香茅草離體快繁體系的建立

魏秋蘭 肖玉菲 張曉寧 鐘連香 覃子海 陳博雯 張燁 覃玉鳳

摘 要：以香茅草地下莖段為外植體，研究了不同基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響。結(jié)果表明：適于香茅草芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM + 6-BA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1，芽誘導(dǎo)率可達(dá)81.1%;適于芽增殖的培養(yǎng)基為WPM + 6-BA 2.5 mg·L-1 + NAA 0.4 mg·L-1，增殖倍數(shù)達(dá)5.0;適于生根的培養(yǎng)基為1/2 WPM + IBA 0.5 mg·L-1 + IAA 1.0 mg·L-1，生根率達(dá)95.8 %，平均根條數(shù)5.5;經(jīng)煉苗后移栽至椰糠基質(zhì)中，成活率為98%。

關(guān)鍵詞：香茅草;組織培養(yǎng);離體快繁;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：Q943.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment of in Vitro Rapid Propagation System of Cymbopogon citratus

WEI Qiulan，XIAO Yufei，ZHANG Xiaoning，ZHONG Lianxiang，QIN Zihai，CHEN Bowen，ZHANG Ye，QIN Yufeng*

（Guangxi Forestry Research Institute，Nanning，Guangxi 530002，China）

Abstract：The effects of different combinations of basic media and plant growth regulators on buds induction，multiplication and rhizogenesis were studied with rhizomes of Cymbopogon citratus as explants. The results showed that the most optimum medium for induction of adventitious buds was WPM + 6-BA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1，on which the germination rate reached 81.1% .The most optimum subculture medium was WPM + 6-BA 2.5 mg·L-1 + NAA 0.4 mg·L-1，on which the multiplication ratio was 5.0. The most optimum rooting medium was 1/2WPM + IBA 0.5 mg·L-1 + IAA 1.0 mg·L-1，on which the rooting rate reached 95.8%，and average number of roots was 5.5. The seedlings were transplanted into coconut bran substrate after being hardened-off，and the survival rate was 98%.

Key words：Cymbopogon citratus;tissue culture;in vitro rapid propagation;culture medium

香茅草（Cymbopogon citratus）為禾本科（Graminaeae）香茅屬（Cymbopogon）植物，莖葉具有濃郁的檸檬香氣，故又稱檸檬草，是一種多年生草本香料植物[1]，也是園林造景不可缺少的植物之一，具有觀賞、綠化、美化等功能。香茅草全草可入藥，莖葉因含有檸檬醛[2]，具有調(diào)節(jié)情緒、疏風(fēng)解表、緩解疼痛、清除自由基[3]、降壓等功效，能治療肌肉拉傷、頭痛、肺熱咳嗽等癥[4]。隨著健康理念的發(fā)展，集生態(tài)與藥用價(jià)值一體的香茅草，市場(chǎng)需求量增大。香茅草的繁殖方式一般是利用根長(zhǎng)出的幼株，從根部分株移栽，這種無(wú)性繁殖的方式速度極慢，產(chǎn)量很低，無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，而且長(zhǎng)期分株，操作不當(dāng)，就會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷根部，導(dǎo)致細(xì)菌感染，種源抗性降低，品質(zhì)變差。采用組織培養(yǎng)技術(shù)，既可保持優(yōu)良的品種特性，又可加快繁殖速度[5]，對(duì)提高香茅草的產(chǎn)量和品質(zhì)有很大的促進(jìn)作用。目前，有關(guān)香茅草的研究主要集中在精油含量[6-9]、提取工藝[10]等方面，有關(guān)組織培養(yǎng)技術(shù)方面的研究報(bào)道甚少，蔡宣梅[11]以莖尖和鞠玉棟[12]以頂芽作為外植體，研究了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生長(zhǎng)各階段的影響。香茅草組織培養(yǎng)技術(shù)研究中，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道利用地下帶芽莖段作為外植體、以及除了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響外并未涉及其它影響因子的研究。本試驗(yàn)以香茅草地下帶芽莖段為外植體，探究了不同基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響，以及組培苗移栽基質(zhì)篩選等，建立了香茅草高效組培繁殖體系，為良種苗木規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

