2種氟苯尼考注射液在雞體內(nèi)的藥動學(xué)和生物等效性研究

孫政 楊彥平 曹博 邱康 畢冠華 劉艷 宋延平

摘要 [目的]比較先靈葆雅動物保健公司生產(chǎn)的氟苯尼考注射劑（參比制劑）和國內(nèi)某廠家生產(chǎn)的氟苯尼考注射劑（受試制劑）在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，并評價2種制劑間的生物等效性。[方法]選用24只快大型白羽肉雞，分為2組，按0.067 mL/kg的劑量分別給予受試制劑和參比制劑。采用液質(zhì)聯(lián)用法測定血藥濃度，使用WinNonlin軟件計算2種制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)和生物等效性。[結(jié)果]受試制劑和參比制劑的峰濃度（Cmax）分別為（4.85±0.57）和（4.83±0.43）μg/mL，達(dá)峰時間（Tmax）分別為（39.58±23.68）和（41.67±16.06）min，曲線下面積（AUC0-24 h）分別為（1 561.32±497.38）和（1 529.25±444.88）（μg·min）/mL。雙單側(cè)t檢驗(yàn)法和置信區(qū)間法結(jié)果均表明2種制劑生物等效。[結(jié)論]國產(chǎn)氟苯尼考注射液與先靈葆雅動物保健公司生產(chǎn)的氟苯尼考注射液生物等效。

關(guān)鍵詞 氟苯尼考注射液;藥代動力學(xué);生物等效性;液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類號 S 859.79? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）08-0081-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Pharmacokinetics and Bioequivalence of Two Kinds of Florfenicol Injection in Chicken

SUN Zheng，YANG Yan-ping，CAO Bo et al （Xi’an United Nations Quality Detection Technology Co.，Ltd.，Xi’an，Shaanxi 710086）

Abstract [Objective] To compare the pharmacokinetic characteristics and evaluate the bioequivalence of two kinds of florfenicol injections produced by Schering plough animal health company （reference preparation） and a domestic manufacturer （test preparation）.[Method]24 fast large white-feathered broilers were randomly divided into two groups.The reference preparation and test preparation were administrated by the dose of 0.067 mL/kg.LC-MS/MS method was used to determine the plasma concentration，and pharmacokinetic parameters and bioequivalence result of the two preparations were calculated by WinNonlin.[Result]The peak concentrations（Cmax） of test preparation and reference preparation were （4.85±0.57） and （4.83±0.43） μg/mL respectively，Tmax were （39.58±23.68）? and （41.67±16.06） min respectively，AUC0-24 h were （1 561.32±497.38） and （1 529.25±444.88） （μg·min）/mL.Analysis of double one-sided t-test and confidence interval showed that the two preparations were bioequivalent.[Conclusion]Two kinds of florfenicol injections from Schering-Plough animal health company and domestic market were bioequivalent.

Key words Florfenicol injection;Pharmacokinetic;Bioequivalence;LC-MS/MS

氟苯尼考是一種醇胺類的廣譜抗菌藥，由美國先靈葆雅公司于1988年研制成功。它對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和支原體等有較強(qiáng)的抗菌活性，主要用于治療由敏感菌引起的豬、雞和魚類細(xì)菌性疾病 [1]，在英、美、日、韓等國家均有廣泛應(yīng)用 [2]。我國于1999年批準(zhǔn)氟苯尼考為國家二類新獸藥，此后大量高校和企業(yè)對氟苯尼考開展研究。目前我國已批準(zhǔn)上市多種氟苯尼考制劑，如氟苯尼考粉、氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考預(yù)混劑、氟苯尼考注射劑等，可通過混飼、混飲、肌肉注射、靜脈注射等方式給藥。同時，氟苯尼考也常與其他藥物組合制成復(fù)方制劑，比如主要用于治療豬胸膜肺炎放線菌導(dǎo)致的呼吸道感染的氟苯尼考-氟尼辛葡甲胺注射液 [3]。

