凡納濱對蝦原肌球蛋白的純化鑒定及生物信息學(xué)分析

王新，邱惠，魏帥*，孫欽秀，夏秋瑜，王澤富，韓宗元，吉宏武,2，劉書成,2*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東省海洋食品 工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室，廣東 湛江，524088)2(海洋食品精深加工關(guān)鍵 技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)

食物過敏是指機(jī)體進(jìn)食食物后，某些蛋白刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的異常反應(yīng)[1]，表現(xiàn)在皮膚、呼吸道和胃腸道的一些不良反應(yīng)，甚至引起過敏性休克以及死亡[2]。食物過敏是世界公認(rèn)的食品安全問題之一，約影響全球3.5%～4.0%的人口[3]。在亞洲，約有40%的兒童和33%的成人對蝦蟹等甲殼類食物過敏[4]。甲殼類動物被聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)定為八大類食物過敏原之一，蝦及其制品是海鮮過敏的主要原因[5]。蝦中過敏原包含有原肌球蛋白(tropomyosin, TM)、肌球蛋白輕鏈、丙酮酸激酶、精氨酸激酶和肌鈣結(jié)合蛋白等。其中，TM引起的過敏可達(dá)80%，是蝦中最主要的過敏原[6-8]。

TM分子質(zhì)量為32～39 kDa[9]，是由2條相同的α-螺旋鏈互相纏繞組成的桿狀結(jié)構(gòu)，具有鹽溶性和熱穩(wěn)定性[10]。TM是肌動蛋白動力學(xué)的調(diào)節(jié)劑，在肌肉收縮中具有調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用的功能，廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物肌肉組織中[11]。目前TM純化方法主要有等電點(diǎn)沉淀法、硫酸銨鹽析、柱層析和高效液相色譜技術(shù)等[8,12-14]，但純化后的TM產(chǎn)量小、純度低，且所用設(shè)備昂貴，因此操作簡單、耗時短、純度高且成本低的純化方法的研究十分重要。

本研究以凡納濱對蝦為原料，根據(jù)TM的特性，采用經(jīng)丙酮去脂，熱處理除雜，硫酸銨沉淀鹽析，采用柱層析進(jìn)一步純化以獲得高純度TM。通過LC-MS/MS結(jié)合Western blot對TM進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行生物信息學(xué)研究，分析其理化性質(zhì)并預(yù)測其空間結(jié)構(gòu)，以期為TM致敏性的消減研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，30尾/kg，購于廣東省湛江市東風(fēng)水產(chǎn)市場，經(jīng)冰猝死后2 h內(nèi)運(yùn)至實驗室。

考馬斯亮藍(lán)染液、10×PBS(pH 7.4、0.1 mol/L)和Tris-HCl(pH 7、0.02 mol/L)，北京酷來搏科技有限公司；DEAE FF、XK16/100層析柱，美國GE公司；預(yù)染蛋白marker，SMOBIO公司；12%預(yù)制膠、蛋白上樣緩沖液、10×變性電泳液、封閉液、轉(zhuǎn)膜液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；硫酸銨、氯化鈉、蔗糖，羅恩試劑；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫高速離心機(jī)，美國sigma公司；AKTA purifier 100型制備型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國GE；紫外分光光度計，島津(中國)有限公司；垂直電泳儀，北京六一有限公司；電轉(zhuǎn)儀、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀、毛細(xì)管高效液相色譜儀，賽默飛(上海)有限公司；渦旋儀、脫色搖床，美國Scliogex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 TM分離純化

