發(fā)酵乳桿菌LFQ153胞外多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

劉聰秀，宋佳佳，王洪偉，張玉，索化夷

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到不良刺激時(shí)，產(chǎn)生的過量自由基超出細(xì)胞抗氧化防御能力，造成機(jī)體氧化與抗氧化作用失衡的現(xiàn)象[1]。持續(xù)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和DNA損傷，引發(fā)炎癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病[2]。其中，炎癥與氧化應(yīng)激密不可分，氧化應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生過量活性氧，激活免疫細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[3]；同時(shí)炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)大量自由基釋放，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激[4]。因此，緩解氧化性損傷對(duì)維持機(jī)體健康具有重要意義。

已有研究表明，多糖可通過清除活性氧自由基，提高抗氧化物酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生等途徑起到抗炎抗氧化作用。例如，黨參多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用[5]，羊肚菌多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用[3]。除植物多糖和真菌多糖外，乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)由于具有生產(chǎn)周期短、成本低和易于控制等優(yōu)勢，也受到越來越多關(guān)注。乳酸菌 EPS是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的天然高分子聚合物，通常由一種或多種不同類型的單糖組成，可保護(hù)細(xì)胞免受干燥脫水、抗生素或有毒物質(zhì)等外界不良影響[6]。研究證實(shí)，乳酸菌EPS具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和降糖降脂等生物學(xué)活性[7]。如HU等[8]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌ZFM231的EPS具有顯著降血脂、降膽固醇活性和自由基清除能力；SIRIN等[9]的研究表明，保加利亞乳桿菌B3和植物乳桿菌GD2的EPS可緩解淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y氧化應(yīng)激，預(yù)防阿爾茨海默病。

我國乳酸菌發(fā)酵食品資源豐富，已有學(xué)者從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出產(chǎn)EPS的乳酸菌，并研究乳酸菌EPS的生物活性，如LIU等[10]發(fā)現(xiàn)從四川泡菜中分離到的植物乳桿菌HY，其產(chǎn)生的EPS具有較強(qiáng)抗氧化能力。本研究從青海西寧市手工酸奶中分離得到1株產(chǎn)EPS且胃腸抗性較好的發(fā)酵乳桿菌LFQ153，其EPS對(duì)氧化損傷的緩解作用尚不清楚。因此，本研究首先通過DPPH自由基和羥自由基清除實(shí)驗(yàn)考察EPS的體外抗氧化水平，進(jìn)而基于氧化損傷的RAW264.7巨噬細(xì)胞，從抗氧化酶活性、炎癥因子表達(dá)以及核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)/核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路等角度，研究EPS對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用與機(jī)制，旨在為功能性乳酸菌胞外多糖的開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

發(fā)酵乳桿菌LFQ153，本課題組分離自青海西寧市手工酸奶；RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

濃 H2SO4、苯酚、FeSO4、30% H2O2、95%乙醇、無水乙醇、三氯乙酸、三氯甲烷、異丙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司；DPPH、1，10-菲啰啉、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，Sigma-Aldrich 試劑公司；MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液，美國 Gibco 公司；非必需氨基酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑，北京索萊寶科技有限公司；Griess 試劑盒、BCA試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、細(xì)胞裂解液，碧云天生物技術(shù)研究所；過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒、PCR 引物設(shè)計(jì)和合成，美國 Thermo公司；SYBR Green RCR Master Mix，翌圣生物科技有限公司。本研究采用的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch2型多功能酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國 Eppendorf 公司；CFX96 Touch型熒光定量 PCR 儀，美國 Bio-rad 公司；P100K200型超微量核酸蛋白測定儀，美國Pultton公司；371型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳桿菌LFQ153胞外多糖的制備

