PTEN磷酸化在胃癌組織中的表達與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

成亮 吳顯峰 周恩成 邢銘

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，多數(shù)病人術(shù)后因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡[1]。胃癌病死率在癌癥中高居第3位[2]。早期胃癌5年生存率達到95%，中晚期5年生存率不足20%[3]。胃癌缺乏早期確診指標，病人發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，手術(shù)的病人也會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，尋找與胃癌早期相關(guān)的生物學標志物就至關(guān)重要。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)是一種可同時作用于多肽和磷酸肌醇底物的具有脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[4]。PTEN的主要功能是其脂質(zhì)磷酸化活性，改變下游PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝及細胞結(jié)構(gòu)的形成[5]，PTEN還與細胞周期調(diào)節(jié)、遷移及腫瘤進展密切相關(guān)[6]。有研究表明，PTEN在細胞核內(nèi)具有非磷酸酶活性和獨立于PI3K/AKT信號通路的功能[7]，PTEN水平的輕微改變都可能影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究探討PTEN磷酸化(p-PTEN)在胃癌組織中的表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

2015年1月～2016年1月于我院行胃癌根治術(shù)并經(jīng)病理證實的胃癌病人85例；收集其胃癌組織標本和距癌灶邊緣5cm以上且病理證實為在正常胃黏膜的癌旁組織。85例病人中，男性48例，女性37例；年齡35～73歲，平均年齡(61.23±5.14)歲。收集病人的性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑、浸潤深度、癌坯抗原(CEA)、糖鏈抗原(CA)19-9、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。所有病人胃癌標本均經(jīng)本院病理證實，病人術(shù)前均未行放療、化療及生物治療，入組胃癌病人術(shù)后聯(lián)合化學藥物治療，其中以奧沙利鉑+替吉奧(SOX)等化療藥物為主。在組織樣本收集之前均獲得病人知情同意并簽署了知情同意書，排除因各種原因造成的失訪病人。

二、方法

1.p-PTEN水平檢測：采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase，SP) 法檢測。所有標本取材后經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，對石蠟塊予以4 μm連續(xù)切片，隨后3%的雙氧水孵育10分鐘后，高溫高壓修復(fù)切片10分鐘，滴加一抗二抗，DAB顯色。用已知陽性的胃癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。p-PTEN抗體購自英國Abcam公司(ab47332)。免疫組化SP試劑盒、二抗及DAB 顯色液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.免疫組化染色結(jié)果判定:由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對免疫組化結(jié)果進行評估。由病理科醫(yī)師鏡下隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，根據(jù)染色細胞比例和染色強度進行計分。(1)染色陽性率<5%計0分，5.1%～25%計1分，25.1%～50%計2分，50.1%～75%計3分，>75%計4分。(2)染色強度：未著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕褐色計3分。根據(jù)兩種評分相加將p-PTEN分為兩組，0～1分為低表達組，2分以上為高表達組[8]。

3.隨訪:對所有病人通過電話或查閱病例的方式進行隨訪，隨訪截止時間至2020年1月。隨訪時間為為4～59個月。記錄下病人的總生存期(overall survival，OS)。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用例(%)表示，用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法；兩者生存期的比較采用Log-rank 法；預(yù)后危險因素采用Cox 比例風險模型進行單因素和多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.胃癌組織和癌旁組織中p-PTEN的表達見表1。結(jié)果表明，p-PTEN主要存在于胞核或胞漿內(nèi)，胃癌組織中的p-PTEN表達水平高于癌旁組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 胃癌組織和癌旁組織中p-PTEN表達的比較(例)

2.胃癌病人p-PTEN的表達與臨床病理特征的相關(guān)分析:胃癌組織中p-PTEN的表達與病人的年齡、性別及腫瘤直徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；胃癌組織中p-PTEN的表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，p-PTEN的高表達有較高的分化程度、浸潤深度及TNM分期，同時p-PTEN的高表達也有較高的轉(zhuǎn)移率(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌病人p-PTEN的表達與其臨床病理特征的相關(guān)分析

3.p-PTEN的表達與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系：85例胃癌病人隨訪時間為4～59個月，中位OS為36.269個月;至隨訪結(jié)束，共有49例病人存活，36例死亡。 p-PTEN高表達病人的OS 范圍為3～39個月，中位OS為24.576個月；Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，p-PTEN高表達病人的OS較p-PTEN低表達病人明顯縮短(P<0.05) 。見圖1。

圖1 p-PTEN的表達與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系

4.影響胃癌病人OS的危險因素分析:將年齡、性別、CEA、CA19-9、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯等臨床相關(guān)因素及p-PTEN納入單因素Cox比例風險回歸模型分析，結(jié)果顯示，CEA、CA19-9、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的影響因素，見表3；將上述影響因素納入多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，CEA、CA19-9、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的獨立風險因素(P<0.05)。見表4。

表3 影響胃癌病人OS的單因素分析

表4 影響胃癌病人OS的多因素分析

討論

WHO在2020年全球癌癥報告中指出，胃癌的年均標化死亡率(ASIR)較高，發(fā)病例數(shù)達到100萬，死亡例數(shù)達到78.3萬[9]。在我國，胃癌在男性惡性腫瘤的發(fā)病率位于第2位，女性位于第4位，總病死率居第2位[10]。早期胃癌癥狀不典型，診斷率低，確診時多處于中晚期。篩選出與胃癌早期相關(guān)的生物學標志物就顯得至關(guān)重要。

正常情況下，PTEN通過PI3K/AKT信號通路、MAPK途徑和FAK/p130 cas途徑參與調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)細胞凋亡抑制細胞不斷增殖、抑制腫瘤血管形成以及細胞的侵襲和遷移[11-12]。在多種人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PTEN的缺失或失活，PTEN的磷酸化是PTEN失活的一種新機制，PTEN的磷酸化可以有多種激酶誘導(dǎo)，如CK2、LKB1、GSK-3β等[13-14]，PTEN的失活會影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及非磷酸酶依賴的生物學功能。

我們運用免疫組化法檢測p-PTEN在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的p-PTEN表達水平高于癌旁組織，與Papakonstanti 等[15]研究結(jié)果一致，說明胃癌病人的PTEN發(fā)生了失活。胃癌組織中p-PTEN的表達與病人的年齡、性別及腫瘤直徑無關(guān)；胃癌組織中p-PTEN的表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時p-PTEN的高表達也有較高的轉(zhuǎn)移率，董愛芬等[16]研究認為，PTEN的表達與癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。以上結(jié)果可推測p-PTEN可能會提高腫瘤細胞的侵襲性，刺進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病人中p-PTEN 高表達病人的總生存期較p-PTEN低表達病人縮短。單因素Cox比例風險回歸模型和多因素Cox比例風險回歸顯示，p-PTEN表達水平是影響胃癌病人OS的獨立風險因素。提示p-PTEN的高表達在胃癌病人中可能預(yù)示著不良結(jié)局，可作為胃癌早期診斷的分子生物學指標。