低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 豬肉餅的制備
去除樣品肉中可見脂肪及筋膜,放入絞肉機(jī)制成肉糜,攪拌均勻后,稱取40 g肉糜制作不同直徑(4、6、8、10 cm)圓形肉餅,于4 ℃的冰箱中保存6~8 h備用。
1.3.2 樣品前處理
稱取1 g待測樣品于50 mL離心管中,加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液和6 mL乙腈,均質(zhì)30 s后加入1.5 g NaCl,渦旋2 min,4 500 r/min離心5 min,將上層溶劑轉(zhuǎn)移到15 mL玻璃管中,殘?jiān)性偌尤? mL乙腈萃取1次,合并乙腈層,在40 ℃下氮吹至約2 mL,待凈化。
預(yù)先用甲醇、超純水、體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液各3 mL,將StrataTM-X-C固相萃取柱活化和平衡。將提取液全部通過StrataTM-X-C固相萃取柱(60 mg/3 mL)。依次用3 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、3 mL超純水和3 mL甲醇淋洗,再用4 mL甲醇-氨水(90∶10,V/V)洗脫,洗脫液在40 ℃下氮吹至干,用流動相定容至1.0 mL,渦旋30 s,過0.22 μm濾膜,待超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測。
1.3.3 雜環(huán)胺檢測
標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇溶解并定容,配成單標(biāo)儲備液;再用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時,用初始流動相(1 mmol/L乙酸銨溶液(含0.05%甲酸)-乙腈,95∶5,V/V)配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
色譜條件:色譜柱Agilent Poroshell 120-EC-C18(150 mmh2.1 mm,2.7 μm),柱溫30℃;流動相A:1 mmol/L乙酸銨溶液(含0.05%乙酸);流動相B:乙腈;梯度洗脫程序:0~1 min,90% A、10% B;1~6.5 min,90%~80% A、10%~20% B;6.5~7.5 min,80%~5% A、20%~95% B;7.5~9.0 min,5% A、95% B;9.0~10 min,5%~90% A、95%~10% B;10~12 min,90% A、10% B。進(jìn)樣量5 μL;流速0.3 mL/min。
質(zhì)譜條件:電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)源,正離子模式;噴霧電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度320 ℃;噴霧溫度250 ℃;鞘氣壓力45 arb;輔助氣壓力8 arb;S-LensRF電壓50 V;噴霧氣/碰撞氣:氮?dú)?。利用正離子Full MS模式進(jìn)行掃描,F(xiàn)ull MS一級全掃描范圍m/z50~650,分辨率70 000,自動增益控制106,自動注入時間100 ms;dd-MS2二級掃描自動增益控制105,分辨率17 500,自動注入時間60 ms,各化合物的歸一化碰撞能量設(shè)為80%、100%、120%,動態(tài)排除設(shè)為8 s。
1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)計算
選取3種不同油煎條件制備的豬肉餅樣品混合均勻,添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后,按照1.3.2節(jié)前處理后上機(jī),以目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線;以初始流動相作為純?nèi)軇渲撇煌瑵舛然旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液,獲得純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線?;|(zhì)效應(yīng)為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值。
1.3.5 油煎豬肉餅的制備