將發(fā)酵乳桿菌LFQ153接入MRS液體培養(yǎng)基活化后，以2%的比例接種擴(kuò)大培養(yǎng)。37 ℃厭氧培養(yǎng) 48 h后，取培養(yǎng)液于4 ℃下4 000 r/min離心15 min去除菌體，收集上清液，沸水浴10 min使分解多糖的酶類失活。冷卻至室溫，50 ℃減壓濃縮至原體積的1/4，加入三氯乙酸至質(zhì)量濃度40 g/L,4 ℃靜置8 h，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min去除蛋白質(zhì)沉淀。加入3倍體積的預(yù)冷95% (體積分?jǐn)?shù))乙醇，4 ℃靜置8 h，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min得到粗多糖沉淀。將粗多糖沉淀溶于60 ℃蒸餾水中，10 000 r/min離心10 min去除底部不溶沉淀，然后將上清液裝入截留分子質(zhì)量為8～14 kDa的透析袋內(nèi)，每隔6～8 h換1次水，連續(xù)透析2 d。收集透析袋內(nèi)多糖溶液，真空冷凍干燥制得粗多糖。

采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱(21 mm×135 mm)初步純化粗多糖，取200 mg粗多糖溶于20 mL去離子水，過0.22 μm濾膜后加入DEAE Sepharose Fast Flow柱，用去離子水、0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl 溶液以流速4 mL/min梯度洗脫，6 mL/管收集洗脫液，苯酚硫酸法[11]跟蹤檢測洗脫液，收集主峰組分，濃縮透析并冷凍干燥。采用Superdex 200凝膠柱(10 mm×240 mm)進(jìn)一步純化，取多糖干粉溶于去離子水配成10 mg/mL的溶液，過0.22 μm濾膜后用去離子水以流速1 mL/min洗脫，3 mL/管收集洗脫液，苯酚硫酸法跟蹤檢測，收集洗脫峰，濃縮后冷凍干燥，得到純化多糖EPS，根據(jù)苯酚硫酸法測得EPS總糖含量為(91.70±0.82)%。

1.3.2 EPS的體外抗氧化活性

1.3.2.1 DPPH自由基清除作用

參照CHEN等[12]的實(shí)驗(yàn)方法，分別吸取 1 mL不同質(zhì)量濃度的EPS樣品(1～5 mg/mL)于試管中，加入 1 mL 現(xiàn)配的 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻。室溫避光反應(yīng) 30 min后于517 nm 處測定OD值，DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為多糖樣品的OD值；A0為乙醇溶液代替DPPH溶液的OD值；A2為去離子水代替多糖樣品的OD值。

1.3.2.2 羥自由基清除作用

參照CHEN等[12]的實(shí)驗(yàn)方法，分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的EPS樣品(1～5 mg/mL)于試管中，依次向管中加入各1 mL 的0.75 mmol/L 1，10-菲啰啉、0.75 mmol/L FeSO4、0.01%(體積分?jǐn)?shù))H2O2和0.15 mol/L pH 7.4的磷酸鈉緩沖液，混勻后于37 ℃反應(yīng)1 h，測定混合液在536 nm處的OD值，羥自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為多糖樣品的OD值；A2為去離子水代替多糖樣品的OD值；A0為去離子水代替多糖樣品和 H2O2的OD值。

1.3.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素和1%非必需氨基酸)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)80%，用 0.25%胰酶消化細(xì)胞獲得細(xì)胞懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的測定

調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)/mL，以100 μL/孔接種于 96 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入100 μL含不同質(zhì)量濃度EPS(62.5、125、250、500 μg/mL)的DMEM完全培養(yǎng)基，以無 EPS的相同培養(yǎng)基為正常對(duì)照，只加完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h后每孔加10 μL MTT溶液于 37 ℃避光孵育，4 h后吸掉上清液，加入150 μL DMSO振搖15 min，于490 nm處測定OD值，細(xì)胞活力計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為空白對(duì)照組 OD 值；Ac為正常對(duì)照組 OD 值；As為實(shí)驗(yàn)組OD值。

