非小細胞肺癌組織中PD-1、TIM-1的表達及其對預后的影響

陳 燦，鄭林鑫，麥玉梅，李偉峰 (中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸內科，廣東 廣州510000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種常見的病理類型，約占肺癌的85%，早期發(fā)病隱匿，無明顯癥狀，多數(shù)患者就診時已屬于中晚期，錯過了最佳手術切除時機，預后極差[1]。NSCLC的治療手段包括手術切除、化療、放療、免疫治療等，通常采用以手術切除為主、放/化療為輔的方式，但受腫瘤類型、個體差異、就診時間等影響，患者5年生存率僅約16%，效果不夠理想[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)宿主抗癌免疫的有效性與細胞毒性T淋巴細胞密切相關，T淋巴細胞介導的免疫應答是腫瘤免疫治療的基礎，而程序性死亡受體-1(programmed death receptor-1，PD-1)在活化T淋巴細胞中廣泛表達，PD-1可通過與其配體結合，對腫瘤的免疫逃逸進行介導[3]。周舸等[4]發(fā)現(xiàn)肝細胞癌組織中PD-1的表達水平較癌旁組織高。黃健等[5]發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，結腸癌組織中PD-1的表達水平也明顯增高。這表明PD-1與多種腫瘤的發(fā)生有關，可能參與腫瘤進展。周鵬等[6]則認為T淋巴細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域分子1(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-1，TIM-1)能促進免疫抑制，參與腫瘤細胞的免疫逃逸過程?；诖?，本研究納入125例NSCLC患者進行研究，旨在分析PD-1、TIM-1在NSCLC組織中的表達情況及二者與NSCLC患者預后的關系，以期為臨床NSCLC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取我院2016年1月至2019年6月收治的125例NSCLC患者開展前瞻性研究，其中男68例，女57例；年齡34～71歲，平均(55.39±12.71)歲；臨床分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期35例，Ⅲ期67例；病理類型：腺癌63例，鱗狀細胞癌62例；分化程度：高分化58例，中低分化67例；淋巴結轉移41例；腫瘤直徑：≥3 cm 73例，<3 cm 52例。納入標準：成年；經(jīng)病理診斷證實為NSCLC；術前無免疫治療、放療、化療史；病歷資料及各項檢查資料完整；無精神障礙、意識障礙，能配合研究。排除標準：患有嚴重心血管疾病、腦血管疾病、其他部位原發(fā)性腫瘤等危及生命的疾?。荒δ苷系K；因NSCLC復發(fā)就診；患傳染性疾??；出現(xiàn)遠處轉移。本研究獲我院倫理委員會批準(2016012502)，所有患者均對本研究知情，并自愿簽署同意書。

1.2 檢測方法

主要儀器：石蠟切片機(德國Leica公司，RM2245型)、烤片機(武漢俊杰電子有限公司，JK-5型)、超低溫冰箱(青島海爾集團，DW86L338J型)、光學顯微鏡(日本OLYMPUS，CX21型)；主要試劑：抗PD-1抗體、抗TIM-1抗體(美國賽默飛世爾科技公司)。

采用免疫組化法檢測NSCLC患者癌組織、癌旁組織(距離病灶3～5 cm)中PD-1、TIM-1的表達情況。免疫組化染色：組織樣本經(jīng)10%甲醛固定，并石蠟包埋，石蠟切片厚度為4 μm，置于載玻片備用。將切片分別經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡10 min，然后經(jīng)無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min，經(jīng)95%、85%乙醇各浸泡5 min，雙蒸餾水沖洗5 min，經(jīng)PBS清洗3次，每次5 min。加入3% H2O2甲醇，在室溫下反應10 min，經(jīng)PBS清洗3次。利用高壓鍋行抗原修復，采取檸檬酸鈉緩沖液高溫高壓抗原修復法，取檸檬酸鈉緩沖液加入沸水內，封蓋。取玻片放置在金屬染色架加熱，使其經(jīng)PBS浸泡5 min，加熱完畢后去除熱源，開蓋，待樣本自然冷卻，經(jīng)PBS清洗3次。滴入正常山羊血清(10%)，37 ℃反應20 min。棄血清，加入抗PD-1抗體或抗TIM-1抗體，4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBS清洗3次。甩去PBS，室溫孵育過夜后37 ℃反應1 h。加入二抗，37 ℃反應40 min，經(jīng)PBS清洗3次。甩去PBS，經(jīng)DAB顯色，控制染色深度，經(jīng)雙蒸餾水沖洗，終止染色。行蘇木素復染，再次經(jīng)雙蒸餾水沖洗。脫水、透明，封片。

1.3 染色結果評估

評估方法[7]：光學顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野(×400)進行觀察，分析染色情況，以細胞漿、胞膜內出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒判定為陽性細胞。染色強度：無染色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。陽性細胞占比：0～10%(0分)、11%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、75%以上(4分)。染色強度評分與陽性細胞占比評分的乘積≤2分為低表達，>3分為高表達。

1.4 隨訪

術后隨訪24個月，隨訪方式包括上門隨訪、電話隨訪、門診隨訪，患者出院后根據(jù)醫(yī)囑定期復查。記錄患者隨訪期間的無瘤生存率與總生存率。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率(%)表示，行χ2檢驗。采用Spearman相關系數(shù)分析PD-1與TIM-1表達的相關性，并分析二者與臨床病理特征的關系。經(jīng)多因素Cox回歸分析影響預后的危險因素，采用Kaplan-Meier法計算生存率，log-rank檢驗比較不同PD-1、TIM-1表達患者的無瘤生存率與總生存率。以雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織、癌旁組織PD-1、TIM-1的表達情況及二者表達的相關性分析

