基于轉(zhuǎn)錄組揭示底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸的分子機(jī)制

李 甜，葛正凱，陳 宇，蘇聰燕，徐曉裕，史學(xué)偉，王 斌*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832001）

醋酸菌是一類能將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸的專性好氧革蘭氏陰性菌，廣泛分布于含糖和含乙醇的酸性環(huán)境中，是釀造食醋的主要菌種[1]。醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的催化下將乙醇氧化為乙醛，進(jìn)一步在乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的催化作用下將乙醛氧化為乙酸，積累大量醋酸[2]。到目前為止，醋酸菌已被鑒定出19個屬和92個種，其中，用于釀造食醋的醋酸菌主要來自醋酸桿菌屬和駒形桿菌屬[3]。醋酸桿菌主要用于釀造酸度較低的米醋和果醋，而駒形桿菌則用于釀造酸度較高的酒精醋[3-4]。巴氏醋桿菌是我國醋制品釀造過程中的主要微生物之一，尤其是巴氏醋桿菌CICC 20001廣泛應(yīng)用于食醋和各類果醋飲料發(fā)酵，如葡萄醋、山楂醋和荔枝蜜醋等[5-7]。

醋酸是一種高效的抗菌化合物，可防止發(fā)酵食品中腐敗性和致病性微生物的生長[8]。當(dāng)細(xì)胞中醋酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞膜的生理功能，不利于菌株的生長及代謝活動，而醋酸菌則能生產(chǎn)和耐受較高濃度醋酸，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸特性[9]。醋酸菌耐酸分子機(jī)制成為醋酸菌代謝研究熱點(diǎn)之一。研究表明，醋酸菌能通過細(xì)胞膜保護(hù)機(jī)制[10]、醋酸同化[11]，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)[12]和分子伴侶[13]等途徑抵抗醋酸對醋酸菌的毒害性作用。原核生物對酸變化的應(yīng)答體現(xiàn)在從基因水平到表型水平的多個層次上，而轉(zhuǎn)錄水平是其中關(guān)鍵的一環(huán)。轉(zhuǎn)錄組是不同類型細(xì)胞或組織在不同條件下所包含的不同基因表達(dá)譜，即全部轉(zhuǎn)錄本的序列信息[14]。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已廣泛應(yīng)用于全面探究生物體的復(fù)雜生命活動。Sakurai等[15-16]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法探討了醋酸菌在不同碳源和含乙醇培養(yǎng)基上生長過程中基因表達(dá)譜的變化。Xia Kai等[17]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了巴氏醋桿菌Ab3在高酸脅迫下的響應(yīng)機(jī)制。

盡管醋酸菌能生產(chǎn)醋酸，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醋酸對醋酸菌仍會產(chǎn)生一定毒性，導(dǎo)致醋酸菌的生長和產(chǎn)酸效率低下。因此，實(shí)現(xiàn)醋酸菌細(xì)胞適應(yīng)度與醋酸合成之間的平衡是提高醋酸產(chǎn)率的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。食醋發(fā)酵過程中，添加一定量底物醋酸能提高醋酸菌產(chǎn)酸速率，縮減生產(chǎn)成本[18]。研究表明添加0.5%底物醋酸能提高巴氏醋桿菌產(chǎn)酸效率，但底物醋酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸的分子機(jī)制仍不清晰[19]。本實(shí)驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)0.5%底物醋酸并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，通過篩選差異表達(dá)基因和代謝通路分析，探討添加底物醋酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸的分子機(jī)制，旨在為提高醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸速度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