TM提取液的制備參考邵虎明[8]的方法并略作修改，蝦去頭尾和蝦線后絞碎，加入過夜預(yù)冷的丙酮(1∶4, g∶mL)，磁力攪拌4 h。樣品離心15 min(4 ℃, 8 500 r/min)，棄掉上清液，取沉淀，重復(fù)上述步驟，直到蝦肉無色，蝦肉于通風(fēng)櫥中揮干即得到蝦肉粉。取100 g蝦肉粉按照1∶6(g∶mL)加入PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)，磁力攪拌6 h，4 ℃離心10 min，10 000 r/min，取上清液，沉淀中加入PBS重復(fù)上述步驟，合并2次上清液得到蛋白粗提液。將粗提液置于沸水浴中加熱6 min，取出后離心10 min(4 ℃, 8 500 r/min)，上清液中加入350 g/L硫酸銨，離心15 min(4 ℃, 8 500 r/min)，沉淀復(fù)溶于Tris-HCl(0.02 mol/L，pH 7)中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TM純化參考韓建勛[13]的方法，采用陰離子柱對蛋白粗提液進(jìn)行分離純化。層析柱經(jīng)Tris-HCl(0.02 mol/L, pH 7)平衡后，用含有1 mol/L NaCl的Tris-HCl 線性洗脫，流速1.5 mL/min，洗脫峰溶液收集后進(jìn)行SDS-PAGE實驗，確定為目的蛋白后對洗脫液進(jìn)行透析除鹽，蛋白濃縮后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白濃度測定與SDS-PAGE分析

以BSA標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，96孔板中分別加入20 μL質(zhì)量濃度為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL樣品，加入200 μL G250染色液，595 nm下測其最大光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品蛋白質(zhì)含量。

將純化的TM稀釋至1 mg/mL，采用12%預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE實驗。Marker上樣5 μL，樣品上樣15 μL。10 μL蛋白上樣緩沖液(5×)與40 μL樣品混合，沸水浴6 min。電泳條件為電壓120 V，電流40 mA。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，采用脫色液進(jìn)行脫色處理，至蛋白質(zhì)條帶清晰結(jié)束。

1.3.3 質(zhì)譜鑒定

1.3.3.1 胰蛋白酶(trypsin)酶解

將目的條帶切成1 mm×1 mm×1 mm膠粒，加入50% 乙腈50% mmol/L NH4HCO3進(jìn)行脫色，加入10 μL質(zhì)量濃度為15 ng/mL胰蛋白酶，4 ℃冰箱孵育40 min后加10 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃水浴酶切16 h，冷卻后加入2 μL甲酸，混勻后上機(jī)分析。

1.3.3.2 質(zhì)譜檢測和蛋白鑒定

預(yù)柱：300 μm i.d×5 mm，Acclaim PepMap RPLC C18，5 μm，100?，分析柱：150 μm i.d.× 150 mm，Acclaim PepMap RPLC C18，1.9 μm。流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈，流動相B為0.1%甲酸-80%乙腈；流速：600 nL/min。采集信息數(shù)據(jù)，經(jīng)過MaxQuant(1.6.2.10)數(shù)據(jù)庫檢索，對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1.3.3.3 Western blot分析

免疫印跡分析參照ZHANG等[15]的方法略作修改。將純化好的蛋白調(diào)整質(zhì)量濃度至100 μg/mL，按照1.3.2中進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至預(yù)先活化好的PVDF膜，室溫下用Western封閉液封閉，30 min后TBST洗膜5次，3 min/次。與稀釋2 000倍兔抗蝦TM免疫球蛋白G(immunoglobulin，IgG)抗體在4 ℃冰箱中搖晃孵育過夜，TBST洗膜5次，3 min/次。與稀釋10 000倍的羊抗兔IgG抗體室溫下孵育1 h，TBST洗膜5次，3 min/次。加入ECL顯色，采用天能5200化學(xué)發(fā)光儀拍照并分析結(jié)果。

1.3.3.4 TM生物信息學(xué)分析

從NCBI檢索得到凡納濱對蝦TM氨基酸序列(Gene ID:113820940)，采用Expasy和CamSol Intrinsic站點(diǎn)分析TM生物學(xué)信息、氨基酸組成、疏水性、溶解度；分別采用SOPMA、Jpred4、COR IV、Raptor X、S2D、NetSurfP-2.0預(yù)測TM二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL站點(diǎn)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，并對建模結(jié)果進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 TM的分離純化