香茅草采自廣西林科院試驗(yàn)基地的優(yōu)良植株，1年生，長(zhǎng)勢(shì)好，無(wú)病蟲害，以地下莖段為外植體。切去葉片、根部，剝盡地下莖的葉鞘，用小軟刷刷洗干凈，自來(lái)水沖洗1 h，嫩莖剪成2～3 cm的莖段（帶1個(gè)芽以上），按木質(zhì)化程度分類置于消毒瓶?jī)?nèi)，在超凈工作臺(tái)上用75 %酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，再浸入0.1%氯化汞溶液消毒10 min，無(wú)菌水清洗5～6次，無(wú)菌濾紙吸干莖段表面水分接種到培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

以不同基本培養(yǎng)基（MS、WPM、B5）、6-BA（0.2 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.8 mg·L-1）、NAA（0.1 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1）為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交培養(yǎng)基組合，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接30瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d，觀察記錄芽形態(tài)特征，統(tǒng)計(jì)外植體萌芽率，用直觀分析法篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基組合。

1.2.2 芽增殖培養(yǎng)

1.2.2.1 不同激素組合對(duì)芽增殖的影響

將誘導(dǎo)叢芽（高1～2 cm）接種于增殖培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基WPM，分別添加6-BA 0.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.5 mg·L-1、3.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，12個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶，每瓶接種5個(gè)叢芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)新增芽數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.2.2.2 不同蔗糖濃度對(duì)芽增殖的影響

培養(yǎng)基采用WPM，并添加1.2.2.1篩選出的最佳激素組合、設(shè)計(jì)5個(gè)水平的蔗糖濃度分別為10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1、50 g·L-1，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，5個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶，每瓶接種5個(gè)叢芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)新增芽數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.2.3 根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將芽接入根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基為（1/2WPM、2/3WPM、WPM），分別添加不同濃度的IBA、IAA和不同蔗糖濃度（見(jiàn)表3），采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，9個(gè)處理，每個(gè)處理6瓶，每瓶接種5個(gè)芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)生根率、生根條數(shù)，觀察根系質(zhì)量狀況。

1.2.4 煉苗與移栽

當(dāng)生根瓶苗培養(yǎng)30 d后，把它移入散射光下的陽(yáng)光棚內(nèi)，先閉蓋5 d，后開(kāi)蓋6 d進(jìn)行煉苗，移栽基質(zhì)是紅泥、椰糠和全沙，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3個(gè)處理，每個(gè)處理移栽30株，重復(fù)3次，移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率和苗高，確定最佳的移栽基質(zhì)。

1.3 培養(yǎng)條件

除生根培養(yǎng)基含蔗糖15 g·L-1，其余培養(yǎng)基中均含蔗糖30 g·L-1，瓊脂4 g·L-1，pH值5.5～6.0，光照強(qiáng)度800～4 000 lx，光照時(shí)間10～12 h·d-1，溫度25 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，對(duì)各試驗(yàn)因素進(jìn)行顯著性分析和極差分析。

萌芽率（%）=萌芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100。

增殖倍數(shù)=芽發(fā)出叢生芽的總數(shù)/接種時(shí)單芽總數(shù)。

成活率（%）=成活株數(shù)/移栽總株數(shù)×100。

生根率（%）=生根的芽數(shù)/接種的芽總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

將消毒獲得的無(wú)污染帶芽莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，5～7 d莖段的芽點(diǎn)開(kāi)始萌動(dòng)，10～15 d芽體慢慢膨大長(zhǎng)出綠色小芽，20 d芽長(zhǎng)至1～2 cm高。從表1的多重比較可看出，各處理之間誘導(dǎo)率差異顯著，8號(hào)處理的誘導(dǎo)率最高為81.1%，且苗長(zhǎng)勢(shì)好，莖粗壯，葉綠色。極差R分析表明（表1），三因素對(duì)外植體芽誘導(dǎo)影響大小順序?yàn)镽基本培養(yǎng)基>R6-BA>RNAA，表明在組織培養(yǎng)中，通過(guò)調(diào)整6-BA濃度和基本培養(yǎng)基類型是提高芽誘導(dǎo)率的兩個(gè)關(guān)鍵因素?；九囵B(yǎng)基之間對(duì)外植體芽誘導(dǎo)率存在顯著性差異，對(duì)芽誘導(dǎo)影響大小順序?yàn)閃PM>MS>B5。WPM培養(yǎng)基對(duì)芽誘導(dǎo)率分別比MS、B5的高21.7%、33.5%。6-BA的3個(gè)水平之間存在顯著差異，以1.0 mg·L-1 對(duì)芽平均誘導(dǎo)率最高，為58.5%，NAA的 3個(gè)水平之間存在顯著性差異，以0.1 mg·L-1對(duì)芽平均誘導(dǎo)率最高，為49.7%。綜合分析，芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基組合是WPM+ NAA 0.1 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1，芽誘導(dǎo)率最高為81.1%。

