用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的機制

高 豐,陳 瑩,戴子琦,郭慧娟,吳倩文,陳紅珊,亓金釵,李 桐,陳可點,王亞欣,崔鶴蓉,王鵬龍,杜 菁*,徐 冰*,雷海民*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 102488;2.北京同仁堂科技發(fā)展有限公司,北京 100062

由SARS-Co V-2病毒引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19,COVID-19）對人類健康及經(jīng)濟構(gòu)成嚴重威脅。其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力,繼而可發(fā)展為呼吸衰竭、膿毒血癥等直接危及患者生命[1]。

中醫(yī)認為COVID-19 屬疫病范疇,主要是由于寒濕疫毒之邪從口鼻而入,寒濕邪氣侵襲肺臟所致[2],在臨床治療中清肺排毒湯、宣肺敗毒方等傳統(tǒng)方劑具有很好的療效。防風(fēng)通圣丸原方出自《黃帝素問宣明論方》,被列入國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（試行第5版）,由麻黃、荊芥穗、防風(fēng)、薄荷、大黃、芒硝、滑石、梔子、石膏、黃芩、連翹、桔梗、當歸、白芍、川芎、白術(shù)（炒）和甘草組成,具有解表通里、清熱解毒的功效,臨床常用于蕁麻疹、哮喘、肺炎和感冒的治療。

本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)挖掘防風(fēng)通圣丸中的有效成分、潛在作用靶點及作用機制,以期為臨床治療COVID-19提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 防風(fēng)通圣丸中主要成分及靶標蛋白的篩選

用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及在線分析平臺（traditional Chinese medicine system pharmacology database and online analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）收集防風(fēng)、荊芥穗、薄荷、麻黃、大黃、梔子、桔梗、川芎、當歸、黃芩、連翹、甘草、白芍和白術(shù)的主要活性成分。以口服利用度（oral bioavailability,OB）值≥30%和類藥性（drug-likeness,DL）值≥0.18為篩選條件,篩選出候選的活性成分。為避免個別認可度較高的有效成分被剔除,通過查閱《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）（2020版）得到此類成分并合并至TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果中,同時獲取化合物對應(yīng)的靶標蛋白,在TCMSP 未查詢到成分的靶標蛋白應(yīng)用Swisstarget（http://swisstargetprediction.ch/）進行預(yù)測。

1.2 靶標蛋白基因名的確定

在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中查找所有靶標的基因名,并將查詢到的靶標蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因簡稱。

1.3 COVID-19相關(guān)靶標的獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞進行搜索,收集得到與COVID-19相關(guān)的作用靶點。應(yīng)用Venny 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將防風(fēng)通圣丸有效成分的靶標蛋白與COVID-19的疾病靶點進行映射,得到防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的交集靶點。

1.4 藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò)的建立

將防風(fēng)通圣丸藥物、活性成分、交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,構(gòu)建防風(fēng)通圣丸藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò),對其進行拓撲分析后以節(jié)點連接度（Degree）及介度（Betweenness）≥2 倍中位數(shù)且緊密度（Closeness）≥1倍中位數(shù)為篩選條件,得到活性成分及有效靶點。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.4 項下得到的有效靶點導(dǎo)入String 平臺（https://string-db.org/）,限定物種為“Homo sapiens”,將篩選后的結(jié)果保存為“TSV”格式,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 KEGG 和GO富集分析

對得到的有效靶點利用DAVID 平臺（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO 和KEGG 富集分析,分析靶點涉及的基因功能及相應(yīng)的信號通路,并利用R語言將其可視化。

1.7 分子對接

選擇藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中篩選出的有效成分與COVID-19 關(guān)鍵靶點SARS-Co V-2 3CL 水解酶[3]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（ACE2）[4]進行分子對接,并將目前臨床用于治療COVID-19的化學(xué)藥利巴韋林、利托那韋、洛匹那韋、磷酸氯喹和阿比多爾作為陽性對照。首先,從RCSB 蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中獲得SARS-Co V-2 3CL水解酶（PDB ID:6LU7）和ACE2（PDB ID:1R42）的三維結(jié)構(gòu),導(dǎo)入AutoDock 4.2.6進行除水等操作,保存為“PDBQT”格式。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載化合物結(jié)構(gòu)“sdf”文件,采用Chem3D 軟件將其轉(zhuǎn)化為“mol2”文件,保存為“PDBQT”格式。將經(jīng)過前處理的配體和目的靶點導(dǎo)入AutoDock 4.2.6軟件進行格點能計算后,進行分子對接。本研究以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1為分子與靶點結(jié)合性較好[5]。