凡納濱對蝦蝦肉經(jīng)丙酮去脂、PBS粗提、熱處理除雜、硫酸銨沉淀、柱層析后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖1。對蝦肌肉組織成分復(fù)雜，至少含有19種蛋白質(zhì)(圖1-a)，相對分子質(zhì)量最大可超180 kDa，大多數(shù)集中在35 kDa以上，在約36 kDa處有明顯條帶。經(jīng)沸水浴后，大多數(shù)不耐熱蛋白變性。硫酸銨沉淀富集后經(jīng)柱層析，約36 kDa處有單一條帶，經(jīng)凝膠成像和灰度分析，純度為98%(圖1-b)。洗脫曲線出現(xiàn)單一洗脫峰(圖1-c)，采用Western blot分析純化后TM活性，結(jié)果顯示在36 kDa處有陽性反應(yīng)。

a-TM純化SDS-PAGE圖(M-marker；1-PBS粗提蛋白；2-熱處理后 蛋白；3-硫酸銨沉淀；4-TM純化蛋白)；b-TM Western blot分析 (M-marker；1-TM)；c-TM純化洗脫曲線圖1 TM純化圖Fig.1 The purification results of TM

2.2 TM鑒定

SDS-PAGE確定其分子質(zhì)量為36 kDa，電泳膠粒經(jīng)脫色、脫水、還原烷基化、酶切后獲得肽段混合物，經(jīng)LC-MS/MS鑒定，利用MaxQuant(1.6.2.10)數(shù)據(jù)庫檢索和物種篩選，發(fā)現(xiàn)目的蛋白與凡納濱對蝦中TM gi:1536079568匹配分值最高，為323.31分，鑒定為TM。

2.3 TM理化特性分析

利用ExPASY網(wǎng)站中ProtParam站點(diǎn)分析TM氨基酸組成(表1)，由284個氨基酸組成，含量最多的氨基酸是谷氨酸(Glu，19%)，其次是亮氨酸(Leu，11.6%)和丙氨酸(Ala，11.3%)。氨基酸組成中不含有半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、硒半胱氨酸(Sec)和吡咯賴氨酸(Pyl)，且不含天冬氨酸衍生物和谷氨酸衍生物。其中負(fù)電荷殘基數(shù)Arg和Lys共49個占比17.25%，正電荷殘基數(shù)Asp和Glu共72個占比25.35%，預(yù)測TM是細(xì)胞間蛋白[16]。TM分子式為C1387H2303N411O491S8，理論等電點(diǎn)4.72。脂肪指數(shù)79.12、不穩(wěn)定系數(shù)39.00，預(yù)測TM在較廣溫度范圍內(nèi)為穩(wěn)定蛋白[16-17]。

表1 凡納濱對蝦原肌球蛋白氨基酸含量和殘基參數(shù)分析Table 1 Analysis of amino acid content and residue parameters of tropomyosin from L.vannamei TM

2.4 TM蛋白溶解度和親水性分析

采用CamSol Intrinsic和ExPASY預(yù)測TM溶解度和疏水性，結(jié)果見圖2。TM溶解度綜合得分3.79，分?jǐn)?shù)>1的區(qū)域表示高溶解度區(qū)域，而分?jǐn)?shù)<-1的為難溶性區(qū)域(圖2-a)，表明TM氨基酸在所有區(qū)域都是可溶的。通過ExPASY網(wǎng)站ProtScale站點(diǎn)分析TM疏水性，68位、215位天冬酰胺(Asn)分別得分1.222(max)，-3.067(min)(圖2-b)，親水性區(qū)域占77%，表明其為親水蛋白。