2.2 芽增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同激素組合對(duì)芽增殖的影響

由表2可知，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度由0.2 mg·L-1提高到0.4 mg·L-1時(shí)，芽增殖倍數(shù)隨之提高，NAA質(zhì)量濃度提高到0.6 mg·L-1，芽的增殖倍數(shù)隨之降低，芽的愈傷組織出現(xiàn)較明顯;同一濃度NAA中，6-BA質(zhì)量濃度由0.5 mg·L-1增加到2.5 mg·L-1時(shí)，芽的增殖倍數(shù)隨之提高，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到3.5 mg·L-1時(shí)，芽的增殖倍數(shù)隨之降低。不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)香茅草芽增殖倍數(shù)的影響各處理之間差異顯著。7號(hào)處理的芽增殖倍數(shù)最大為5.0，從芽的長(zhǎng)勢(shì)看，苗健壯，葉色深綠色。因此，最適于香茅草芽增殖的激素組合是7號(hào)處理，即NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 2.5 mg·L-1。

2.2.2 不同蔗糖濃度對(duì)芽增殖的影響

由圖1可知，不同蔗糖濃度對(duì)香茅草芽增殖倍數(shù)的影響差異顯著，增殖倍數(shù)隨著蔗糖濃度的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖濃度由10 g·L-1增加到30 g·L-1時(shí)，芽增殖倍數(shù)隨之上升，最高增殖倍數(shù)是5.02（30 g·L-1），蔗糖濃度超過(guò)30 g·L-1時(shí)，芽的增殖倍數(shù)隨之下降。從芽生長(zhǎng)狀況來(lái)看，當(dāng)蔗糖濃度小于30 g·L-1時(shí)，芽的長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)不佳，芽弱小，葉淺黃色，當(dāng)蔗糖濃度大于30 g·L-1時(shí)，芽生長(zhǎng)一般，但葉明顯出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，當(dāng)蔗糖濃度為30 g·L-1，芽生長(zhǎng)旺盛、健壯，葉深綠色。綜合來(lái)看，香茅草芽的增殖培養(yǎng)基中蔗糖濃度最佳為30 g·L-1。

2.3 根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將株高2～3 cm、健壯的繼代單芽分別接入表3的生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根。由表3可知，不同基本培養(yǎng)基、IAA和IBA組合對(duì)香茅草生根率和根條數(shù)的影響差異均顯著。極差R分析表明，3個(gè)因素對(duì)生根率影響，各因素極差分別為R基本培養(yǎng)基=14.5，RIAA=4.2，RIBA=4.6，即3因素影響生根率的主次關(guān)系為：R基本培養(yǎng)基>RIBA>RIAA，則影響生根率的最優(yōu)培養(yǎng)基為：1/2WPM+IBA 1.0 mg·L-1+IAA 1.5 mg·L-1，培養(yǎng)30 d，生根率達(dá)90.7 %。

針對(duì)根條數(shù)這個(gè)指標(biāo)，各因素的極差分別為：R基本培養(yǎng)基=1.3，RIAA=0.3，RIBA=0.4，即3個(gè)因素影響由主到次依次為：R基本培養(yǎng)基>RIBA>RIAA，則最優(yōu)培養(yǎng)基為：1/2WPM+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1，生根條數(shù)為5.5。

從根系質(zhì)量狀況來(lái)看，7號(hào)和8號(hào)處理的根系質(zhì)量較好，主根健壯，須根分明、生根條數(shù)較多，根部產(chǎn)生的愈傷組織非常少。綜上所述，根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為8號(hào)處理，即1/2WPM+IBA 0.5 mg·L-1 +IAA 1.0 mg·L-1，生根率為95.8%，生根條數(shù)為5.5。

2.4 煉苗與移栽

從表4可看出，栽培基質(zhì)對(duì)香茅草移栽成活率的影響差異顯著，處理3的移栽成活率最高達(dá)98%，平均苗高5.7 cm，明顯高于其它處理。對(duì)苗高的影響，紅心土和椰糠基質(zhì)之間差異不顯著。綜合分析得出，移栽效果最好的基質(zhì)是椰糠。

本研究已經(jīng)建立了一套香茅草離體快繁體系（圖2），并在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。