2 結(jié)果

2.1 收集和篩選得到的防風(fēng)通圣丸主要成分和靶點

用TCMSP數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件檢索得到防風(fēng)通圣丸化學(xué)成分224種。用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集得到224種化學(xué)成分對應(yīng)靶點共696個。其中存在1種活性成分對應(yīng)多個靶點及1個靶點對應(yīng)多種活性成分的情況。

2.2 COVID-19疾病靶點和防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的潛在靶點

利用GeneCards平臺檢索得到COVID-19疾病靶點259個,通過Venny平臺將防風(fēng)通圣丸主要成分所對應(yīng)的靶點與COVID-19 疾病靶點取交集,得到79個防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的潛在靶點。

2.3 藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建的藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò),見圖1。圖中共有264個節(jié)點及1 046條邊。Degree值反映了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)量,Betweenness是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑數(shù)量與最短路徑總數(shù)之比,Degree與Betweenness是衡量一個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的主要拓撲參數(shù)。由圖1可見,1種成分可對多個靶點起作用,同時也存在多種成分對1 個靶點起作用的情況,表明防風(fēng)通圣丸具有多成分、多靶點相互協(xié)同治療COVID-19的特點。

圖1 藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of drug-target-disease

2.4 活性成分及有效靶點的獲得

利用Cytoscape 3.7.2軟件對藥物-靶點-疾病交互網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,并以Degree值及Betweenness值≥2倍中位數(shù)且Closeness值≥1倍中位數(shù)為標準,篩選出活性成分10 種,以黃酮類化合物為主,排名前5的化合物分別為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素;有效靶點23 個,PTGS2、PTGS1、NOS2、F10 和DPP4 為排名前5的靶點。結(jié)果見表1、表2。

表1 防風(fēng)通圣丸的主要活性成分Tab.1 Main active components of Fangfeng Tongsheng Pills

表2 防風(fēng)通圣丸的主要有效靶點Tab.2 Main effective targets of Fangfeng Tongsheng Pills

2.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過String平臺構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),見圖2。由圖2可見,共有22個節(jié)點（F10為孤立靶點,未參與分析）,150條邊。其中節(jié)點表示蛋白,節(jié)點越大表示度值越大,連線越粗表明其評分越高,即關(guān)系越密切,顏色的深淺與度值及介值呈正相關(guān)。網(wǎng)絡(luò)中蛋白平均節(jié)點度值為13.63,有15個節(jié)點度值超過平均值。TP53、MAPK3、CASP3、TNF 和IL-6的度值較大,為顏色最亮的5個節(jié)點,提示其可能是防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的主要作用靶點。

圖2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein interaction network

2.6 GO 富集分析

經(jīng)GO 富集分析,共得到65條富集結(jié)果。主要涉及炎癥反應(yīng)（inflammtory response）等方面。結(jié)果見圖3。

圖3 防風(fēng)通圣丸活性成分作用靶點的GO 基因功能富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of effect targets of compounds from Fangfeng Tongsheng Pills

2.7 KEGG 富集分析

經(jīng)KEGG 富集分析后,得到101條富集結(jié)果,包括TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）。本研究選出KEGG 富集分析中排名前25的項目,見圖4。排序越靠前,提示其越可能是防風(fēng)通圣丸治療COVID-19的主要作用機制。

圖4 防風(fēng)通圣丸作用靶點KEGG 信號通路富集分析的25條通路Fig.4 KEGG enrichment analysis of 25 pathways of effect targets of Fangfeng Tongsheng Pills