將上述制備的豬肉餅(直徑8 cm)置于平底不粘鍋中煎制,固定油煎溫度225 ℃,加工5 min(2.5 min翻面),考察玉米油、花生油、菜籽油、橄欖油、大豆油5種家庭常用油對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響;使用花生油,固定油煎溫度225 ℃,考察不同油煎時間(1、2、3、4、5 min)對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。使用花生油,固定豬肉餅直徑8 cm、油煎溫度225 ℃,加工5 min(2.5 min翻面),考察不粘鍋、電磁鍋、鐵鍋和復(fù)合涂層鍋4種鍋具對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。使用花生油、平底不粘鍋,固定油煎溫度225 ℃,加工5 min(2.5 min翻面),考察肉餅直徑(4、6、8、10 cm)對油煎豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺含量的影響。
采用Microsoft Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù),每組實(shí)驗(yàn)平行測定3次,結(jié)果以 fs表示;采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析,采用方差分析、Duncan多重范圍檢驗(yàn)差異顯著性分析;使用Origin 8.1軟件進(jìn)行圖表繪制。
6種氨基咔啉類雜環(huán)胺在ESI+模式下均得到[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰。根據(jù)獲得的6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的一級質(zhì)譜以及二級碎片離子質(zhì)譜,得到6種氨基咔啉類雜環(huán)胺分子母離子分子質(zhì)量的測定值和理論值、質(zhì)量精確度。由表1可知,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的質(zhì)量偏差絕對值均小于3.0,符合歐盟指令2002/657/EC中的定性確證準(zhǔn)則。根據(jù)保留時間與準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量可實(shí)現(xiàn)對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的準(zhǔn)確定性。
以3 倍信噪比確定方法檢出限,以10 倍信噪比確定方法定量限。以目標(biāo)物定量離子峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,得到6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的線性回歸方程。由表1可知,MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2這6種氨基咔啉類雜環(huán)胺在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.996。方法檢出限為0.02~0.15 μg/kg,定量限為0.05~0.5 μg/kg,表明方法具有較好的靈敏度。方法基質(zhì)效應(yīng)為0.93~1.16,基本可以忽略。
表1 6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定數(shù)據(jù)和方法性能參數(shù)Table 1 Accurate mass number data of six amino-caroline HAAs and analytical figures of merit of the proposed method
2.3.1 提取溶劑的確定
雜環(huán)胺結(jié)構(gòu)中的氨基或環(huán)上的氮原子具有不同的解離常數(shù)(pKa),這使得6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的pKa值存在較大差異,MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2的pKa值分別為7.08、6.79、8.62、7.85、10.88和10.59。提取溶劑的選擇需要同時兼顧不同非極性的雜環(huán)胺。此外,肉制品富含油脂,應(yīng)盡量減少油脂的干擾。通過分析發(fā)現(xiàn),極性過強(qiáng)的甲醇會提取出樣品中較多油脂等雜質(zhì),提取溶液呈黏稠狀,固相萃取凈化時容易堵塞固相萃取柱,增加后續(xù)凈化難度[25]。二氯甲烷和乙酸乙酯對雜環(huán)胺類化合物回收率較低,大部分目標(biāo)雜環(huán)胺的回收率低于30%。而乙腈極性范圍大,其分子較小,具有較強(qiáng)的組織穿透能力和良好的沉淀效果,尤其是對脂肪、蛋白質(zhì)類化合物,對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺類化合物均有較高的提取率,提取溶液氮吹濃縮后殘留物較少。適當(dāng)引入堿性水溶液有利于樣品分散,使目標(biāo)化合物被更充分提取。