不同級(jí)別子宮頸病變與lncRNA HOTTIP和H19單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系研究

王春桃，葛安興，吳紅雁，張學(xué)艷，楊 圣，袁紅香，程艷萍，馮延璐，陸欣苑，梁戈玉

1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇 鹽城 224001；2.環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.鹽城市第一人民醫(yī)院放療科，江蘇 鹽城 224001

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球女性中排名第四［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有50萬新病例，大多發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［2］。子宮頸癌的發(fā)生是經(jīng)過宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）到子宮頸癌兩個(gè)階段的多因素多步驟長(zhǎng)期共同作用的過程，是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果［3］。盡管子宮頸癌的診斷和治療已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但晚期復(fù)發(fā)、耐藥等導(dǎo)致子宮頸癌患者的死亡率仍然較高［4］。因此，進(jìn)一步探索子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）具有眾多生物學(xué)功能，通過調(diào)控不同層面基因表達(dá)，參與多種腫瘤的形成［5-7］。HOTTIP 是從HOXA族5′遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄的一類lncRNA，位于染色體7p15.2位點(diǎn)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遷移過程中發(fā)展重要的調(diào)控作用［8］。H19是人類最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA，是一種母系胚胎基因，位于人類染色體11 p15.5，全長(zhǎng)2.3 kb，具有高度保守性和同源性，在正常成人組織中通常表達(dá)下調(diào)，但在癌組織中高表達(dá)［9］。lncRNA HOTTIP和H19的差異性表達(dá)均參與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展［10-11］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為基因組中最廣泛的序列遺傳變異類型，具有遺傳數(shù)量大、分布廣、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，是公認(rèn)的“第三代基因遺傳標(biāo)記”，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［12］。

近年來，研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，lncRNA的SNP在腫瘤的易感性和干預(yù)腫瘤發(fā)展及預(yù)后機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤的生物標(biāo)志物。目前，HOTTIP rs2067087、H19 rs2839698和H19 rs2107425的SNP與子宮頸病變易感性的相關(guān)性研究較少。本研究選取HOTTIP rs2067087、H19 rs2839698和H19 rs2107425，結(jié)合研究對(duì)象的臨床資料，分析它們與不同級(jí)別子宮頸病變患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，旨在為子宮頸癌的預(yù)防和診斷提供參考。

1 資料和方法

1.1 調(diào)查對(duì)象

選擇2018年11月—2020年12月江蘇鹽城市第一人民醫(yī)院子宮頸病變患者345例作為子宮頸病變組，入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診子宮頸病變，未經(jīng)過放療及化療，無腫瘤史，有相關(guān)的臨床信息者。子宮頸病變組年齡28 ～ 75歲。另收集360例同期住院的無宮頸疾病的非腫瘤患者為健康對(duì)照，年齡16～89歲。本研究經(jīng)患者知情同意自愿進(jìn)行，所有研究對(duì)象均知曉并簽署了知情同意書，并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 基因分型檢測(cè)

抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，用EDTA-2Na抗凝管收集，使用全血基因組DNA試劑盒（美國(guó)Promega公司）提取全血DNA，操作嚴(yán)格按照說明書步驟要求，存放于-80 ℃冰箱保存。采用NanoDrop 1000型紫外分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)） 測(cè)定DNA濃度和純度。采用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行基因分型，HOTTIPrs2067087上游引物：5′-CCTCCAAGTGGCATTGTAAAACT-3′，下游引物：5′-CCAGTATGTAAAACCGCCTTCAA-3′；H19 rs2839698上游引物：5′-TAACCAAAAG TGACCGGGATGAAT-3′，反向引物：5′-TGG AGGGGCTAGCTCGAG-3′；H19 rs2107425下游引物：5′-TTCGCCCGTGGAAACGT-3′，下游引物：5′-GATAATGCCCGACCTGAAGATC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL反應(yīng)混合液，PCR條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 30 s。隨機(jī)抽取8%的樣本進(jìn)行兩次分型，以確?；蚍中偷臏?zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 23.0軟件。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料。健康對(duì)照組實(shí)際頻數(shù)與預(yù)計(jì)頻數(shù)之間的偏差采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；子宮頸病變組和健康對(duì)照組的HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698及rs2107425等位基因頻率和基因型分布通過χ2檢驗(yàn)比較；3個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與子宮頸病變之間的關(guān)聯(lián)性應(yīng)用非條件logistic回歸分析，以比值比（odds ratio，OR）及95% CI評(píng)估相對(duì)危險(xiǎn)度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)查對(duì)象的基本特征