3 討論與結(jié)論

植物細(xì)胞具有全能性，任何完整的單個(gè)植物細(xì)胞都有可能形成新的完整植株。研究表明，地下帶芽莖段有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力，是最佳的外植體[13]。外植體生長(zhǎng)階段所需的營(yíng)養(yǎng)主要來(lái)源于基本培養(yǎng)基[14]，而基本培養(yǎng)基類型種類繁多，它們所含的營(yíng)養(yǎng)成分各不相同。本試驗(yàn)采用香茅草地下帶芽莖段為材料，通過(guò)MS、B5、WPM 3種基本培養(yǎng)基比較表明，供試驗(yàn)的3種基本培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量為MS>B5>WPM。含高濃度無(wú)機(jī)鹽的MS培養(yǎng)基最不適合香茅草培養(yǎng)，原因可能是MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量較高，尤其銨和硝酸鹽對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用，而含低濃度無(wú)機(jī)鹽的WPM基本培養(yǎng)基是香茅草最佳的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)基，1/2WPM是最佳的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，說(shuō)明低濃度無(wú)機(jī)鹽更有利于香茅草培養(yǎng)。張樹河[15]研究了香茅草離體快速繁殖，以莖尖為外植體、MS為基本培養(yǎng)基，并附加6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1作為增殖培養(yǎng)基，得到香茅草叢生芽的增殖倍數(shù)是4.05，與本試驗(yàn)的結(jié)論（增殖倍數(shù)5.0）不一致，可能是與采用香茅草外植體不同有關(guān)或同一種植物不同器官的細(xì)胞中所含的激素水平不盡相同也有關(guān)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的合理組合對(duì)不定芽的萌發(fā)、增殖及生根有較大的影響作用[16]。在植物組織培養(yǎng)中，廣泛應(yīng)用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素[17]，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中激素組合的含量，使芽分化速度和增殖倍數(shù)大大提高，縮短種苗繁殖時(shí)間，并且可保持品種的優(yōu)良品質(zhì)和提高產(chǎn)量[18]。本試驗(yàn)6-BA和NAA聯(lián)合使用，芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率高達(dá)81.1%以上，繼代增殖培養(yǎng)基為WPM+6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1，增殖倍數(shù)達(dá)5.0，且芽生長(zhǎng)旺盛、粗壯，根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2 WPM+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1，生根率達(dá)95.8%以上，平均生根條數(shù)為5.5，根系質(zhì)量效果較好，可見(jiàn)提高了香茅草的萌芽率及增殖倍數(shù)，與上述結(jié)論相一致。

移栽是植物組織培養(yǎng)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，苗的根系質(zhì)量以及移栽前煉苗和基質(zhì)選擇對(duì)移栽成活率有很大的影響[19]，如果不注意以上關(guān)鍵環(huán)節(jié)，很可能導(dǎo)致成活率急劇下降，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。組培瓶苗在室內(nèi)恒溫、無(wú)菌的優(yōu)越環(huán)境條件下培養(yǎng)，體表的保護(hù)組織很薄、蒸騰速率和凈光合速率很低，幼苗抗逆能力弱，適應(yīng)外界能力很差[20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提高組培苗移栽成活率的關(guān)鍵是移栽前進(jìn)行組培苗煉苗，煉苗方式是選擇在室外散射光的大棚里、閉蓋煉苗5 d、開(kāi)蓋煉苗6 d，這種方式很大程度上提高了組培苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力。此外，選擇合適的移栽基質(zhì)并對(duì)基質(zhì)消毒也是提高組培苗成活率的重要因素。研究結(jié)果表明，移栽在沙、紅心土基質(zhì)中的組培苗成活率比在椰糠基質(zhì)中的成活率低，椰糠基質(zhì)中的成活率達(dá)98%以上，平均苗高5.7 cm，根系發(fā)達(dá)、苗健壯、葉深綠色，這可能與椰糠疏松透氣性強(qiáng)，并含有苗生長(zhǎng)所需的豐富養(yǎng)分有直接關(guān)系，而移栽在全沙基質(zhì)中的組培苗，成活率和苗高表現(xiàn)均較差，可能是因?yàn)槿车膬?chǔ)水能力弱且含氧少的原因?qū)е隆?/p>

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作者簡(jiǎn)介：魏秋蘭（1973-），女，工程師，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail：274490087@qq.com。

*通信作者：覃玉鳳（1981-），女，碩士，工程師，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail：51519198@qq.com。

收稿日期：2021-12-03