因此,考察0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L NaOH溶液對目標(biāo)雜環(huán)胺的提取效率。由圖1A可知,隨著NaOH濃度的增大,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的回收率整體呈上升趨勢,在NaOH濃度1 mol/L時回收率最佳,目標(biāo)雜環(huán)胺的回收率均在68%以上,且在實(shí)驗(yàn)過程中觀察到1 mol/L NaOH的提取溶液在氮吹濃縮時渾濁度最弱,氮吹濃縮后殘留物更少,基質(zhì)效應(yīng)低,表明提取出的油脂最少;原因可能是堿液加入使部分油脂皂化水解,起到一定的除脂效果[26]。但提取體系NaOH濃度過高(2 mol/L)時,則容易出現(xiàn)乳化,不利于分層,影響目標(biāo)物在乙腈層的分配,從而降低了雜環(huán)胺的提取回收率。最終采用乙腈-1 mol/L NaOH溶液作為提取溶劑。
圖1 NaOH濃度(A)、NaCl添加量(B)、固相萃取柱(C)和洗脫液(D)對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.1 Effects of NaOH concentration (A), NaCl addition (B), solid phase extractioncartridges (C) and eluents (D) on the recoveries of six amino-carboline HAAs
2.3.2 NaCl添加量的確定
研究發(fā)現(xiàn),萃取過程中添加1 g NaCl可顯著提高1 g漢堡肉餅樣品中雜環(huán)胺的萃取效率,而添加超過1 g NaCl,鹽析效果并沒有顯著提高[27]。由圖1B可知,不添加NaCl時,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺中只有MeAαC、Harman和Norharman的回收率在60%以上,其余均在60%以下,表明不添加NaCl時目標(biāo)雜環(huán)胺的提取效果較差。添加1.0 g NaCl時,雜環(huán)胺提取回收率顯著提高,但AαC、Trp-P-1這兩種雜環(huán)胺的回收率仍低于70%。NaCl添加量1.5 g時,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的提取回收率均相對較高;NaCl添加量增加到2.0、3.0 g時,大多數(shù)雜環(huán)胺的回收率變化不明顯。因此,最終選擇添加1.5 g NaCl以獲得較優(yōu)的目標(biāo)雜環(huán)胺回收率。
2.3.3 固相萃取柱的選擇
比較StrataTM-X-C柱(60 mg/3 mL)、Cleanert PCX柱(60 mg/3 mL)、Waters Oasis MCX柱(60 mg/3 mL)3種陽離子交換型固相萃取柱對6種氨基咔啉類雜環(huán)胺提取回收率的影響。按照固相萃取柱填料的吸附原理優(yōu)化各自上樣溶液、淋洗和洗脫溶液。由圖1C可知,采用StrataTM-X-C柱凈化,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺均可獲得較好的凈化效果,回收率在70%以上,儀器檢測顯示基質(zhì)抑制效應(yīng)降低。StrataTM-X-C柱為鍵合了苯磺酸官能團(tuán)的強(qiáng)陽離子交換柱,與雜環(huán)胺上的—N+可形成較強(qiáng)的離子鍵,可以用水和甲醇充分淋洗進(jìn)行除雜,提高目標(biāo)雜環(huán)胺的提取回收率。采用Cleanert PCX柱和Waters Oasis MCX柱凈化,儀器檢測顯示基質(zhì)抑制效應(yīng)較強(qiáng),目標(biāo)雜環(huán)胺回收率較低。綜上所述,最終采用StrataTM-X-C固相萃取柱對提取溶液進(jìn)行凈化。
2.3.4 洗脫液的確定
由圖1D可知,當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)10%時,除AαC、Trp-P-2,其他4種氨基咔啉類雜環(huán)胺的提取回收率顯著增加,并達(dá)到最佳,而氨水體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%和30%時,回收率顯著降低。在甲醇-氨水體積比90∶10,雜環(huán)胺整體回收率為64%~91%,優(yōu)于體積比為95∶5、80∶20和70∶30時的整體回收率。因此采用甲醇-氨水(90∶10,V/V)作為洗脫液。
綜上,最終確定6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的最優(yōu)提取和凈化條件為:1 g樣品中添加1.5 g NaCl、10 mL 1 mol/L NaOH溶液-乙腈(4∶6,V/V)提取,StrataTM-X-C柱凈化,甲醇-氨水(90∶10,V/V)洗脫。