2.8 分子對接

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）是SARS-Co V-2的宿主細胞受體,并且SARS-Co V-2是通過其棘突S蛋白與人體細胞表面的ACE2受體結(jié)合,從而導(dǎo)致病毒侵入機體而致病[6]?？刂菩滦凸跔畈《緩?fù)制復(fù)合物活性的主水解酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用,Mpro與小核糖核酸病毒3C 水解酶具有相似的切割位點特異性,此酶通常稱為SARS-Co V-2 3CL水解酶[7]。目前,多數(shù)研究者認為,配體與受體在結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定的情況下,能量越低表明此受體與配體發(fā)生作用的可能性越大。將防風(fēng)通圣丸的10 種有效成分分別與SARS-Co V-2 3CL水解酶（PDB ID:6LU7）和ACE2（PDB ID:1R42）進行分子對接,結(jié)果見表3,防風(fēng)通圣丸中10 種成分與SARS-Co V-2 3CL 水解酶和ACE2的結(jié)合能均小于-5.0 kJ·mol-1。其中以β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚與SARS-Co V-2 3CL水解酶和ACE2靶點結(jié)合能最低,并與陽性對照藥物最接近。

表3 防風(fēng)通圣丸核心化合物及臨床治療藥物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的結(jié)合親合能Tab.3 Binding affinities of key compounds in Fangfeng Tongsheng Pills and clinical drugs with SARS-Co V-2 3CL hydrolase and ACE2

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在疾病-基因-靶點-藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上,其可用于分析藥物或方劑中多成分-多靶點-多途徑的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò),可體現(xiàn)出中醫(yī)理論中多成分、多靶點協(xié)同治療的特點。分子對接技術(shù)是利用計算機模式識別和優(yōu)化技術(shù),計算物理化學(xué)參數(shù),從而評價配體、受體二者間的相互作用,進而達到輔助藥物篩選的目的,現(xiàn)已廣泛用于基于特定靶標的中藥及復(fù)方活性成分篩選的研究[8-10]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果,得出防風(fēng)通圣丸中治療COVID-19的潛在活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素等;作用靶點為TP53、MAPK3、CASP3、TNF和IL-6等。前期大量的研究表明,槲皮素具有抗炎、抗病毒的作用,其可通過調(diào)控Toll樣受體（TLR7）通路,減少IL-6和TNF-α等炎性因子的分泌,從而減輕支氣管上皮細胞的炎癥并對呼吸道病毒感染起抑制作用[11]。IL-6為機體內(nèi)參與信息傳遞及調(diào)節(jié)激活免疫細胞的一種細胞因子,IL-6的表達失調(diào)會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。同時,IL-6 是引發(fā)炎癥風(fēng)暴的關(guān)鍵細胞因子,阻斷IL-6與其受體的結(jié)合可以抑制炎癥風(fēng)暴[12]。木犀草素除可抑制IL-6和TNF-α等細胞因子的表達外[13],還可調(diào)節(jié)MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多個靶標,通過抑制IL-1β誘導(dǎo)的激酶活化而對MAPK 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生影響,從而發(fā)揮抗炎作用[14]。MAPK3 與MAPK1 同屬于MAPK 家族成員,其可誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎反應(yīng),其在氧化應(yīng)激和病毒感染等環(huán)境中會被激活。β-谷甾醇的作用機制與木犀草素類似,可通過減少NO 的合成,抑制巨噬細胞IL-6的活性,減少IL-1和TNF-α等炎性因子的分泌[15]。TNF 主要由巨噬細胞和T 淋巴細胞產(chǎn)生,TNF-α可通過活化中性粒細胞及相關(guān)炎性因子、影響肺表面活性物質(zhì)以及肺內(nèi)皮細胞等機制造成急性肺損傷[16]。山柰酚通過抑制新型冠狀病毒3a通道蛋白從而抑制病毒的釋放[17]。IL-10屬細胞因子中的干擾素家族,可以激活巨噬細胞,并能在轉(zhuǎn)錄水平上強烈抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的合成。柚皮素可通過下調(diào)Toll樣受體（TLR2和TLR4）,顯著抑制IL-10水平的上升,從而抑制由沙眼衣原體引起的炎癥反應(yīng)[18]。