氟苯尼考的毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然氟苯尼考的副作用比氯霉素小，但當(dāng)氟苯尼考的使用劑量較高時，對動物的消化、免疫、生殖系統(tǒng)和器官均有毒性。當(dāng)氟苯尼考被大量應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時，對生態(tài)環(huán)境也有污染 [4-7]。因此，氟苯尼考在畜牧業(yè)中的應(yīng)用應(yīng)加以控制。藥品使用量與其療效密切相關(guān)。為保證藥物療效，控制仿制獸藥質(zhì)量，我國于2015年發(fā)布的《獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號管理辦法》 [8]規(guī)定：申請非新獸藥的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號的廠家需要根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的比對試驗(yàn)要求和目錄開展比對試驗(yàn)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第一批比對目錄中要求氟苯尼考注射液的仿制藥申請批準(zhǔn)文號時需要與原研廠家藥品進(jìn)行比對，并提供生物等效性試驗(yàn)結(jié)果 [9]。筆者根據(jù)《獸用化學(xué)藥品生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》 [10]，建立了一種液質(zhì)聯(lián)用法測定雞血漿中氟苯尼考含量的方法，采用血藥法計算2種制劑在雞體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)，并評價2種制劑間的生物等效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物。選擇35日齡左右（體重3 kg左右）健康公雞24只，品種為快大型白羽肉雞AA+。自由采食飲水，飼料為不含抗菌藥物的全價日糧。試驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥品。

參比制劑（R）：氟苯尼考注射液，由先靈葆雅動物保健公司法國廠生產(chǎn)，批號RKPB072002。

受試制劑（T）：氟苯尼考注射液，市售國產(chǎn)產(chǎn)品。

1.1.3 試劑。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)，批號K0301703;乙腈為色譜純;甲醇為色譜純;屈臣氏品牌的蒸餾水;EDTA-K2抗凝管。

1.1.4 儀器與設(shè)備。液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-20AD/API 4000）、離心機(jī)（5810R）、電子天平（十萬分之一）、渦旋振蕩儀、移液器。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥與采血。試驗(yàn)采用隨機(jī)、單次給藥、2×2自身交叉設(shè)計。

24只受試雞按體重大小采用蛇形分組法分成2組。2組受試雞按表1注射藥品，給藥劑量0.067 mg/kg，清洗期10 d。

受試雞于給藥前（0 min）和給藥后10、15、20、30、60、120、240、360、480、1 440 min分別采集外周血0.5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，并立即來回倒置，混勻;3 500 r/min離心10 min。離心后，吸取上清血漿分裝于準(zhǔn)備好的凍存管中，一式2份（測試管和備份管），及時將分裝的血漿樣品置于凍存盒中，-20 ℃下冷凍暫存;待1個周期全部血樣采集完后，將血樣保存在-80 ℃冰箱中，待測。

1.2.2 血液樣品分析。

1.2.2.1 液質(zhì)聯(lián)用色譜條件。

流動相為超純水（A）、乙腈（B）;色譜柱為Kinetex C18（50 mm×4.6 mm，2.6 μm）;流速1.0 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量1 μL。洗脫梯度如下：0～0.7 min，從10%B升高到95%B;0.7～1.5 min，95%B;1.5～1.6 min，從95%B降至10%B;1.6～2.5 min，10%B。質(zhì)譜條件如下：ESI-源，MRM模式，離子對356.05/185.02。

1.2.2.2 樣品前處理。取待測血漿樣品50 μL置于1.5 mL離心管中，加入250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.3 血液樣品分析方法驗(yàn)證。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：準(zhǔn)確稱取1 mg氟苯尼考，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，配制成濃度0.5～100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液以及濃度分別為1.5、40.0和80.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.2.3.2 定量限測定。

將空白雞血漿45 μL置于1.5 mL離心管中，取5 μL濃度0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，配制成血漿濃度50 ng/mL的模擬血漿溶液;加入250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取0.5～100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各5 μL，分別與45 μL空白雞血漿混勻，配制成血漿濃度50～10 000 ng/mL的模擬血漿溶液;加入250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。配制3批樣品，分3 d測定。

1.2.3.4 準(zhǔn)確度與精密度測定。取1.5、40.0和80.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各5 μL，分別與45 μL空白雞血漿混勻，配制成血漿濃度分別為150、4 000和8 000 ng/mL的模擬血漿溶液;加入250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃ 3 500 r/min下離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，各濃度平行配制6份。配制3批樣品，分3 d測定氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.3.5 回收率測定。提取回收率樣品：配制方法同準(zhǔn)確度與精密度測定所用樣品。

回收率參比樣品：取空白血漿100 μL，加入500 μL甲醇作為沉淀劑，4 ℃、3 500 r/min離心10 min;取295 μL上清液，往上清液中加入5 μL 1.5、40.0和80.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，混勻，配制成含150、4 000和8 000 ng/mL氟苯尼考的回收率參比溶液，進(jìn)樣分析。按照以下公式計算回收率：回收率=提取回收率樣品峰面積/參比回收率樣品峰面積×100%。