本研究共納入子宮頸病變患者345例，平均年齡（49.6±9.8）歲，其中，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者220例，按臨床分期分類發(fā)現(xiàn)，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）66例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）154例。子宮頸癌患者125例，按病理學(xué)類型分為鱗癌患者103例，腺癌患者22例；按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）（2018）臨床分期分為Ⅰ期41 例，Ⅱ期84例。對(duì)照組360例，平均（50.3±14.0）歲。均為漢族女性，兩組年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425位點(diǎn)基因分型結(jié)果

HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425的SNP基因分型結(jié)果是由該樣本的SNP區(qū)段擴(kuò)增測(cè)序后總reads數(shù)中等位基因頻度或等位基因比例所決定的（圖1）。HOTTIPrs2067087擴(kuò)增測(cè)序總reads數(shù)中，C的頻度0.8以上，則該樣本的基因型判定為野生基因CC型；C的頻度0.2以下，對(duì)應(yīng)的等位基因G的頻度在0.8以上，則該樣本判定為純合突變基因GG型；C的頻度0.2～0.8，對(duì)應(yīng)的等位基因G的頻度從0.8至0.2之間，則該樣本判定為雜合突變基因CG型。同樣的原理得到H19 rs2839698和rs2107425的基因分型，具體分型如下：H19 rs2839698分型為野生基因CC型、雜合突變基因CT型和純合突變基因TT型；H19 rs2107425分型為野生基因CC 型、雜合突變基因CT型和純合突變基因TT型。

圖1 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425等位基因頻度Fig.1 Genotyping of HOTTIP rs2067087，H19 rs2839698 and H19 rs2107425

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

HOTTIPrs2067087在健康對(duì)照組中基因型頻率分別是CC基因型（36.9%），CG基因型（49.2%）和GG基因型（13.9%）；H19 rs2839698分別是CC基因型（54.2%），CT基因型（38.1%）和TT基因型（7.8%）；H19 rs2107425的3種基因型頻率分別為CC基因型（33.3%）、CT基因型（46.7%）和TT基因型（20.0%）。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示P＞0.05，表明基因型分布頻率具有群體代表性（表1）。

表1 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425多態(tài)性位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.1 Hardy-Weinberg genetic balance test of HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,and H19 rs2107425 polymorphism

2.4 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425 SNP與子宮頸病變的關(guān)系

HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型及等位基因頻率在子宮頸病變組和健康對(duì)照組中的分布見表2。結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比，HOTTIPrs2067087的GG基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在隱性模型中，與CC+CG基因型相比，GG基因型患者發(fā)生子宮頸病變的頻率顯著增加 （OR=1.522，95% CI：1.021 ～ 2.269，P=0.039）。與C等位基因相比，G等位基因在子宮頸病變組中的頻率明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.252，95% CI：1.012 ～ 1.549，P=0.038）。研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)H19 rs2839698、rs2107425與子宮頸病變之間具有相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 子宮頸病變組與健康對(duì)照組基因型及等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotype and allele frequency in cervical lesion group and healthy control group

2.5 不同年齡HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布情況

分析不同年齡HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與子宮頸病變的關(guān)系，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與不同年齡組的子宮頸病變具有相關(guān)性（表3）。

表3 不同年齡HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與宮頸病變相關(guān)性Tab.3 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 and cervical lesions at different ages