如表2所示,不同油對豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺生成具有顯著影響,橄欖油煎制豬肉餅中6種雜環(huán)胺生成總量(4.37 μg/kg)低于其他4種油煎制豬肉餅。這可能是因?yàn)橄啾扔衩子?、花生油、菜籽油、大豆油,橄欖油中含有多酚等抗氧化物質(zhì)更豐富,這些物質(zhì)可通過清除參與雜環(huán)胺形成途徑中的自由基從而抑制雜環(huán)胺的生成[24]。有研究發(fā)現(xiàn)橄欖油、葵花籽油和榛子油等對雜環(huán)胺形成能起到抑制效果,原因可能是這幾種油中不飽和脂肪酸較多,會對雜環(huán)胺形成過程中的美拉德反應(yīng)造成干擾,破壞反應(yīng)進(jìn)行,從而發(fā)揮抑制雜環(huán)胺形成的效果;也有研究認(rèn)為是由于其中的共軛亞油酸具有較強(qiáng)的抗氧化作用,從而對雜環(huán)胺的形成產(chǎn)生抑制作用[28]。
表2 油種類對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 2 Effects of cooking oil types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg
如表3所示,油煎時間對豬肉餅中雜環(huán)胺的產(chǎn)生具有顯著影響,隨著油煎時間的延長,Trp-P-2、MeAαC和Norharman 3種雜環(huán)胺的生成量顯著增加(P<0.05)。Dong等[29]研究發(fā)現(xiàn)230 ℃煎炸16 min牛肉餡餅中Norharman和Harman的含量分別約為煎炸4 min樣品的18 倍和12 倍。
表3 油煎時間對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 3 Effect of pan-frying time on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg
如表4所示,采用不同鍋具油煎豬肉餅生成的雜環(huán)胺總量依次為不粘鍋<電磁鍋<鐵鍋<復(fù)合涂層鍋的趨勢。使用不粘鍋(聚四氟乙烯涂層)和電磁鍋油煎過程中肉餅不粘連且受熱均勻,從而減少雜環(huán)胺的生成[10]。
表4 油煎鍋具對油煎豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響Table 4 Effect of pot types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg
肉的表面積和形狀也是影響熱加工豬肉餅中雜環(huán)胺類型和含量的重要因素之一[30]。如表5所示,油煎豬肉餅中雜環(huán)胺的種類及含量隨著豬肉餅直徑的減小顯著變化(P<0.05)。在直徑8 cm和10 cm的肉餅中僅檢測到Norharman,含量分別為0.89 μg/kg和0.52 μg/kg。直徑6 cm時檢測到3種氨基咔啉類雜環(huán)胺,分別為AαC(0.05 μg/kg)、Harman(0.06 μg/kg)和Norharman(1.48 μg/kg),但當(dāng)直徑為4 cm時,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺均有檢出,總含量為29.33 μg/kg,遠(yuǎn)高于10 cm的0.52 μg/kg。因此,肉制品尺寸對雜環(huán)胺生成含量有重要影響,豬肉餅直徑越小,雜環(huán)胺生成含量越高。
表5 肉餅尺寸對豬肉餅中雜環(huán)胺含量的影響Table 5 Effect of patty thickness on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg
本研究首先建立一種超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜同時測定熱加工豬肉餅中6種氨基咔啉類雜環(huán)胺的檢測方法。優(yōu)化后,1 g樣品選用1 mol/L NaOH溶液-乙腈作為提取試劑,添加1.5 g NaCl進(jìn)行萃取,采用StrataTM-X-C柱凈化,用甲醇-氨水溶液(90∶10,V/V)洗脫。在上述條件下,6種氨基咔啉類雜環(huán)胺全部實(shí)現(xiàn)分離,且峰型良好。方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。進(jìn)一步探究油煎條件對豬肉餅中雜環(huán)胺生成的影響。結(jié)果表明,油種類對雜環(huán)胺生成影響顯著,菜籽油煎制豬肉餅中雜環(huán)胺含量最高,橄欖油煎制豬肉餅中最低。采用不同鍋具煎制所產(chǎn)生的雜環(huán)胺含量為復(fù)合涂層鍋>鐵鍋>電磁鍋>不粘鍋;不同尺寸豬肉餅煎制后產(chǎn)生的雜環(huán)胺含量也不同,豬肉餅直徑越小,雜環(huán)胺生成量越高。研究結(jié)果可為油炸肉制品中雜環(huán)胺的檢測和減控提供數(shù)據(jù)支撐和方法指導(dǎo)。