茶樹單寧酶的原核表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

陳 偉，谷新晰，張莉娟，談蘇慧，田洪濤，盧海強(qiáng)*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

單寧酶（EC 3.1.1.20）能夠催化單寧底物酯鍵和縮酚酸鍵的水解，從而釋放沒食子酸、鞣花酸及對(duì)應(yīng)醇[1-2]。單寧酶應(yīng)用到食品領(lǐng)域可以解決由單寧引起的品質(zhì)問題，使產(chǎn)品品質(zhì)得到改善。如Lu等[3]發(fā)現(xiàn)單寧酶處理可以大大減少綠茶茶湯“茶乳”的形成，并且使茶湯具有更好的顏色外觀和口感；Zhang Yingna等[4]通過單寧酶水解綠茶生產(chǎn)具有極佳回甘的茶飲料；單寧酶應(yīng)用到葡萄汁、腰果梨汁、橙汁、刺梨汁和石榴汁等果汁當(dāng)中，水解果汁中的單寧，起到澄清、脫苦和脫澀的作用[5-8]；Selwal等[9]將單寧酶應(yīng)用到葡萄酒中，起到澄清的作用。

面對(duì)復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境和大量的應(yīng)用需求，挖掘具有良好酶學(xué)性質(zhì)的新單寧酶向來是研究熱點(diǎn)。目前，進(jìn)行的異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)表征的單寧酶主要來源于微生物。Dai Xinlong等[10]從植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定了參與植物單寧降解的單寧酶基因，植物單寧酶在植物單寧代謝中起重要作用，重組植物單寧酶對(duì)多個(gè)天然底物（如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯和β-五沒食子酰葡萄糖）表現(xiàn)出較高的催化效率，而重組植物單寧酶的相關(guān)性質(zhì)鮮見報(bào)道。同時(shí)，Dai Xinlong等[10]推測富含單寧的植物基因組中很可能含有單寧酶基因，這一發(fā)現(xiàn)為新單寧酶的挖掘和研究提供了新方向，植物中可能存在具有理想性質(zhì)或適合于各種單寧底物的新單寧酶。

本研究將茶樹單寧酶基因CsTanA（GenBank：MK381269.1）參照大腸桿菌（Escherichia coli）密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，并在大腸桿菌BL21（DE3）中重組表達(dá)。重組茶樹單寧酶rCsTanA利用Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化及酶學(xué)性質(zhì)表征，旨在探究植物來源單寧酶的酶學(xué)特性和為重組茶樹單寧酶rCsTanA應(yīng)用研究提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài) 天根生化科技（北京）有限公司；硫酸卡那霉素（Kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、質(zhì)粒提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker 河北瑞帕特生物科技有限公司；羅丹寧、沒食子酸甲酯（methyl gallate，MG）、沒食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）、沒食子酸正丙酯（propyl gallate，PG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、單寧酸（tannic acid，TA） 上海源葉生物科技有限公司；Ni-NTA瓊脂糖 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器 德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）設(shè)備 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；立式高速低溫離心機(jī) 日本Hitachi公司；JY88-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樹單寧酶基因CsTanA密碼子優(yōu)化及合成

使用RARE CODON CALTOR（https://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html#opennewwindow）對(duì)茶樹單寧酶基因（GenBank：MK381269.1）進(jìn)行稀有密碼子分析。以大腸桿菌為表達(dá)宿主，采用JAVA Condon Adaption Tool（https://http://www.jcat.de/）對(duì)茶樹單寧酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化的序列中避免EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)。5’端與3’端分別引入EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，優(yōu)化的序列由金斯瑞生物科技有限公司合成并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-CsTanAopt。

1.3.2 序列信息分析

使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列一致性分析。使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進(jìn)行多序列比對(duì)。使用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行茶樹單寧酶CsTanA的蛋白質(zhì)同源建模。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于CsTanA同源建模結(jié)果和多序列比對(duì)結(jié)果確定進(jìn)化保守性，結(jié)合Pymol進(jìn)行可視化分析，氨基酸殘基以梯度著色。使用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算單寧酶的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