1.3.3.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量的測定

RAW264.7巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃培養(yǎng)過夜后棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌1遍后，對(duì)照組和LPS組加入完全培養(yǎng)基，EPS組分別加入含不同質(zhì)量濃度EPS(125、250、 500 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中孵育2 h后，向LPS組和EPS組每孔加入10 μL的10 μg/mL LPS(使培養(yǎng)基中LPS終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)22 h后，取 50 μL上清液至96 孔板，加入 50 μL Griess試劑 A和試劑 B，在540 nm 處測定各孔 OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每組NO含量。

1.3.3.4 RAW264.7巨噬細(xì)胞中抗氧化酶活性和MDA含量的測定

RAW264.7 巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板， 37 ℃培養(yǎng)過夜后棄去培養(yǎng)液，分組及處理同 1.3.3.3。培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，預(yù)冷PBS洗滌2次，每孔加入 200 μL 細(xì)胞裂解液，冰上反復(fù)吹打，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min收集各組細(xì)胞上清液。根據(jù)BCA 試劑盒說明書測定各組細(xì)胞蛋白濃度， CAT、SOD、GSH-Px和MDA的檢測均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.3.5 RAW264.7巨噬細(xì)胞中氧化損傷相關(guān)基因表達(dá)的測定

RAW264.7 巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于6孔板，分組及處理同 1.3.3.3。培養(yǎng)結(jié)束后，按照臧中昊[13]的方法裂解細(xì)胞提取總 RNA，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA試劑盒合成cDNA，體系反應(yīng) 37 ℃ 30 min、95 ℃ 5 min后，用 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)，引物見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA含量。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.3.4 EPS的單糖組成分析

參考WANG等[14]的方法采用離子色譜儀分析EPS的單糖組成，并稍作修改：采用CarboPac PA20 色譜柱(3 mm×150 mm)，脈沖安培檢測器，流動(dòng)相為H2O、15 mmol/L NaOH 和 100 mmol/L NaOAc，以進(jìn)樣量5 μL、流速0.3 mL/min進(jìn)行洗脫。配制10 mg/mL單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，包括巖藻糖、鹽酸氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、木糖、甘露糖和核糖。配制多糖溶液，取 10 mg EPS于安瓿瓶中，加入 10 mL 的3 mol/L三氟乙酸，120 ℃烘箱水解 3 h，待水解液冷卻后，氮?dú)?65 ℃)吹干，重復(fù)3次加入甲醇 3 mL用氮?dú)獯蹈梢猿M三氟乙酸，再加入5 mL去離子水溶解多糖酸水解產(chǎn)物，稀釋10倍后12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS的體外抗氧化活性

由圖1可知，在1～5 mg/mL內(nèi)，DPPH自由基和羥自由基的清除率隨EPS質(zhì)量濃度的增加而增加，存在劑量依賴關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，EPS對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率分別為(64.19±1.03)%和(61.87±3.09)%。

與本研究相似，植物乳桿菌CNPC003胞外多糖在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率為51.52%[15]；發(fā)酵乳桿菌S1胞外多糖在質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時(shí)對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率分別為60.50%和61.67%[14]。在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，乳酸菌EPS通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除自由基能力，推測可能是多糖碳?xì)滏溕系臍湓咏Y(jié)合羥自由基生成水，從而達(dá)到清除羥自由基效果[16]。此外，多糖大分子自身具有的空間結(jié)構(gòu)可對(duì)DPPH自由基或羥自由基產(chǎn)生包合作用，從而抑制自由基反應(yīng)[17]。

a-DPPH自由基清除率；b-羥自由基清除率圖1 EPS對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除活性的影響Fig.1 Effect of EPS on DPPH and hydroxyl radical activity

2.2 EPS對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，質(zhì)量濃度為62.5～500 μg/mL的 EPS 作用細(xì)胞 24 h 后，與對(duì)照組相比，各組細(xì)胞活力沒有差異(P>0.05)，表明EPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞無毒性作用。因此，本研究選取125、250、500 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 EPS 對(duì) RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of EPS on the viability of RAW264.7 macrophages

