軀體癥狀障礙患者腸道菌群特征研究

董玲玲,梁韻淋，孫霞，季陳鳳，倪開濟(jì)，駱艷麗

軀體癥狀障礙(Somatic Symptom Disorder，SSD)患者存在突出的軀體癥狀，胃腸道癥狀常見，其核心特征是圍繞軀體癥狀的思維、情緒反應(yīng)及患病行為異常。目前SSD的發(fā)病機(jī)制不明，可能與神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫功能紊亂有關(guān)[1-2]。腦-腸軸是腸道與大腦交流的雙向神經(jīng)通路，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)共同組成[3-4]。腸道菌群可以通過腦-腸軸作用于大腦，腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致大腦功能的改變，在抑郁障礙、雙相障礙、精神分裂癥等精神疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[5-7]。目前尚無SSD患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析研究，本研究采用16S rRNA基因測序方法，通過比較SSD患者和健康對照者的糞便中腸道微生物的構(gòu)成，評估SSD患者中腸道微生物變化特點(diǎn)，以深入研究其發(fā)病機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象

通過方便采樣法，選取2018年8月至12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院各臨床科室門診就診的SSD患者25例為SSD組。所有患者均為首次發(fā)作，且未曾使用抗抑郁藥治療，年齡18～65歲。SSD的診斷由兩位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的精神科主任醫(yī)師根據(jù)美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第5版(DSM-5)的診斷標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立診斷。同時(shí)招募與患者組性別、年齡、教育程度相匹配的25名健康志愿者作為健康對照(Health Control,HC),記為對照組(HC組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：SSD組合并精神分裂癥、抑郁障礙、雙相障礙等其他精神障礙/HC組有既往精神障礙病史；酒精或精神活性物質(zhì)濫用史；患有慢性肝病、糖尿病、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≥35.0 kg/m2、腸易激綜合征、纖維肌痛；嚴(yán)格素食或葷食或嚴(yán)重偏食者；入組前1個(gè)月內(nèi)使用過抗生素者。

本研究通過倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試在入組前均對研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般人口學(xué)及臨床資料收集 使用自制問卷收集受試一般資料，包括性別、年齡、教育程度、婚姻狀況。使用15項(xiàng)患者健康問卷(PHQ-15)評估患者受軀體癥狀困擾的嚴(yán)重程度；多倫多述情障礙量表(TAS-20)評估患者述情障礙水平；使用17項(xiàng)漢密爾頓抑郁量表(HAMD)評估受試抑郁嚴(yán)重程度；漢密爾頓焦慮量表(HAMA)評估受試焦慮嚴(yán)重程度。所有量表評估均由1位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的精神科醫(yī)師完成。

1.2.2 微生物多樣性分析 腸道微生物采集:所有受試將大便解至干燥容器內(nèi)，取糞便樣本200～300 mg，裝入大便盒中。研究者用取便器于樣本中段里部取50～100 mg糞便轉(zhuǎn)入無菌的2.0 ml離心管中，每個(gè)樣本留取3～5管，作好標(biāo)記，放入冰箱-80℃低溫保存，樣本采集過程在2 h內(nèi)完成。待所有受試者樣本收集完畢后，干冰封存，送至華大基因(武漢)進(jìn)行16S rRNA高通量測序。

微生物信息分析:從樣本中提取DNA，PCR預(yù)擴(kuò)增檢測樣本是否合格。樣本檢測合格后進(jìn)行可變區(qū)域擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢、純化以及文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和qPCR定量，文庫合格后，通過Illumina HiSeq進(jìn)行雙末端測序。下機(jī)數(shù)據(jù)去除接頭污染序列、含N序列、低復(fù)雜度reads序列等低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量的clean data。通過reads之間的重疊關(guān)系將成對reads組裝成一條序列，得到高可變區(qū)的Tags。根據(jù)相似度>97%，將Tags聚類成多個(gè)操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU),通過與數(shù)據(jù)庫對比，對OTU進(jìn)行物種注釋。基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣本物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。使用 QIIME軟件(Version1.8.0)計(jì)算物種α多樣性和β多樣性。α多樣性是對單個(gè)樣本物種多樣性的分析，包括5個(gè)指數(shù)：observedspecies指數(shù)、chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。指數(shù)越大，樣品的物種越豐富； simpson指數(shù)越小，樣品的物種越豐富。β多樣性是用來比較一對樣品在物種多樣性方面存在的差異大小，分析各類群在樣品中的含量，進(jìn)而計(jì)算出不同樣品間的β多樣性值。本研究用weighted UniFrac衡量β多樣性，它考慮了序列間的進(jìn)化距離和序列的豐度，該指數(shù)越大表示樣品間的差異越大。