1.3.3 重組菌的構(gòu)建與表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落接種于10 mL Kan終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，再以1%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到50 mL Kan終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)12 h，取發(fā)酵液4 ℃離心收集表達(dá)菌體。

1.3.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的純化及SDS-PAGE分析

重組茶樹單寧酶rCsTanA N端帶有6hHis標(biāo)簽，故通過Ni-NTA親和層析對(duì)rCsTanA進(jìn)行純化分離。取1 g濕質(zhì)量表達(dá)菌體加入5 mL pH 7.0磷酸緩沖液（0.2 mol/L）使表達(dá)菌體重懸，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（功率150 W，工作5 s、間歇5 s，處理2 min）處理重懸表達(dá)菌體。離心收集破碎上清液與提前平衡好的Ni柱相結(jié)合，用9 mL pH 7.0磷酸緩沖液（0.2 mol/L）分3次加入洗滌雜蛋白，分別用3 mL含20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L咪唑的平衡液梯度洗脫目的蛋白，測定單寧酶活性并進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，通過Bradford方法測定單寧酶蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 單寧酶活力的測定

參考Sharma等[11]的方法并稍作調(diào)整，取100 μL適當(dāng)稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液（1.25 mmol/L，pH 6.0）混勻，于30 ℃條件反應(yīng)，10 min后加入300 μL羅丹寧甲醇溶液（50 mmol/L）終止反應(yīng)，加入200 μL 0.5 mol/L KOH溶液顯色，穩(wěn)定5 min后在520 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 重組茶樹單寧酶rCsTanA的酶學(xué)特性分析

最適溫度和pH值的測定：以pH 6的PG為底物，在0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃條件下測定純化rCsTanA的最適溫度；在不同pH值（pH 2～3的100 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液、pH 3～8的100 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH 8～12的100 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液）和測得的最適溫度條件下測定純化rCsTanA的最適pH值。

熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測定：rCsTanA在40 ℃和50 ℃保溫0、5、10、20、30 min和60 min，在最適溫度和pH值條件下測定殘余酶活力，以處理0 min的酶活力為100%；將rCsTanA置于不同pH值（2.0～12.0）緩沖液中，0 ℃保溫1 h后，在最適溫度和pH值條件下測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理rCsTanA活力為100%。

1.3.7 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中加入不同金屬離子、表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，測定酶活力；加入表面活性劑吐溫80及甲醇、乙醇和異丙醇等有機(jī)試劑，使其體積分?jǐn)?shù)分別為1%和5%，測定酶活力。以未添加其他化學(xué)試劑所測得的酶活力為100%。

1.3.8 重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定

以濃度為1.25 mmol/L的MG、EG、PG、EGCG和濃度為0.4 mmol/L的TA測定純化重組單寧酶rCsTanA活力。以MG、EG、PG、TA和EGCG（濃度范圍為0.05～10.00 mmol/L）為底物，在最適條件下反應(yīng)10 min以估算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即Km和Vmax的值，動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算基于Lineweaver-Burk圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次，利用Excel 2016和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用fs表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹單寧酶基因CsTanA的優(yōu)化