2.3 EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞中抗氧化酶活力和MDA含量的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，LPS處理使細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT 和 GSH-Px的活力顯著下降，MDA 含量顯著增加(P<0.05)，表明LPS可使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。與LPS損傷組相比，經(jīng)EPS處理后細(xì)胞中SOD、CAT 和 GSH-Px 的活力均有所提升，而MDA的含量呈下降趨勢(P<0.05)。并且，3種抗氧化活力與EPS劑量呈正相關(guān)，而MDA的含量與EPS劑量呈負(fù)相關(guān)，這表明隨EPS濃度增加，細(xì)胞抗氧化酶活力提高，自由基清除能力增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化物減少，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷減輕。

2.4 EPS對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞 中NO含量和炎癥基因表達(dá)的影響

根據(jù)圖4結(jié)果，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞中NO含量、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；與LPS處理組相比，經(jīng)不同濃度的EPS干預(yù)后，細(xì)胞中NO 含量、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量均明顯下降(P<0.05)，而且，這種降低作用與EPS的劑量呈濃度依賴性關(guān)系。上述結(jié)果表明，EPS可通過降低NO含量和抑制炎癥基因表達(dá)，緩解LPS引起的細(xì)胞炎癥損傷。

2.5 EPS對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制

為進(jìn)一步研究EPS保護(hù)RAW264.7 細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制，本研究采用RT-PCR檢測Nrf2/HO-1/NF-κB 通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。如圖5所示，與對(duì)照組相比，LPS刺激使RAW264.7巨噬細(xì)胞中Nrf2、HO-1和IκB-α的mRNA表達(dá)顯著下降，而NF-κB的mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05)；與LPS處理組相比，EPS的干預(yù)不僅顯著上調(diào)了Nrf2、HO-1和IκB-α的mRNA表達(dá)水平，還顯著下調(diào)了NF-κB的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。RAW264.7 巨噬細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1和IκB-α的mRNA表達(dá)量與EPS劑量呈正相關(guān)，而NF-κB的mRNA表達(dá)量與EPS劑量呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制，可能與EPS激活Nrf2/HO-1通路，并抑制NF-κB通路有關(guān)。

a-SOD活力；b-CAT活力；c-GSH-Px活力；d-MDA含量圖3 EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞中抗氧化酶活力和MDA含量的影響Fig.3 Effects of EPS on antioxidant enzymes activity and MDA content in RAW264.7 macrophages 注：與對(duì)照組相比，#表示P<0.05；與LPS損傷組相比，*表示P<0.05 (下同)

a-NO含量；b-iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量圖4 EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量和炎癥 基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of EPS on NO content and inflammatory genes expression in RAW264.7 macrophages

a-Nrf2和HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量；b-NF-κB和IκB-α的 mRNA相對(duì)表達(dá)量圖5 EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞中Nrf2/HO-1/NF-κB 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of EPS on the expression of Nrf2/HO-1/NF-κB signaling-related genes in RAW264.7 macrophages

2.6 EPS的單糖組成

圖6為單糖標(biāo)準(zhǔn)品(圖6-a)和 EPS(圖6-b)的離子色譜圖。結(jié)合圖6-a和圖6-b可知，EPS由鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，摩爾比為2.48∶10.26∶50.22∶8.16。

乳酸菌胞外多糖通常由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖及少量糖單元衍生物組成[10]。半乳糖、葡萄糖和甘露糖均含有醛基，容易被自由基氧化降解，使多糖具有抗氧化活性[18]。并且，多糖的抗氧化活性與葡萄糖、甘露糖含量呈顯著正相關(guān)[19]。與本研究相似，瑞士乳桿菌MB2-1的胞外多糖由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均有較強(qiáng)清除作用[20]；動(dòng)物雙歧桿菌RH的胞外多糖主要由摩爾比為43∶34∶18∶4∶1∶1的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖和鼠李糖組成，在抗氧化實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基和超氧陰離子自由基清除活性[21]。由此推斷，本研究中EPS的抗氧化活性與半乳糖、葡萄糖和甘露糖的存在及比例有關(guān)。