a-溶解度；b-疏水性圖2 TM溶解度參數(shù)Fig.2 Solubility parameters of TM

構(gòu)成抗原表位的多數(shù)氨基酸都帶有電荷，并有極性。可及性、可塑性、識別性、親水性和轉(zhuǎn)角是抗原表位區(qū)域的理化參數(shù)，通過分析其參數(shù)并結(jié)合已有過敏原數(shù)據(jù)庫可比較結(jié)合表位。蛋白質(zhì)可及性和片段可塑性是預(yù)測抗原表位的重要特征[18]。可及性反映了抗原分子的空間結(jié)構(gòu)，表示氨基酸殘基和溶劑分子所接觸的可能性，對TM氨基酸殘基采用ProtScale分析(圖3),第268殘基賴氨酸(Lys)可及性最高，第92殘基異亮氨酸(Ile)最低，平均值為6.16，26～41、72～83、108～136、158～166、184～190、202～219、222～236、246～252及261～276為可及性區(qū)域，高于平均值水平。FU等[19]和ZHANG等[18]通過BepiPred服務(wù)器分別預(yù)測中國對蝦和斑節(jié)對蝦TM抗原表位也證實了高可及性有利于形成抗原表位。分子可塑性表示抗原構(gòu)象中多肽骨架的可活動性，平均值為0.45，第101殘基精氨酸(Arg)最高為0.494，第172殘基纈氨酸(Val)最低為0.403，24～41、55～60、92～106、119～141、159～164、177～199、207～223及246～273為可塑性區(qū)域，高于平均值水平。第132殘基天冬酰胺(Asn)識別性最大為91.889，第238殘基精氨酸(Arg)識別性最低為80.222，平均值為85.67，大于平均值的區(qū)域為30～33、35～38、41～53、59～68、75～79、87～94、101～111、124～138、185～190、199～214、225～231、244～249、265～273及277～280。

親水性殘基位于分子表面，其最高峰成為抗原表位的可能性較大[20]，采用HPLC/retention pH 7.4分析親水性，第68殘基天冬酰胺(Asn)最大為4.4，第100殘基谷氨酸(Glu)最小為-9.1，親水性均值為-2.0，大于平均值的區(qū)域為5～15、19～22、46～51、61～79、87～95、106～117、126～133、149～152、164～173、189～207、223～235、245～249、266～275及277～280，TM空間結(jié)構(gòu)高親水性的存在是其致敏的理論依據(jù)[18]。極性最大11.244為第215殘基天冬酰胺(Asn)，第68殘基天冬酰胺(Asn)極性最小為7.478，平均值為9.514，大于平均值的區(qū)域為16～20、23～45、54～59、77～80、99～106、118～124、134～143、157～164、176～186、211～234及254～269。XU等[21]通過DNAStar和AntheProt Protean軟件以氨基酸親水性、可塑性等參數(shù)預(yù)測了凡納濱對蝦、大黃魚和菲律賓蛤仔TM的抗原表位，并以高親水性、可塑性、極性區(qū)域合成表位進(jìn)行了Dot bolt和ELISA實驗發(fā)現(xiàn)蝦TM合成表位有明顯的陽性反應(yīng)。轉(zhuǎn)角多位于蛋白分子的表面，有利于結(jié)合抗體，較大可能成為抗原表位，其最大值1.097為第279殘基絲氨酸(Ser)，第168殘基賴氨酸(Lys)和169殘基亮氨酸(Leu)轉(zhuǎn)角最小為0.7，均值為0.92，大于平均值的區(qū)域為16～21、23～39、54～60、76～83、98～108、117～125、132～143、158～164、181～190、202～207、209～220、254～256及265～280。

a-可及性；b-可塑性；c-識別性；d-親水性；e-極性；f-轉(zhuǎn)角圖3 凡納濱對蝦TM表位區(qū)域參數(shù)Fig.3 Regional parameters of TM epitopes from L.vannamei