所用菌株為巴氏醋桿菌CICC 20001，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

GYPE培養(yǎng)基：1 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、6%無水乙醇；GYPA培養(yǎng)基：1 g/L葡萄糖、2 g/L蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、6%無水乙醇、0.5%無水乙酸。pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水乙酸 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、TIANGEN?試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Ribo-zeroTM試劑盒 美國Epicentre公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XFH-50CA全自動高壓滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；BCM-1000/1300/1600A超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSD-YX3400立式雙層智能精密型搖床 杭州俊升科學(xué)器材有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)、Nanodrop 2000C核酸蛋白檢測儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；2100生物分析儀 安捷倫科技（中國）有限公司；GeI Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保藏在甘油管中的菌株接種在100 mL GYPA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。當(dāng)培養(yǎng)液發(fā)酵到達(dá)對數(shù)期（OD660nm＞0.5）時，取5 mL培養(yǎng)液接種至100 mL新鮮的GYPA培養(yǎng)基中。當(dāng)新轉(zhuǎn)接的GYPA培養(yǎng)基發(fā)酵達(dá)到對數(shù)期時，將培養(yǎng)液倒入50 mL離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，去除上清液，并加入50 mL GYPE培養(yǎng)基構(gòu)成種子液。此實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液均在170 r/min、30 ℃搖床中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中所用的無水乙醇及無水乙酸均用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾處理。

1.3.2 添加底物醋酸啟動醋酸發(fā)酵生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

向100 mL的GYPE培養(yǎng)基中分別加入不同體積分?jǐn)?shù)（0%和0.5%）醋酸溶液，取5 mL種子液于上述培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每隔24 h取樣。在波長660 nm處測定體積分?jǐn)?shù)0%和0.5%底物醋酸溶液發(fā)酵時的吸光度。以O(shè)D660nm為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制醋酸發(fā)酵生長曲線，觀察其生長情況。用5 g/L的酚酞作指示劑，0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定至微粉色并且30 s后不變色即為滴定終點(diǎn)量。以醋酸的凈增加量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制不同底酸啟動醋酸發(fā)酵的產(chǎn)酸曲線，觀察各個培養(yǎng)物之間的產(chǎn)酸情況。產(chǎn)酸量[19]按下式計算：

式中：V0為未發(fā)酵樣液消耗的氫氧化鈉溶液體積/mL；V1為發(fā)酵樣液消耗的氫氧化鈉溶液體積/mL；V2為取樣體積/mL；C為氫氧化鈉溶液的濃度/（mol/L）；60為醋酸的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組分析

1.3.3.1 RNA樣品的制備

從種子液中取5 mL培養(yǎng)液分別加入GYPE和GYPA培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。以不加醋酸的發(fā)酵為對照組，以添加0.5%底物醋酸的發(fā)酵為實(shí)驗(yàn)組，分別在巴氏醋桿菌發(fā)酵早期（1 d）和中后期（7 d）4個點(diǎn)進(jìn)行取樣，每個樣品設(shè)置3次平行。將發(fā)酵液倒入50 mL離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，迅速放入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 RNA的提取，文庫建立及轉(zhuǎn)錄測序

采用Trizol法提取醋酸菌細(xì)胞中的總RNA[20]。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性以及是否有g(shù)DNA的污染，使用核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度（OD260/280=1.8～2.2），以及生物分析儀精確檢測RNA的完整性（Rin＞6.5）。質(zhì)量合格的RNA樣品用于文庫構(gòu)建，通過Ribo-zeroTM試劑盒去除rRNA，并將mRNA片段化，以mRNA為模板，添加dNTP將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和接頭，再進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，并純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測序。高通量測序得到的樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過CASAVA堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始序列Raw reads。對Raw reads進(jìn)行過濾，除去里面含有接頭的Reads、去除N的比例大于10%的Reads和除去低質(zhì)量的Reads后，獲得Clean reads，以保證信息分析質(zhì)量。從基因組網(wǎng)站直接下載A.pasteurianusIFO 3283-01的參考基因組和基因模型標(biāo)注文件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013209.1?report=fasta）。使用Bowtie 2建立參照基因組指數(shù)和將Clean reads與參照基因組比對，獲取其在參考基因組上的位置信息。