1-巖藻糖;2-鹽酸氨基半乳糖;3-鼠李糖;4-阿拉伯糖; 5-鹽酸氨基葡萄糖;6-半乳糖;7-葡萄糖;8-N-乙酰-D-氨基葡萄糖; 9-木糖;10-甘露糖;11-核糖 a-單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖；b-EPS的離子色譜圖圖6 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和 EPS離子色譜圖Fig.6 The ion chromatograms of monosaccharides standard and EPS

3 結(jié)論與討論

巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞，在機(jī)體受到病理刺激時(shí)發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，消除外界應(yīng)激源或誘導(dǎo)劑造成的不良影響。LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，具有毒性，可促使巨噬細(xì)胞分化產(chǎn)生炎癥介質(zhì)(如NO)和細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)，常用于研究氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立氧化損傷模型，研究EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

已有研究證明，抗氧化酶活力的高低和MDA的水平可反映細(xì)胞氧化損傷的程度[22]?？寡趸窼OD、CAT和GSH-Px 是細(xì)胞抗氧化防御體系中的重要組成部分，可通過清除體內(nèi)的過量自由基和脂類過氧化物，保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而減輕細(xì)胞氧化損傷[23]；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，它具有細(xì)胞毒性，可誘使蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚合，使細(xì)胞出現(xiàn)異常分裂和癌變，最終導(dǎo)致細(xì)胞退化、引發(fā)疾病[24]。本實(shí)驗(yàn)中，EPS顯著提高RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性，并降低MDA含量，表明EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用。炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，LPS刺激可使RAW264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量活性氧及炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo) iNOS 高度表達(dá)[13]。iNOS 是NO的上游激酶，通過調(diào)控NO的合成參與炎癥反應(yīng)[25]。NO是炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的促炎因子，過量的NO可導(dǎo)致DNA損傷，誘導(dǎo)凋亡和氧化應(yīng)激，最終加劇機(jī)體炎癥，其分泌量可間接反映炎癥程度[26-27]。TNF-α產(chǎn)生于炎癥初期，它能刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子(如IL-1β和IL-6)，使機(jī)體發(fā)生炎癥，增加誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和炎癥性腸病的風(fēng)險(xiǎn)[26, 28]。本研究中，EPS降低了RAW264.7 巨噬細(xì)胞內(nèi)NO含量，并抑制了TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)，表明EPS對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

Nrf2是調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，一方面，它通過激活SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶增強(qiáng)組織抗氧化能力[22]；另一方面，其可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，HO-1能有效清除自由基，通過激活抗凋亡蛋白抑制過氧化反應(yīng)[29]。正常情況下，NF-κB和IκB-α以復(fù)合物形式存在于細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，IκB-α發(fā)生磷酸化與降解，使NF-κB解離并被激活，進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，引起炎癥反應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)EPS處理后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1和IκB-α的mRNA表達(dá)量均上升，而NF-κB的mRNA表達(dá)量下降，提示EPS的抗炎抗氧化作用可能與Nrf2/HO-1/NF-κB通路有關(guān)，這與前人的研究結(jié)果一致[30]。

上述分析表明，發(fā)酵乳桿菌LFQ153EPS能夠有效緩解LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷，并且這種保護(hù)作用可能與與Nrf2/HO-1/NF-κB通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，對(duì)EPS的單糖分析表明，EPS的抗氧化活性還與半乳糖、葡萄糖和甘露糖的存在及比例有關(guān)。綜上，本研究可為功能性發(fā)酵乳桿菌LFQ153胞外多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。