編碼茶樹單寧酶的野生型基因全長900 bp，編碼299個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。經(jīng)分析野生型茶樹單寧酶基因存在37個(gè)大腸桿菌稀有密碼子和兩處連續(xù)稀有密碼子（CUA CCC和GGA CCC）。參照大腸桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化密碼子后，稀有密碼子全部被替換，優(yōu)化前后基因序列的一致性為77.8%，GC含量由此前的53.2%減小至51.9%，密碼子適應(yīng)指數(shù)由0.58提高至0.8，更接近于理想值1.0[12]。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用SWIS-SMODEL對(duì)茶樹單寧酶CsTanA進(jìn)行同源建模研究，選擇與CsTanA同源性為37.54%的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:6rj8）為模板以模擬CsTanA蛋白的結(jié)構(gòu)。選擇了分別源自柿子（QEE79633.1）、葡萄（QEE796030.1）、柑橘（XP_02403513.1）、核桃（QEE79629.1）和草莓（QEE79629.1）的5個(gè)植物單寧酶，同茶樹單寧酶CsTanA進(jìn)行多序列比對(duì)。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于模擬的CsTanA蛋白的結(jié)構(gòu)和多序列比對(duì)結(jié)果確定進(jìn)化保守性，結(jié)合Pymol進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖1所示。CsTanA屬于α/β水解酶超家族，整體結(jié)構(gòu)由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，球形α/β水解酶折疊域和一個(gè)Lid結(jié)構(gòu)域。與微生物來源的單寧酶相比，茶樹單寧酶CsTanA沒有復(fù)雜的帽子結(jié)構(gòu)域，同時(shí)α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域也相對(duì)簡單，除了必需的5個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊，沒有過多的α螺旋和β折疊插入α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域[13-14]。茶樹單寧酶CsTanA的α/β水解酶折疊核心域由5個(gè)α螺旋圍繞8個(gè)β折疊，形成了α/β水解酶折疊域，Lid結(jié)構(gòu)域由2個(gè)平行的β折疊和1個(gè)反平行的β折疊組成。CsTanA具有不規(guī)則的疏水底物口袋，保守的催化三聯(lián)體殘基為Ser159、Asp241和His273，Asp241和His273位于疏水底物口袋入口表面處排成一排，Ser159位于底物口袋底部；保守基序HGG（75～77）位于底物口袋內(nèi)部，Gly76-Gly77形成一個(gè)氧陰離子空穴結(jié)構(gòu)。研究表明該結(jié)構(gòu)與酶活性有關(guān)，相同的結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在了獼猴桃羧酸酯酶AeCXE1當(dāng)中，活性口袋中的Gly92-Gly93形成氧陰離子空穴并且起到穩(wěn)定中間體的作用[10,15]。如圖1所示，通過計(jì)算進(jìn)化保守性，基于該結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)顯示了氨基酸殘基保守和多變的位置，確定了底物口袋結(jié)構(gòu)中的殘基是高度保守的，這些進(jìn)化上穩(wěn)定的殘基在催化、配體結(jié)合和保持蛋白質(zhì)支架的完整性中起重要作用，結(jié)構(gòu)表面的大多數(shù)氨基酸被標(biāo)記為高度可變。通過對(duì)植物來源單寧酶蛋白序列及結(jié)構(gòu)的分析，為進(jìn)一步分子改造研究提供理論基礎(chǔ)。

圖1 單寧酶CsTanA三維結(jié)構(gòu)及進(jìn)化保守性圖Fig.1 Schematic diagram of the tertiary structure and evolutionary conservatism of CsTanA

2.3 重組茶樹單寧酶rCsTanA的純化及SDS-PAGE分析

茶樹單寧酶CsTanA的等電點(diǎn)和理論分子質(zhì)量分別為5.61和33.09 kDa。重組茶樹單寧酶rCsTanA N端帶有6hHis標(biāo)簽，使其可以通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化。對(duì)不同濃度咪唑的洗脫液（20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L）的洗脫結(jié)果進(jìn)行單寧酶活性的測定，40 mmol/L咪唑的洗脫結(jié)果單寧酶活性最高，而80 mmol/L咪唑的洗脫結(jié)果無單寧酶活性。破碎上清液重組茶樹單寧酶rCsTanA比活力為0.35 U/mg，純化后的rCsTanA比活力為1.53 U/mg，純化倍數(shù)約為4.4。如圖2所示，rCsTanA的分子質(zhì)量約為39 kDa，rCsTanA的N端融合表達(dá)了6hHis標(biāo)簽，使單寧酶蛋白N端多出52個(gè)氨基酸殘基（約5.23 kDa），故實(shí)際分子質(zhì)量大于理論分子質(zhì)量（33.09 kDa）。