1.3.3.3 基因差異表達(dá)分析和富集分析

采用HTSeq對各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，根據(jù)每百萬碎片中來自某一基因每千堿基的轉(zhuǎn)錄本所包含的碎片數(shù)目（fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM）計算每個基因的表達(dá)水平[21]?？疾焯砑?%和0.5%底物醋酸時發(fā)酵早期（Z2 vs Z1；Z2為加0.5%底物醋酸發(fā)酵1 d，Z1為不加醋酸發(fā)酵1 d）和發(fā)酵中后期（F2 vs F1；F2為加0.5%底物醋酸發(fā)酵7 d，F(xiàn)1為不加醋酸發(fā)酵7 d）的差異表達(dá)基因。利用edgeR對結(jié)果進(jìn)行差異表達(dá)分析并獲得差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）[22]。選擇顯著DEGs的標(biāo)準(zhǔn)如下：1）|log2Fold Change|＞1.0，2）統(tǒng)計學(xué)顯著性水平P＜0.05；使用SPSS 25.0進(jìn)行顯著性分析。通過基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析（http://www.geneontology.org）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析（http://www.genome.jp/kegg/）獲得基因注釋列表。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加底物醋酸對巴氏醋桿菌發(fā)酵的影響

本課題組前期研究表明，加入一定濃度的底物醋酸能夠促進(jìn)醋酸發(fā)酵，但底酸促進(jìn)醋酸發(fā)酵的分子機(jī)理尚不明確[19]。本實(shí)驗(yàn)以不添加底物醋酸為空白對照，考察添加0.5%底物醋酸對巴氏醋桿菌CICC 20001發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)酸的影響。

由圖1可知，巴氏醋桿菌CICC 20001的生長量與發(fā)酵時間呈正相關(guān)，并且0.5%底物醋酸添加量下的生長量高于不加醋酸的對照組。添加0.5%底物醋酸時，巴氏醋桿菌CICC 20001的產(chǎn)酸量明顯高于空白對照，增加的趨勢具有顯著性。由此可見，添加合適體積分?jǐn)?shù)醋酸可以促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001的發(fā)酵，但是底酸的添加量與醋酸的產(chǎn)量并不呈正相關(guān)[23]。選擇發(fā)酵第1天（發(fā)酵早期）和第7天（發(fā)酵中后期）取樣以獲取轉(zhuǎn)錄組樣品。

圖1 添加底酸對巴氏醋桿菌CICC 20001生長和產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of exogenous acid addition on the growth and acid production of A.pasteurianus CICC 20001

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

轉(zhuǎn)錄組測序得到的原始序列會存在低質(zhì)量的reads，需要對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證后續(xù)分析的質(zhì)量。由表1可知，樣本間基因組的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在55%左右，錯誤率均不大于0.02%，測序質(zhì)量分值Q30均在90%以上，說明測序原始數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表1 巴氏醋桿菌CICC 20001轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistical analysis of transcriptome sequencing data of A.pasteurianus CICC 20001

2.3 醋酸發(fā)酵過程中DEGs分析

通過DEGs的篩選有助于發(fā)現(xiàn)基因的功能，更有助于揭示某些現(xiàn)象的分子機(jī)制。添加底物醋酸啟動醋酸發(fā)酵早期（Z2 vs Z1）表達(dá)出的基因共有2 247個，其中顯著性的DEGs有412個，包括394個上調(diào)基因和18個下調(diào)基因；而在中后期（F2 vs F1）共檢測出2 240個基因，其中顯著性差異表達(dá)的基因有70個，包括30個上調(diào)基因和40個下調(diào)基因（圖2A）。在醋酸發(fā)酵早期和中后期表達(dá)的總基因數(shù)量無明顯差異，而顯著DEGs數(shù)量差異較大。由圖2B可知，有36個顯著DEGs在醋酸發(fā)酵中共表達(dá)，有376個顯著DEGs只在醋酸發(fā)酵早期表達(dá)，34個顯著DEGs只在醋酸發(fā)酵中后期表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在巴氏醋桿菌CICC 20001發(fā)酵早期，顯著上調(diào)的基因多于下調(diào)的基因數(shù)目，而在巴氏醋桿菌CICC 20001發(fā)酵的中后期，顯著下調(diào)的基因略多于上調(diào)基因數(shù)目。這些在發(fā)酵早期上調(diào)的基因和中后期顯著差異表達(dá)的基因可能是潛在的促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001產(chǎn)酸的關(guān)鍵基因。同時在加入低添加量醋酸后，與醋酸發(fā)酵中后期相比，在發(fā)酵早期細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)變化較為明顯，說明底物醋酸可能在醋酸發(fā)酵早期發(fā)揮更重要的作用。