2.5 TM二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將凡納濱對蝦TM(gi:1536079568)氨基酸序列導(dǎo)入SOPMA中分析二級結(jié)構(gòu)(圖4-a)，在284個氨基酸中，α螺旋氨基酸有280個，占98.59%；無規(guī)則卷曲氨基酸4個，占比1.4%。JPred4分析結(jié)果見圖4-b，TM中含有大量的α-螺旋和少量無規(guī)則卷曲，不含β-折疊，與SOPMA結(jié)果一致。COR IV預(yù)測結(jié)果見圖4-c，TM結(jié)構(gòu)組成包括α螺旋(89.08%)、延伸鏈(2.11%)和無規(guī)則卷曲(8.8%)。RaptorX軟件預(yù)測結(jié)果見圖4-d，TM中279個氨基酸形成α-螺旋(98.23%)，5個氨基酸形成無規(guī)則卷曲(1.76%)。S2D軟件預(yù)測TM中54個氨基酸形成無規(guī)則卷曲(19.01%)，230個氨基酸形成α-螺旋(80.99%)(圖4-e)。NetSurfP-2.0軟件預(yù)測TM中6個氨基酸為無規(guī)則卷曲(2.11%)，278個氨基酸為α-螺旋(97.89%)(圖4-f)。預(yù)測結(jié)果表明TM二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，可能含有β-折疊，含有少量無規(guī)則卷曲。

a-SOPMA；b-JPred4；c-COR IV；d-RaptorX；e-S2D；f-NetSurfP-2.0圖4 不同軟件預(yù)測凡納濱對蝦TM二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果Fig.4 Prediction results of secondary structure of TM from L.vannamei using different software

2.6 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISS-MODEL站點(diǎn)對TM三級結(jié)構(gòu)同源建模，選取相似度達(dá)55.99%的1c1 g.2.A蛋白B鏈為模板構(gòu)建TM三級結(jié)構(gòu)，并對模型進(jìn)行評估，結(jié)果見圖5，其中98.05%位于拉氏圖可靠區(qū)域，表明預(yù)測模型可行。

a-三級結(jié)構(gòu)；b-拉氏圖圖5 TM三級結(jié)構(gòu)和拉氏圖Fig.5 Three-dimension structure and RamachandranFigure of TM

3 結(jié)論

凡納濱對蝦肌肉經(jīng)過丙酮去脂、PBS粗提和熱處理除雜后，采用硫酸銨沉淀結(jié)合柱層析純化，得到了純度為98%的TM。SDS-PAGE顯示TM分子質(zhì)量36 kDa，膠粒經(jīng)LC-MS/MS鑒定后，肽段覆蓋率可達(dá)75%。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析，TM為熱穩(wěn)定蛋白，屬于親水性蛋白。對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TM以α-螺旋為主，可能含有β-折疊，含有少量無規(guī)則卷曲，其三級結(jié)構(gòu)簡單，無復(fù)雜的四級結(jié)構(gòu)。

由于TM具有耐酸堿、耐高溫的特性，常規(guī)的熱處理方式無法破壞其抗原表位，達(dá)到消減致敏性的作用。目前諸多學(xué)者采用美拉德反應(yīng)、酶促交聯(lián)、酶水解等化學(xué)法和超聲、高靜壓、輻照、等離子體等物理法消減TM致敏性[7,13,22-23]，雖然會一定程度上降低致敏性，但是長時間的處理會帶來一些負(fù)面影響。如：化學(xué)法會引起食品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的改變并產(chǎn)生有害物質(zhì)，而且過程無法精準(zhǔn)控制；物理法產(chǎn)生的消減程度不一，且長時間的物理場對食品質(zhì)地會產(chǎn)生一定的影響[1,24]。采用單一加工方式消減效果并不理想，采用聯(lián)合方法消減過敏原致敏性正逐漸興起，LIU等[25]采用美拉德反應(yīng)結(jié)合熱處理TM，與單獨(dú)熱處理和美拉德反應(yīng)相比，其消化率有所提高且IgG/IgE結(jié)合活性降低。