圖2 純化重組酶rCsTanA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rCsTanA

2.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的酶學(xué)特性分析

2.4.1 溫度對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

如圖3A所示，rCsTanA在0～70 ℃的溫度范圍內(nèi)均有活性，其最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～40 ℃之間可保持64%以上的酶活力，溫度高于40 ℃酶活力急劇下降，50 ℃時(shí)酶活力僅為33.9%。如圖3B所示，rCsTanA在30 ℃條件下處理60 min后，仍保持66.0%的酶活力；在40 ℃條件下處理10 min后，酶活力保持在52.2%。

圖3 重組酶rCsTanA的最適溫度（A）、溫度穩(wěn)定性（B）、最適pH值（C）及pH值穩(wěn)定性（D）Fig.3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant rCsTanA

2.4.2 pH值對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

在40 ℃的反應(yīng)溫度下，測定了rCsTanA在pH 2.0～12.0的酶活性，結(jié)果如圖3C所示。rCsTanA的最適pH值為7.0，在pH 6.0～9.0內(nèi)酶活力可維持在60.0%以上。將rCsTanA酶液置于不同pH值條件下，0 ℃保溫1 h后，測定rCsTanA殘余酶活力，由圖3D可知，該酶在pH 6.0～10.0之間具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力均保持在80%以上。

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA的影響

金屬離子對(duì)重組酶rCsTanA活力的影響結(jié)果見表1。經(jīng)測定Na+、K+、Li+、Mg2+（僅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均對(duì)rCsTanA活力有明顯促進(jìn)作用，其中K+可使其酶活力提高約37%。而Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe3+及Al3+對(duì)rCsTanA活力具有不同程度的抑制作用，Ag+、Cu2+和Fe3+抑制作用較強(qiáng)，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。黃蕾等[16]報(bào)道了Cu2+和Fe3+對(duì)重組煙曲霉單寧酶AfTanA具有較強(qiáng)的抑制作用，5 mmol/L Cu2+和Fe3+可使重組酶失活。Kanpiengjai等[17]報(bào)道了Cu2+對(duì)重組戊糖乳桿菌單寧酶LpTanBA-7和LpTanQA1-5均有較強(qiáng)抑制作用，1 mmol/L Cu2+抑制了2個(gè)重組酶約70%的活力，Na+、K+、Ca2+、Mg2+及Al3+則為LpTanBA-7和LpTanQA1-5的激活劑。Ag+、Cu2+和Fe3+等重金屬離子對(duì)大多數(shù)單寧酶有抑制作用，因?yàn)檫@些重金離子可能與酶活性部位的巰基、色氨酸殘基或羧基結(jié)合在一起形成復(fù)合物，阻礙酶與底物結(jié)合而生成產(chǎn)物[18-19]。

表1 金屬離子對(duì)重組酶rCsTanA的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of recombinant rCsTanA

如表2所示，所測11種試劑對(duì)rCsTanA均有不同程度的抑制作用，且抑制作用隨添加量增大而增大。在螯合劑EDTA存在下，以金屬離子為輔基的酶會(huì)表現(xiàn)出酶活性急劇下降。在1 mmol/L和5 mmol/L的EDTA存在下，重組酶rCsTanA活力分別為（94.52f5.68）%和（83.27f8.58）%，并未表現(xiàn)出酶活性急劇下降，這表明該酶不使用金屬離子作為輔因子。表面活性劑SDS、吐溫80和CTAB有較強(qiáng)抑制作用，1 mmol/L的SDS幾乎完全抑制了rCsTanA活力，5 mmol/L的吐溫80使rCsTanA活力喪失80%以上，5 mmol/L CTAB可使rCsTanA失活。甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會(huì)抑制酶活性，可能是因?yàn)闃O性化合物會(huì)降低酶微環(huán)境中周圍的水含量[20]。