圖2 添加底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001發(fā)酵過程中DEGs表達(dá)情況Fig.2 Differential gene expression induced by exogenous acetic acid during fermentation of acetic acid by A.pasteurianus CICC 20001

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 醋酸發(fā)酵早期的DEGs富集分析

隨著我國刨花板行業(yè)不斷淘汰部分落后產(chǎn)能，新增先進(jìn)生產(chǎn)線，質(zhì)量不斷提高，產(chǎn)量也有增加，刨花板出口出現(xiàn)增長。今年前3季度累計，我國刨花板出口量完成17.4萬t，比上年同期增長18.29%。出口金額同比增加9.74%，主要出口到蒙古、印度和我國臺灣省等。

GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，GO數(shù)據(jù)庫把基因的本體分為3類，即生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。將412個DEGs與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到256個GO條目。根據(jù)P-value分別在BP、CC、MF中篩選部分GO條目進(jìn)行分析，如圖3所示。

圖3 添加底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發(fā)酵的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

由圖3可知，在醋酸發(fā)酵早期的DEGs顯著富集在BP過程的運(yùn)輸、定位、建立定位和跨膜運(yùn)輸；CC過程的細(xì)胞膜；MF過程的轉(zhuǎn)運(yùn)活性、ATP酶活性、水解酶活性和陽離子活性等功能。結(jié)果表明，DEGs主要與醋酸發(fā)酵的跨膜運(yùn)輸過程、細(xì)胞膜、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和酶活性等有關(guān)，說明低濃度底酸處理可能會影響巴氏醋桿菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)酶的活性。

KEGG是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。為了進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能，通過KEGG數(shù)據(jù)庫對細(xì)胞內(nèi)DEGs進(jìn)行功能分析。醋酸發(fā)酵早期階段的DEGs共涉及42 條通路，根據(jù)P-value篩選出前20 條通路進(jìn)行分析。如圖4所示，圓圈代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)目，顏色從藍(lán)到紅代表富集的顯著性大小（以-lg（P-value）計算）。發(fā)現(xiàn)顯著富集的幾個被注釋的信號通路為煙酸和煙酰胺代謝、ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分體系（two-component systems，TCSs）、精氨酸生物合成、丙酸代謝等。研究發(fā)現(xiàn)，低體積分?jǐn)?shù)底酸對醋酸發(fā)酵早期的輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路均有影響。因此，推測與跨膜運(yùn)輸相關(guān)的DEGs可能在醋酸發(fā)酵早期的代謝機(jī)制中起重要調(diào)節(jié)作用。

圖4 添加底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發(fā)酵的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

2.4.2 醋酸發(fā)酵中后期的DEGs富集分析

對醋酸發(fā)酵中后期的70個DEGs進(jìn)行GO富集分析得到21個GO條目，根據(jù)P-value分別在BP、CC、MF中篩選部分GO條目進(jìn)行分析。如圖3所示，這些DEGs主要富集在BP過程的氧化還原過程和調(diào)控過程；CC過程的細(xì)胞膜、細(xì)胞膜的整體組成、細(xì)胞膜的固有組成以及細(xì)胞膜組件；MF過程的氧化還原酶活性、金屬離子結(jié)合和陽離子結(jié)合等功能。結(jié)果表明醋酸發(fā)酵中后期階段的DEGs主要與細(xì)胞的調(diào)控過程、細(xì)胞膜和氧化還原活性等有關(guān)，進(jìn)而在此階段可能會對巴氏醋桿菌的生長代謝進(jìn)程造成影響。