微生物多樣性分析：①OTU及其豐度分析 統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的OTU個(gè)數(shù)，得出豐度信息初步說明樣本的物種豐富程度。制作Venn圖，重疊部分為兩組共有的OTU，未重疊部分為兩組各自特有的OTU。制作OTU Rank曲線，用于解釋樣本所含物種的豐富程度和均勻程度，曲線越寬，說明樣品中物種組成越豐富；曲線越平坦，說明樣品中物種組成的均勻度越高。②采用兩樣品比較的秩和檢驗(yàn)分析α多樣性各指數(shù)的組間差異。使用R(v3.1.1)軟件中的NMF包的aheatmap作圖制作β多樣性矩陣熱圖(heatmap)，通過圖形將β多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，并對樣品進(jìn)行聚類，將具有相似beta多樣性的樣品聚類在一起，反映樣品間的相似性。③物種注釋分析 對SSD組與HC組在門、綱、目、科、屬、種各分類水平的物種相對豐度采用獨(dú)立雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析腸道菌群組成異同。④對SSD組在α多樣性以及屬水平與HC組存在組間差異的菌群相對豐度與臨床量表評分作Spearman相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般人口學(xué)資料及臨床資料比較

研究共納入25例SSD患者及25名健康對照者，其中，由于微生物16S rRNA分析階段質(zhì)檢不合格，剔除3份SSD組及1份HC組樣本，最終有22例SSD組及24名HC組進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。兩組年齡、性別、教育程度及婚姻狀況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SSD組HAMA和HAMD17總分均顯著高于HC組，兩組TAS-20總分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SSD組患者的病程為(3.84±4.22)年，PHQ-15總分2～18分，平均(8.32±4.00)分。見表1。

表1 兩組一般人口學(xué)及臨床資料比較例數(shù))

2.2 兩組腸道菌群豐度及菌群種類比較

2.2.1 OTU及其豐度分析 兩組46份樣本共獲得2 812 921個(gè)高變區(qū)Tags。將相似度>97% Tags聚類成多個(gè)OTUs,與數(shù)據(jù)庫對比進(jìn)行物種注釋。去除沒有注釋結(jié)果的OTU及不屬于分析項(xiàng)目的物種，最終獲得可用于后期研究的OTUS。結(jié)果顯示， SSD組中平均每個(gè)樣本含(181.14±55.17)個(gè)OTUs，HC組平均每個(gè)樣本含(221.38±62.91)個(gè)OTUs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。

OTU Venn圖分析：SSD組共有590個(gè)OTUs，HC組共有631個(gè)OTUs，其中有530個(gè)OTUs為兩組共有，在兩組分別占89.83%和83.99%。SSD組所含OTU數(shù)量小于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.297,P=0.026)。

OTU Rank曲線顯示，在水平方向上，SSD組曲線寬度小于HC組，提示SSD組菌群物種組成的豐富程度較低;曲線較HC組陡峭,提示SSD組菌群物種分布相對不均勻，優(yōu)勢菌群所占比例相對較高。見圖1。

圖1 OTU Rank曲線

2.2.2 α和β多樣性分析 α多樣性分析顯示，與HC相比，SSD組的observed species指數(shù)、shannon指數(shù)較低，simpson指數(shù)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組chao指數(shù)及ace指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β多樣性熱圖及聚類分析結(jié)果顯示：所有樣本被聚成兩類，其中一類包含8名HC和12例SSD，另一類包含16名HC和10例SSD，但聚類的結(jié)果并不十分理想，不能準(zhǔn)確區(qū)分SSD組與HC組。見表2，見圖2。

圖2 SSD組及HC組間α多樣性比較盒型圖

表2 SSD組及HC組菌群α多樣性比較

2.2.3 物種注釋分析 通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，對OTU進(jìn)行物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類水平對各樣本物種組成相對豐度進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在門水平，SSD組與HC組的優(yōu)勢菌群基本一致，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門等4個(gè)優(yōu)勢菌門。SSD組在大腸埃希菌種及其所屬的屬、科、目、綱水平的相對豐度均較HC組高；此外，在種水平還發(fā)現(xiàn)，SSD組活潑瘤胃球菌種的相對豐度明顯高于HC組；單形擬桿菌種、布氏瘤胃球菌種的相對豐度明顯低于HC組。見表3。

表3 兩組菌群相對豐度比較

2.2.4 相關(guān)分析 對SSD組PHQ-15總分與其他臨床量表的總分作Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明，PHQ-15總分與HAMA總分、HAMD17總分、TAS-20總分正相關(guān)(r=0.666、0.706、0.458，P=0.001、0.000、0.032)。在SSD組，對存在組間差異的α多樣性以及菌屬相對豐度與各臨床量表總分作Spearman相關(guān)分析，未發(fā)現(xiàn)菌群多樣性和相對豐度與各臨床量表之間存在相關(guān)關(guān)系。見表4。