1.2.3.6 基質(zhì)效應(yīng)的測定。

分別使用空白血漿加入甲醇沉淀蛋白質(zhì)后的上清液和甲醇，配制成相同濃度的氟苯尼考溶液，各稀釋劑均平行配制6份，進(jìn)樣分析。按照以下公式計算基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)=上清液配制的氟苯尼考溶液峰面積/甲醇配制的氟苯尼考溶液峰面積×100%。

1.2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.3.4”方法配制模擬血漿溶液2組，每組3個濃度水平，每個濃度平行配制6份。一組在室溫下放置9 h，用250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，考察樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性;另一組在-90～-70 ℃冰箱中保存24 h后，室溫下融化，融化后重新保存在-90～-70 ℃冰箱中，凍融3次循環(huán)后加入250 μL甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。

采用非房室模型法計算藥動學(xué)參數(shù)，包括半衰期（T1/2）、達(dá)峰時間（Tmax）、峰濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC0-24 h），結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

將AUC0-24 h和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行方差分析。方差分析模型中將給藥順序、藥物、周期作為固定效應(yīng)，將受試雞個體作為隨機(jī)效應(yīng)，計算AUC0-24 h和Cmax的幾何均值比率（受試制劑/參比制劑）的90%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)《獸用化學(xué)藥品生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》（農(nóng)業(yè)部公告第1247號），評價分析方法驗(yàn)證結(jié)果，具體見表2。氟苯尼考樣品的液質(zhì)聯(lián)用色譜圖見圖1。

2.2 血藥濃度和藥動學(xué)參數(shù) 受試雞肌肉注射2種制劑后，血藥濃度-時間數(shù)據(jù)見表3。使用非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。由表4可知，參比制劑的Cmax為（4.85±0.57）μg/mL，Tmax為（39.58±23.68）min，T1/2為（299.06±151.12）min，AUC0-24 h為（1 561.32±497.38）（μg·min）/mL。受試制劑的Cmax為（4.83±0.43）μg/mL，Tmax為（41.67±16.06）min，T1/2為（255.12±98.65）min，AUC0-24 h為（1 529.25±444.88）（μg·min）/mL。

2.3 生物等效性

《獸用化學(xué)藥品生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》 [10]規(guī)定需先將AUC0-24 h和Cmax進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，再采用方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用雙單側(cè)t檢驗(yàn)法和90%置信區(qū)間法評價2種制劑的生物等效性。

方差分析結(jié)果表明，AUC0-24 h經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，不同給藥順序、制劑和周期間均無顯著差異，但不同動物個體間存在顯著差異（P<0.01）;Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，不同給藥順序、制劑、周期和動物個體之間均無顯著差異（P>0.05）。

雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，AUC0-24 h和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，t1和t2的P值（Prob_80_00和Prob_125_00）均小于0.05，說明2種制劑間生物等效。

AUC0-24 h和Cmax對數(shù)轉(zhuǎn)換后置信區(qū)間法評價結(jié)果（表6）表明，AUC0-24 h和Cmax幾何均值比經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后90%置信區(qū)間分別為96.31%～103.81%和85.69%～113.29%，均在80%～125%內(nèi)，說明2種制劑間生物等效。

2.4 安全性評價

24只受試雞在試驗(yàn)過程中均未發(fā)生不良事件，全部完成2周期采血試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后24只受試雞的身體狀況均良好，因此按0.067 mg/kg的劑量給藥時2種制劑對雞的生長發(fā)育沒有不良影響。

3 討論

該研究采用液質(zhì)聯(lián)用法測定雞血漿中氟苯尼考的含量，與其他文獻(xiàn)報道采用的氣相色譜法 [11]和液相色譜法 [12-13]相比靈敏度高、樣品前處理簡單、分析時間短，且方法驗(yàn)證結(jié)果表明采用該方法可以準(zhǔn)確檢測雞血漿中氟苯尼考的含量。

藥動學(xué)參數(shù)分析表明參比制劑和受試制劑均在1 h內(nèi)達(dá)到吸收峰值，5 h左右達(dá)到半衰期，比沈建忠等 [14]報道的氟苯尼考肌注半衰期長2 h左右。這可能是由于動物品種、體重、合成工藝和制劑中輔料的不同造成的。從氟苯尼考的藥動學(xué)參數(shù)來看，該研究中2種氟苯尼考制劑在雞體內(nèi)的持續(xù)時間更長。

2種生物等效性評價方法均證明2種氟苯尼考注射液制劑具有生物等效性，且給藥期間受試雞未發(fā)生不良事件，因此這2種制劑在獸藥臨床上可以替代使用。

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