對醋酸發(fā)酵中后期的DEGs進(jìn)行KEGG通路分析，共涉及21 條通路。如圖4所示，數(shù)量較多的幾個被注釋的信號通路為煙酸和煙酰胺代謝、硫代謝和TCSs等。研究發(fā)現(xiàn)，低添加量底酸對醋酸發(fā)酵中后期的輔因子和維生素代謝、能量代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等均有影響。因此，推測與物質(zhì)代謝和能量代謝相關(guān)的DEGs可能在醋酸發(fā)酵中后期發(fā)揮一定的作用。

2.5 底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌醋酸發(fā)酵的分子機(jī)理

通過GO富集分析和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、尿素代謝、TCSs、丙酸代謝和能量代謝等途徑對醋酸發(fā)酵過程影響較大，并從以上通路中找出重要基因如表2所示。

表2 巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發(fā)酵過程中的DEGsTable 2 DEGs induced by exogenous acetic acid in acetic acidfermentation by A.pasteurianus CICC 20001

2.5.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

營養(yǎng)物質(zhì)只有進(jìn)入了微生物細(xì)胞之后才能被微生物細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝系統(tǒng)分解利用，進(jìn)而使微生物正常生長繁殖。細(xì)菌可以通過特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（包括外膜受體和孔蛋白以及內(nèi)膜中的高度特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）獲取必需的營養(yǎng)物質(zhì)[24]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一大類跨膜運(yùn)輸?shù)鞍椎慕y(tǒng)稱，廣泛存在于生物體中，它利用ATP水解產(chǎn)生的能量通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)底物，包括氨基酸、離子、糖類、脂質(zhì)和弱酸等[25-26]。此外，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過將H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外來抵制細(xì)胞中過高的H+濃度，可提高微生物的耐酸性[27]。生物體可通過跨膜運(yùn)輸?shù)钟鶎ψ陨聿焕募?xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化，以維持正常的生命活動。在研究中發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵早期，細(xì)胞中脂肪族磺酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白基因（APA01_RS06900、APA01_RS06905）、pstS、urtABCDE和cydCD等上調(diào)（表2、圖5）。脂肪族磺酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白基因、pstS和urtABCDE分別與細(xì)胞中硫、磷酸和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[28-29]。cydCD在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中具有重要作用，它們能夠與調(diào)節(jié)ATP酶活性的血紅素輔助因子結(jié)合，并且與細(xì)菌的代謝、跨膜運(yùn)輸、氧化還原反應(yīng)和耐受性等密切相關(guān)[30-31]。與不加底酸的對照組相比，這些上調(diào)的基因說明在酸脅迫下的巴氏醋桿菌CICC 20001可能通過加快對細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、促進(jìn)大量能量的生成和提高酶活滿足自身的生長和代謝需要，以促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001的產(chǎn)酸。

微生物可通過產(chǎn)生堿性化合物抵抗酸性環(huán)境。目前已知尿素和精氨酸這2種主要底物能夠產(chǎn)生堿性物質(zhì)。精氨酸代謝可產(chǎn)生尿素，而尿素產(chǎn)生氨的途徑有2種，一是在脲酶的調(diào)控下迅速水解為氨和二氧化碳；二是在尿素羧化酶和脲基甲酸水解酶作用下水解為氨和二氧化碳[32-33]。其中氨分子在細(xì)胞中起質(zhì)子消耗作用，因而脲酶、尿素羧化酶和脲基甲酸水解酶在獲取堿中起著重要作用。產(chǎn)堿機(jī)制對細(xì)菌在不同酸性條件下的生存有效，有研究表明由ureIABCEFGD操縱子組成的脲酶系統(tǒng)可以保護(hù)一些細(xì)菌，如羅伊氏乳桿菌和幽門螺旋桿菌免受酸引起的損害[34-35]。在醋酸發(fā)酵早期urtABCDE、尿素羧化酶基因（APA01_RS07060）、atzF以及與脲酶系統(tǒng)相關(guān)的脲酶亞基β基因（APA01_RS11920）、脲酶亞基γ基因（APA01_RS11925）和ureC等上調(diào)（表2、圖5），說明這些基因可能調(diào)控細(xì)胞中脲酶分解尿素產(chǎn)生氨，而氨可能參與了細(xì)胞中醋酸的中和，進(jìn)而減弱了細(xì)胞中醋酸的積累，促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001產(chǎn)酸。