2.6 不同級(jí)別子宮頸病變中HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布情況

將子宮頸病變組進(jìn)一步分為CIN組和子宮頸癌組，分別分析3個(gè)SNP位點(diǎn)與CIN組、子宮頸癌組發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，CIN組的HOTTIPrs2067087 GG基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CIN組中，與CC+CG基因型相比，GG基因型發(fā)生CIN的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（OR=1.730，95% CI：1.117-2.680）。在H19 rs2839698的子宮頸癌組的隱性模型中，與CC+CT型相比，TT基因型患者發(fā)生子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.292，95% CI：0.087 ～ 0.976，P=0.046）。此外，未發(fā)現(xiàn)H19 rs2107425基因型及等位基因與子宮頸癌及CIN具有相關(guān)性（表4）。

表4 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型及等位基因在CIN組、宮頸癌組及健康對(duì)照組中的分布Tab.4 Distribution of genotype and allele frequency of HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 among CIN group,cervical cancer group and control group

2.7 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與子宮頸癌臨床進(jìn)展的相關(guān)性

2.7.1 不同病理學(xué)類型分層分析

分析不同病理類型的子宮頸癌患者HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425基因型分布頻率，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與不同病理學(xué)類型子宮頸癌相關(guān)（P＞0.05，表5）。

表5 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與不同病理類型的宮頸癌的相關(guān)性Tab.5 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,rs2107425 and different pathological types of cervical cancer

2.7.2 不同臨床分期分層分析

分析HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與子宮頸癌臨床分期的相關(guān)性，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)HOTTIPrs2067087和H19 rs2839698、rs2107425與子宮頸癌分期具有相關(guān)性（P＞0.05，表6）。

表6 HOTTIP rs2067087和H19 rs2839698 s2107425與不同臨床分期的宮頸癌的相關(guān)性Tab.6 Correlation between HOTTIP rs2067087,H19 rs2839698,H19 rs2107425 and cervical cancer of different clinical stages

3 討 論

子宮頸癌是多因素、多步驟導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。尋找潛在的診斷和預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)提高子宮頸癌患者的生存率具有重要意義。LncRNA被發(fā)現(xiàn)參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種機(jī)體調(diào)節(jié)過程，并與多種腫瘤密切相關(guān)［15］。SNP作為最常見的基因突變類型，在子宮頸癌的遺傳易感性中起重要作用［16］。本研究收集了705名研究對(duì)象，包括345例子宮頸病變者和360名健康對(duì)照的血液標(biāo)本及相關(guān)臨床信息，旨在探討HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698及H19 rs2107425基因多態(tài)性與子宮頸癌易感性的關(guān)系。

HOTTIP作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，與人類多種腫瘤的易感性、生長(zhǎng)、增殖及預(yù)后密切相關(guān)［17-18］。然而，目前關(guān)于HOTTIP基因多態(tài)性與腫瘤易感性的研究較少。Wang等［14］研究lncRNA HOTTIP SNP與胃癌風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HOTTIPrs2067087的GC+GG基因型使胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.35倍，攜帶CC基因型的女性更易患胃癌，提示rs2067087基因型可能是胃癌篩查中一項(xiàng)具有潛在有意義的檢測(cè)，尤其是對(duì)女性而言。該研究團(tuán)隊(duì)在先前的研究［18］中也發(fā)現(xiàn)，HOTTIPrs2067087的SNP能使肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.20倍，提示HOTTIPSNP可能作為肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的生物標(biāo)志物。Lv等［19］分析發(fā)現(xiàn)，與GG基因型相比，攜帶HOTTIPrs2067087的CC基因型患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)提高了1.7倍，但未發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌患者總生存期之間的關(guān)聯(lián)。本研究首次進(jìn)行HOTTIPrs2067087與子宮頸病變及臨床特征關(guān)系的研究，結(jié)果表明，GG基因型攜帶者可增加子宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的GG基因型主要增加了CIN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示該位點(diǎn)的GG基因型可作為CIN的早期篩查及診斷依據(jù)。同時(shí)，未發(fā)現(xiàn)HOTTIPrs2067087與子宮頸癌病理學(xué)類型、臨床分期相關(guān)。