GO 富集結(jié)果主要涉及炎癥和氧化應(yīng)激通路。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn),防風(fēng)通圣丸治療COVID-19可能與TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK 信號通路有關(guān)。TNF 可促進促炎因子的表達,參與全身炎癥反應(yīng)[19],亦有抗感染效應(yīng),可阻止病毒早期蛋白質(zhì)的合成,進而抑制病毒復(fù)制和殺傷被病毒感染的細胞[20]。HIF-1由HIP-1α和HIF-1β2種亞基構(gòu)成,是缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子,是氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑。HIF-1通路與病毒性肺炎的炎癥因子釋放有關(guān)[21]。且HIP-1α表達的上調(diào)可導(dǎo)致肺部阻塞性疾病的發(fā)展[22]。VEGF 通路與炎癥抑制、減輕肺損傷有關(guān)。COVID-19會導(dǎo)致患者嚴重缺氧,而缺氧對VEGF 基因的表達有重大影響[23]。Toll樣受體是先天性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體和病原膜識別受體之一,其常介導(dǎo)各種炎癥細胞因子的產(chǎn)生,參與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[24]。PI3K-Akt信號通路對于呼吸道疾病及肺部炎癥的治療具有重要意義[25]。MAPK 通路與病毒性肺炎有關(guān)[26],細胞因子和生長因子等的刺激會激活MAPK 通路,促進免疫細胞成熟、活化和分化,并促進炎性細胞因子的合成、釋放,參與炎癥免疫反應(yīng)[27]。

防風(fēng)通圣丸方藥中將防風(fēng)、麻黃、荊芥穗和薄荷4種藥材合用,可發(fā)汗解表,使外邪從汗而解,故為君藥。君藥中的活性成分β-谷甾醇、柚皮素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、金合歡素、和蘆薈大黃素可作用于TNF、HIF-1、NOS、PI3K-Akt、MAPK、VEGF 及Toll樣受體通路中的TNF、RELA、MAPK1、MAPK3、F10、NOS2、PGTF2、IL-6和PGTS2等靶點發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制病毒釋放和抗缺氧的作用。大黃、芒硝、滑石、梔子、石膏、黃芩、連翹和桔梗8味藥共為臣藥,可清熱瀉火、解毒散結(jié)。臣藥中的活性成分大黃素、漢黃芩素、黃芩素、金合歡素、槲皮素、木犀草素和β-谷甾醇可調(diào)節(jié)TNF、HIF-1、VEGF、MAPK、PI3K-Akt和Toll樣受體通路中的TNF、IL-6、CXCL8、MAPK14、NOS2、RELA、PTGS2和PIK3CG 等靶點起到抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和抗缺氧的作用。

為了進一步確定防風(fēng)通圣丸抗COVID-19的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究采用分子對接技術(shù)對防風(fēng)通圣丸活性成分進行對接驗證。由分子對接結(jié)果可知,防風(fēng)通圣丸中的10 種有效成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2蛋白的結(jié)合能均小于-5.0 kJ·mol-1。其中β-谷甾醇、甘草查耳酮、山柰酚與SARS-Co V-2 3CL 水解酶的結(jié)合能甚至低于臨床推薦使用的3CLpro抑制劑洛匹那韋,即該類化合物可能與3CLpro 直接結(jié)合,阻斷病毒的增殖。槲皮素、木犀草素、山柰酚和柚皮素與ACE2的結(jié)合能較低,可能直接作用于人體細胞,阻斷病毒的侵入。上述結(jié)論在一定程度上證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成分篩選的結(jié)果,表明防風(fēng)通圣丸中的β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚和柚皮素等可能為潛在的抗COVID-19的活性成分。

綜上所述,本文用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析防風(fēng)通圣丸治療COVID-19 的作用機制,結(jié)果表明防風(fēng)通圣丸中的β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素等活性成分可與SARS-Co V-2 3CL 水解酶、ACE2 結(jié)合,通過多靶點的方式調(diào)節(jié)TNF、HIM-1和VEGF等多條通路,發(fā)揮抗炎、抗病毒和抗缺氧等作用,從而獲得治療COVID-19的效果,這為其臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。