2.5.3 TCSs

TCSs是由感應(yīng)組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成的一種細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，也是存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。通過這個系統(tǒng)可監(jiān)測外界環(huán)境的壓力，并調(diào)控基因表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境脅迫，是細(xì)菌適應(yīng)外界壓力的一種自我保護(hù)機(jī)制[36]。有研究表明，TCSs體系在細(xì)菌的酸脅迫中發(fā)揮了重要的作用。Li Yuanjing等[37]發(fā)現(xiàn)酸脅迫環(huán)境激活了Komagataeibacter hanseniiHDM1-3的TCSs信號通路，調(diào)控了其脂肪酸的合成，進(jìn)而誘導(dǎo)下游脂肪酸組成和結(jié)構(gòu)的變化，從而幫助細(xì)菌抵抗酸性環(huán)境。Choi等[38]發(fā)現(xiàn)TCSs中的PhoQ/PhoP體系在酸性環(huán)境下被激活，刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明雙組分傳感器組氨酸激酶和PstS與細(xì)菌中磷水平調(diào)控密切相關(guān)[29]。在本研究中發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵早期，與TCSs有關(guān)的雙組分傳感器組氨酸激酶基因（APA01_RS01605）和pstS等多個基因顯著上調(diào)（表2、圖5），表明TCSs可能受到酸性環(huán)境的激活。同時，雙組分傳感器組氨酸激酶基因和pstS的表達(dá)量增加，說明在醋酸發(fā)酵早期，巴氏醋桿菌CICC 20001可能通過提高磷的吸收和利用，保持酸性條件下細(xì)胞膜的完整性和流動性，以抵抗細(xì)胞所面臨的酸性環(huán)境，促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001代謝產(chǎn)酸。在巴氏醋桿菌CICC 20001發(fā)酵中后期，TCSs中有2個DEGs上調(diào)（APA01_RS10925、APA01_RS10920）（圖5），表明TCSs在高醋酸環(huán)境中仍然發(fā)揮著重要作用，維持細(xì)胞正常生命活動，但是其積極作用略低于醋酸發(fā)酵早期，也進(jìn)一步表明低濃度底酸可能主要在醋酸發(fā)酵早期激活TCSs以促進(jìn)巴氏醋桿菌CICC 20001產(chǎn)酸。