表2 化學(xué)試劑對(duì)重組酶rCsTanA的影響Table 2 Effects of chemical reagents on the activity of recombinant rCsTanA

2.4.4 重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在最適反應(yīng)條件下，測定純化重組茶樹單寧酶rCsTanA的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。純化重組酶rCsTanA對(duì)MG、EG、PG和EGCG酶活力分別為0.40、0.71、0.80 U/mL和0.53 U/mL，但對(duì)TA并未表現(xiàn)出水解酶活性。進(jìn)一步進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，由底物MG、EG、PG和EGCG測得的Km分別為（2.25f0.12）、（1.30f0.04）、（1.66f0.11）mmol/L和（1.91f 0.06）mmol/L，Vmax分別為（4.10f0.19）、（9.17f0.24）、（10.54f0.09）mmol/（Lgmin）和（3.59f0.15）mmol/（Lgmin）。rCsTanA對(duì)天然底物（EGCG）的催化效率略低于合成底物（EG和PG）。rCsTanA對(duì)合成底物（MG、EG和PG）酶活性隨著合成底物烷基長度增加而提高。

表3 重組酶rCsTanA的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Substrate specificity and kinetic parameters of recombinant rCsTanA

3 討 論

本研究以大腸桿菌BL21（DE3）為表達(dá)宿主對(duì)茶樹單寧酶CsTanA進(jìn)行重組表達(dá)，SDS-PAGE分析顯示純化的重組酶分子質(zhì)量約為39 kDa，rCsTanA的N端融合表達(dá)了6hHis標(biāo)簽，使單寧酶蛋白N端多了52個(gè)氨基酸殘基（約5.23 kDa），故實(shí)際分子質(zhì)量大于理論分子質(zhì)量（33.09 kDa）。茶樹單寧酶CsTanA的分子質(zhì)量更接近于細(xì)菌來源的單寧酶，細(xì)菌單寧酶分子質(zhì)量一般為31～90 kDa[1-2]。本研究將茶樹單寧酶CsTanA成功進(jìn)行原核表達(dá)后，又嘗試將其在巴斯德畢赤酵母GS115中進(jìn)行真核表達(dá)。真核表達(dá)的重組茶樹單寧酶未檢測出單寧酶活性，其分子質(zhì)量約為50 kDa（數(shù)據(jù)未在文中給出），可能是巴斯德畢赤酵母對(duì)茶樹單寧酶CsTanA過度的糖基化修飾造成了重組酶失活。

重組茶樹單寧酶rCsTanA的最適溫度為40 ℃，在30～40 ℃之間可保持64%以上的酶活力，溫度高于40 ℃酶活力急劇下降。目前研究的單寧酶最適溫度的范圍一般為30～50 ℃，如黑曲霉單寧酶Tan7的最適溫度為40 ℃，當(dāng)溫度高于40 ℃酶活力活性急劇下降[21]；煙曲霉單寧酶AfTanA、戊糖乳桿菌單寧酶LpTanQA1-5和路鄧葡萄球菌單寧酶的最適溫度為40 ℃，但在30～50 ℃的溫度范圍內(nèi)可保持60%以上的酶活力[16-17,22]。重組茶樹單寧酶rCsTanA具有較高的反應(yīng)溫度，但較微生物來源的單寧酶相比，對(duì)溫度的適應(yīng)范圍和穩(wěn)定性稍顯遜色。

重組茶樹單寧酶rCsTanA的最適pH值為7.0，在pH 6.0～9.0反應(yīng)條件下酶活力保持在60.0%以上，在pH 6.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，處理1 h后殘余酶活力均在80%以上。多數(shù)細(xì)菌來源的單寧酶在中性或弱堿性環(huán)境中有較高酶活力，最適pH值多在7.0～8.0的范圍內(nèi)[2]。在最適pH值這一酶學(xué)性質(zhì)上，rCsTanA與細(xì)菌來源的單寧酶相似，在堿性條件下更為穩(wěn)定。路鄧葡萄球菌單寧酶同rCsTanA一樣在酸性環(huán)境中酶活力較低，但經(jīng)固定化后的路鄧葡萄球菌單寧酶在pH 5.0時(shí)酶活力為65%，酶活力提高了35%[22]。這為提高rCsTanA在酸性環(huán)境中的酶活力提供了方法。