表4 SSD組菌群特征與臨床量表評分的相關(guān)分析(r值)

3 討論

臨床上SSD識別率低，患者生活質(zhì)量差[8-10]，因此尋找特異生物學(xué)標(biāo)記是目前SSD研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，SSD組腸道菌群多樣性降低，埃希氏桿菌屬及其所屬的科、目、綱水平含量增加。本研究結(jié)果還顯示SSD組的腸道菌群豐度較HC組降低。疼痛和疲乏是SSD的常見表現(xiàn)，也是慢性疲勞綜合征及纖維肌痛的主要癥狀，目前關(guān)于后兩者的腸道菌群研究有一定進(jìn)展，可幫助從癥狀維度理解SSD的腸道菌群特征。研究發(fā)現(xiàn)，慢性疲勞綜合征患者腸道菌群多樣性降低、腸桿菌科相對豐度增加[11]，纖維肌痛患者腸道菌群多樣性降低、雙歧桿菌相對豐度降低[12]。此外，SSD在臨床表現(xiàn)及病理生理上與焦慮抑郁有許多相似之處，相關(guān)研究結(jié)果或可為本研究提供參考。Liu等[13]報(bào)道抑郁患者shannon指數(shù)降低，也有研究報(bào)道抑郁癥患者多個(gè)指標(biāo)均提示其菌群豐度降低[14]，Chen等[15]報(bào)道焦慮患者的豐度較健康對照降低。上述研究均未發(fā)現(xiàn)α多樣性指數(shù)與焦慮抑郁癥狀之間有相關(guān)性，與本研究結(jié)果相似。另一方面，有研究報(bào)道，未發(fā)現(xiàn)精神疾病患者與健康對照的β多樣性存在差異，通過β多樣性聚類未能將患者組與對照組較好區(qū)分開來[16]。綜上所述，SSD患者與其他精神障礙類似，存在腸道菌群豐度下降， α多樣性降低提示腸道菌群紊亂，潛在致病菌含量增多。腸道微生物或其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，通過神經(jīng)遞質(zhì)、自主神經(jīng)系統(tǒng)及下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸等，與大腦相互作用，參與多種精神疾病的病理過程[17]。而既往研究顯示SSD 患者存在神經(jīng)遞質(zhì)及自主神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，包括：5-HT 功能低下[18]，在情緒任務(wù)中副交感神經(jīng)活性低下[19]。故而推測腸道微生物通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌途徑及迷走神經(jīng)途徑介導(dǎo)SSD的發(fā)生。

腸道菌群物種注釋分析發(fā)現(xiàn)，在門水平SSD組與HC組優(yōu)勢菌群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，優(yōu)勢菌群主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門；與既往研究一致[20-21]。本研究結(jié)果顯示，SSD患者在埃希氏桿菌屬及其所屬的科、目、綱等水平的相對豐度均較HC組高；種水平菌群分布也存在組間差異，但受基因測序方法的檢測局限，本研究不作深入討論。動(dòng)物研究表明，應(yīng)激使腸道菌群多樣性降低，埃希氏桿菌含量增加，炎癥因子釋放增加，HPA軸功能亢進(jìn)，最終產(chǎn)生腸道炎癥、抑郁樣行為及認(rèn)知功能損害[22-25]。而SSD 患者存在免疫功能異常，包括T淋巴細(xì)胞活動(dòng)降低[26]、細(xì)胞因子水平異常[27]；這提示埃希氏桿菌可能通過影響炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌等途徑導(dǎo)致SSD的發(fā)生。

另外，SSD患者可能存在焦慮或抑郁癥狀，其受軀體癥狀困擾的嚴(yán)重程度與焦慮抑郁程度和述情障礙程度正相關(guān)；與很多研究發(fā)現(xiàn)類似[8,28]，提示臨床醫(yī)生應(yīng)重視SSD患者的心理因素并加以干預(yù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SSD患者腸道菌群多樣性降低，潛在致病菌埃希氏桿菌增加，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，可能通過炎癥、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌等途徑介導(dǎo)SSD的發(fā)生發(fā)展。本研究存在一些局限：首先，樣本量較小，結(jié)果推廣需謹(jǐn)慎。其次，16S rRNA基因測序方法只能注釋部分菌種，有相當(dāng)數(shù)量菌種無法被注釋。再者，無法嚴(yán)格控制或定量分析被試飲食營養(yǎng)差異，可能會影響腸道菌群構(gòu)成。將來的研究需擴(kuò)大樣本量、采用更為精準(zhǔn)的分析技術(shù)、控制飲食混雜因素、提供更多的臨床信息，以進(jìn)一步探究疾病的病理機(jī)制。