2.5.4 醋酸同化及丙酸代謝

醋酸同化被認(rèn)為是醋酸菌耐酸機(jī)制之一。醋酸進(jìn)入細(xì)胞后，可由醋酸菌中特殊的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AatA將醋酸排出細(xì)胞外；也可在醋酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和乙酰輔酶A合酶的作用下將醋酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并通過三羧酸循環(huán)進(jìn)行同化，這一過程不僅能為醋酸發(fā)酵提供能量，也可減少細(xì)胞中醋酸含量，減弱醋酸對細(xì)胞的毒害作用[20]。在醋酸發(fā)酵早期，與醋酸同化相關(guān)的ackA、pta和acs等基因明顯上調(diào)（表2、圖5），表明在加入0.5%底物醋酸后，細(xì)胞中可能出現(xiàn)了醋酸同化現(xiàn)象，減輕巴氏醋桿菌所面對的酸性環(huán)境。丙酸是自然界中一種豐富的分解代謝產(chǎn)物，是生物體生長代謝的潛在碳源。但是，丙酸的積累對細(xì)胞也具有一定毒性，因此丙酸分解代謝也可以視為一種解毒機(jī)制。丙酸可在丙酰輔酶A合成酶或醋酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A，再經(jīng)過2-甲基檸檬酸循環(huán)生成琥珀酸，進(jìn)一步進(jìn)入丙酮酸代謝，丙酸代謝下的2-甲基檸檬酸循環(huán)是一種新的潛在耐酸機(jī)制[20,39]。在醋酸發(fā)酵早期，編碼丙酸代謝關(guān)鍵酶甲基異檸檬酸裂解酶的基因prpB明顯上調(diào)，將異檸檬酸甲酯轉(zhuǎn)化為琥珀酸進(jìn)入丙酮酸代謝，進(jìn)而將丙酸分解，可能減弱細(xì)胞中的酸性環(huán)境，改善了巴氏醋桿菌的生長代謝，促進(jìn)其產(chǎn)酸。但丙酸在醋酸發(fā)酵過程中的產(chǎn)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，研究表明與酸同化相關(guān)的基因ackA、pta、acs和prpB在發(fā)酵過程中一直處于上調(diào)水平（表2、圖5），其可能減弱了醋酸所產(chǎn)生的酸性環(huán)境對巴氏醋桿菌生長帶來的脅迫影響，對底酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸發(fā)揮了重要作用。

2.5.5 能量代謝

能量代謝是一切生物代謝的核心問題。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）這2種輔酶是生物體氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)能所必需的，也是電子傳遞鏈上的遞氫載體，還是參與非氧化還原信號通路的酶的底物，從而調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，包括物質(zhì)代謝、能量代謝、DNA修復(fù)和脅迫抗性等[40]。在醋酸發(fā)酵早期，研究發(fā)現(xiàn)nadA、nadC、nuoF和cydB等上調(diào)（表2、圖5）。其中，NadA與NadC參與NAD+的從頭合成，并且NadC是其合成過程中的主要限速酶，NuoF與CydB等氧化還原酶作為輔酶促進(jìn)電子在呼吸鏈上的傳遞，從而促進(jìn)能量的釋放[41]。這些上調(diào)的基因說明低添加量底酸可能促進(jìn)氧化磷酸化過程，進(jìn)而加快了能量產(chǎn)生，有助于提高巴氏醋桿菌CICC 20001產(chǎn)酸效率。在醋酸發(fā)酵中后期，與輔因子和維生素代謝、能量代謝等通路有關(guān)的基因大多數(shù)被下調(diào)，可能是由于細(xì)胞中醋酸體積分?jǐn)?shù)升高，降低了酶活，從而影響了能量代謝過程。由此可見，底物醋酸可能在醋酸發(fā)酵早期時的能量代謝中發(fā)揮著更加重要的作用。

圖5 巴氏醋桿菌CICC 20001醋酸發(fā)酵代謝圖Fig.5 Metabolic pathways in acetic acid fermentation by A.pasteurianus CICC 20001

3 結(jié) 論

前期研究表明，添加一定量的底物醋酸可以促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法探討添加0.5%底物醋酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸的分子機(jī)理。結(jié)果表明，以0.5%底物醋酸啟動醋酸發(fā)酵時，巴氏醋桿菌產(chǎn)酸效率明顯提高；在發(fā)酵早期和中后期，分別有412個和70個顯著差異表達(dá)的基因。這些基因涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸、能量代謝、尿素代謝、丙酸代謝和醋酸同化代謝等。添加0.5%底物醋酸可能激發(fā)巴氏醋桿菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，強(qiáng)化菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸和能量代謝，可能為迅速開啟醋酸發(fā)酵提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。與此同時，巴氏醋桿菌還可能通過強(qiáng)化尿素代謝、丙酸代謝和醋酸同化代謝提高醋酸耐受性，減少發(fā)酵過程中醋酸對菌體的毒害作用，從而提高巴氏醋桿菌產(chǎn)酸效率。同時，將生理分析和轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)相結(jié)合的研究可能會闡明并加深對底物醋酸促進(jìn)巴氏醋桿菌產(chǎn)酸分子機(jī)制的理解。