H19是lncRNA中的一員，參與哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育，其表達(dá)量在組織器官成熟后逐漸下調(diào)。lncRNA H19表達(dá)在多種惡性腫瘤組織中重新上調(diào)，對(duì)于腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用［17］。近年來研究［10，20］發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，H19基因多態(tài)性也可能與腫瘤易感性相關(guān)。目前已有關(guān)于H19 rs2839698 SNP與腫瘤易感性的相關(guān)報(bào)道。Yang等［21］的研究也發(fā)現(xiàn)，rs2839698 T等位基因攜帶者及CT+TT基因型的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，rs2839698 CT+TT基因型與H19 mRNA的高表達(dá)顯著相關(guān)。Wu等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，H19 rs2839698 T等位基因使肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加29.1%。Liu等［23］的meta分析發(fā)現(xiàn)，無論是亞洲人群還是高加索人群，H19 rs2839698多態(tài)性都與癌癥易感性顯著相關(guān)。另有研究［24］表明，H19 rs2839698多態(tài)性降低了中國(guó)漢族人群結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在不吸煙、不飲酒、年齡≥60歲的人和超重的人（BMI≥24）中。但是，Hashemi等［25］進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析未發(fā)現(xiàn)H19 rs2839698 G＞ A基因多態(tài)性與總癌癥風(fēng)險(xiǎn)有顯著相關(guān)性。H19 rs2839698與子宮頸病變的相關(guān)文獻(xiàn)較少，Huang等［26］關(guān)于H19 rs2839698多態(tài)性與子宮頸癌易感性的研究顯示，雖然H19 rs2839698 TT與子宮頸癌的一些較差的臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)，但不能可靠地預(yù)測(cè)患者的存活率。本研究探索了H19 rs2839698 SNP與子宮頸病變組發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床進(jìn)展之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CC+CT型相比，H19 rs2839698的TT基因型發(fā)生子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)減少了70.8%。本研究人群位于中國(guó)大陸中部地區(qū)，研究對(duì)象間存在地域差異，行為生活方式也不盡相同，可能導(dǎo)致子宮頸癌易感性的差異。

目前關(guān)于H19 rs2107425 SNP與腫瘤易感性的研究結(jié)論并不一致。Liu等［23］進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析發(fā)現(xiàn)，H19 rs2107425與亞洲人的癌癥易感性增加有關(guān)；而與高加索人群的癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。Wang等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，H19 rs2107425 CT+TT基因型與表皮生長(zhǎng)因子受體野生型肺腺癌患者的腫瘤進(jìn)展?fàn)顟B(tài)相關(guān)。Wu等［22］對(duì)359例肝細(xì)胞癌患者和1 190名對(duì)照進(jìn)行的研究表明，H19 rs2107425 TT基因型與肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低相關(guān)。Yang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶H19 rs2107425 CT+TT基因型的尿路上皮細(xì)胞癌患者發(fā)生肌肉浸潤(rùn)性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)較高，進(jìn)一步的臨床分析發(fā)現(xiàn)，rs2107425 CT+TT基因型與年齡大于65歲的尿路上皮細(xì)胞癌患者較差的疾病特異性生存率相關(guān)。H19與子宮頸病變關(guān)系的研究較少，Huang等［28］對(duì)134例浸潤(rùn)性子宮頸癌患者、101例CIN患者和325名對(duì)照者進(jìn)行研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)H19 rs2107425基因多態(tài)性與子宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本研究探索了H19 rs2107425 SNP與子宮頸病變（子宮頸癌及CIN）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)H19 rs2107425 SNP與子宮頸病變易感性及臨床進(jìn)展之間的關(guān)系，與上述Huang等［28］的結(jié)論一致。

綜上所述，通過病例對(duì)照研究，本研究結(jié)果表明HOTTIPrs2067087 GG基因型與中國(guó)漢族人群子宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)病變?cè)黾语@著相關(guān)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，主要與CIN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，GG基因型攜帶者CIN的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加了73.0%。而H19 rs2839698與子宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，TT基因型攜帶者發(fā)生子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)減少了70.8%。未發(fā)現(xiàn)H19 rs2107425與子宮頸癌及CIN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)HOTTIPrs2067087、H19 rs2839698 和H19 rs2107425基因多態(tài)性與子宮頸癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。