Na+、K+、Li+、Mg2+（僅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均可使重組茶樹單寧酶rCsTanA活力提高20%以上，其中K+可使酶活力提高約37%。Ag+、Cu2+和Fe3+對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA抑制作用較強(qiáng)，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。研究表明多數(shù)重金屬（如Hg2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Ag+）對(duì)單寧酶有較強(qiáng)的抑制作用，這些離子可能與酶活性部位的巰基、色氨酸殘基和或羧基結(jié)合在一起形成復(fù)合物，阻礙酶與底物結(jié)合而生成產(chǎn)物[16-19,23-27]。表面活性劑SDS、吐溫80和CTAB對(duì)重組茶樹單寧酶rCsTanA有較強(qiáng)抑制作用，可使rCsTanA失活。表面活性劑與單寧酶蛋白的直接作用和減少疏水作用，使得單寧酶的性質(zhì)產(chǎn)生變化，SDS、Triton X-100、吐溫20和吐溫80對(duì)黑曲霉單寧酶rAntan1、源自陰溝腸桿菌的單寧酶和肺炎克雷伯菌的單寧酶同樣有較強(qiáng)抑制作用[18,23-24,28]。而SDS對(duì)源自枯草芽孢桿菌PAB2的單寧酶和路鄧葡萄球菌的單寧酶的酶活力具有促進(jìn)作用[22,29]；EDTA、Triton X-100和吐溫80可使單寧酶TanBFnp的酶活力分別提高106%、142%和69%[30]。甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會(huì)抑制重組茶樹單寧酶rCsTanA活力，可能是因?yàn)闃O性化合物會(huì)降低酶微環(huán)境中周圍的水含量[17]。但也有少數(shù)單寧酶對(duì)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出較強(qiáng)耐受能力，如源自枯草芽孢桿菌PAB2的單寧酶和戊糖乳桿菌的單寧酶可乙醇、甲醇、異丙醇、甘油和異戊醇等有機(jī)溶劑激活[17,29]。

重組茶樹單寧酶rCsTanA對(duì)天然底物TA未表現(xiàn)出水解活性，但微生物來源的單寧酶一般均對(duì)TA具有較高的水解活性。rCsTanA對(duì)天然底物EGCG的催化效率略低于合成底物EG和PG。相比于大分子底物，小分子底物似乎更易于與重組茶樹單寧酶rCsTanA的活性位點(diǎn)結(jié)合。TA分子質(zhì)量為1 701.2 Da，是EGCG分子質(zhì)量的3.7 倍，過多的沒食子酸?；紦?jù)了較大的空間位置，阻礙了TA與重組茶樹單寧酶rCsTanA的活性位點(diǎn)結(jié)合，使TA無法被rCsTanA水解，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

對(duì)茶樹單寧酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并在大腸桿菌進(jìn)行融合表達(dá)，經(jīng)分析重組茶樹單寧酶rCsTanA蛋白分子質(zhì)量為39 kDa，比活力為1.53 U/mg，rCsTanA最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH值為7.0，在堿性條件下更為穩(wěn)定。Na+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+和Ca2+均對(duì)rCsTanA活力有明顯促進(jìn)作用，而Ag+、Cu2+和Fe3+對(duì)該酶有明顯抑制作用；EDTA、SDS、吐溫80、CTAB、尿素、甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮均對(duì)rCsTanA活力有抑制作用，其中SDS和CTAB的抑制作用最強(qiáng)。綜上所述，重組茶樹單寧酶rCsTanA在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用潛力。