癌組織中PD-1、TIM-1高表達率高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。免疫組化染色結果顯示，PD-1、TIM-1在癌旁組織中無明顯染色，在癌組織中可見明顯的棕黃色或棕褐色染色，見圖1。Spearman相關系數(shù)分析結果顯示，PD-1與TIM-1表達呈正相關(r=0.745，P<0.001)。

a：癌旁組織中PD-1的表達；b：癌組織中PD-1的表達；c：癌旁組織中TIM-1的表達；d：癌組織中TIM-1的表達

表1 癌組織、癌旁組織中PD-1、TIM-1表達情況比較[n=125，例(%)]

2.2 NSCLC患者PD-1、TIM-1表達與臨床病理特征的關系

根據(jù)PD-1、TIM-1表達情況分成PD-1、TIM-1高表達組與PD-1、TIM-1低表達組。PD-1、TIM-1高表達組臨床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥3 cm的比例高于PD-1、TIM-1低表達組(P<0.05)，見表2。

表2 NSCLC患者PD-1、TIM-1表達與臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 NSCLC患者生存與死亡情況及多因素Cox回歸分析

隨訪期間，125例NSCLC患者中，死亡34例(27.20%)，生存91例(72.80%)。多因素Cox回歸分析顯示,臨床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥3 cm及PD-1、TIM-1高表達是影響預后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 NSCLC患者預后的多因素Cox回歸分析

2.4 NSCLC患者PD-1、TIM-1表達與預后的關系

隨訪期間，PD-1高表達組的無瘤生存率為59.74%，總生存率為63.64%；PD-1低表達組的無瘤生存率為83.33%，總生存率為87.50%，PD-1高表達組的無瘤生存率、總生存率均低于PD-1低表達組(P<0.001)，見圖2a、b。TIM-1高表達組的無瘤生存率為61.80%，總生存率為66.29%；TIM-1低表達組的無瘤生存率為83.33%，總生存率為88.89%，TIM-1高表達組的無瘤生存率、總生存率均低于TIM-1低表達組(P<0.001)，見圖2c、d。

a：不同PD-1表達患者的無瘤生存曲線；b：不同PD-1表達患者的總生存曲線；c：不同TIM-1表達患者的無瘤生存曲線；d：不同TIM-1表達患者的總生存曲線

3 討論

NSCLC是全球比較常見的癌癥，具有較高的發(fā)病率、復發(fā)率、轉移率、病死率。隨著臨床診斷技術的發(fā)展，NSCLC的檢出率逐年增高，但受癌癥浸潤、轉移、復發(fā)等因素影響，NSCLC的預后仍然欠佳，5年生存率未見明顯改善[8]。既往臨床采用常規(guī)腫瘤標記物(如鱗癌細胞抗原、癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等)評估肺癌病情，雖然有一定價值，但總體作用有限，敏感度、特異度不理想，對預后的評估效果較差[9]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)PD-1與腫瘤的發(fā)生密切相關，其對外周組織內T淋巴細胞活性有抑制作用，使癌細胞形成免疫抵抗機制[10]。另有研究指出，PD-1與程序性死亡配體-1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)表達增高能促進腫瘤細胞增殖，導致病情進展[11]。此外，王巨等[12]發(fā)現(xiàn)TIM-1對輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2的平衡有調節(jié)作用，其在橋本甲狀腺炎癌變患者中呈過表達，表明TIM-1也具有促癌作用?；诖?，本研究通過探索PD-1、TIM-1在NSCLC中的表達情況及其對預后的影響，以期為NSCLC的診治提供參考。

本研究結果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中PD-1、TIM-1高表達率更高，且PD-1與TIM-1表達呈正相關，表明二者可能共同參與NSCLC的發(fā)生進展。T淋巴細胞所介導的免疫應答在抗腫瘤免疫中有重要作用，而T淋巴細胞活化需要依賴相關的協(xié)同刺激分子受體，PD-1是一種非常重要的介導負性協(xié)同刺激受體，在T淋巴細胞中存在表達，PD-1/PD-L1信號通路能對T淋巴細胞活化以及增殖進行抑制，導致T淋巴細胞凋亡，使癌細胞逃過免疫監(jiān)視[13]。楊德松等[14]發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號通路參與了NSCLC的進展，該信號通路具有負性調節(jié)作用，能抑制B淋巴細胞、T淋巴細胞受體信號路徑的激活，從而抑制淋巴細胞增殖，幫助癌細胞免疫逃逸。TIM-1是TIM家族的重要一員，是共刺激分子，在T淋巴細胞表面存在表達，其異常表達可破壞T淋巴細胞亞群的免疫平衡，導致組織細胞出現(xiàn)惡變或者異常增生，引起癌變[15]。Halim等[16]指出TIM-1在正常組織內低表達，而在腎細胞癌、卵巢癌等惡性腫瘤中表達上調，這可能與其對免疫表型的調節(jié)作用有關，進一步證實了TIM-1具有促癌作用。由此可見，PD-1與TIM-1高表達均具有促癌作用，可能通過共同破壞T淋巴細胞功能，促進癌細胞增殖。本研究結果顯示，NSCLC患者PD-1、TIM-1表達與腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移、腫瘤直徑有關。分析原因可能為PD-1、TIM-1在NSCLC中發(fā)揮促癌作用，二者表達水平越高，則越能促進癌癥進展，導致NSCLC分期增高，分化程度降低，腫瘤增長速度加快，淋巴結轉移風險增加。

已有研究證實，NSCLC患者的預后與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移等因素有關[17]。本研究結果顯示，臨床分期Ⅲ期、中低分化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥3 cm是影響NSCLC患者預后的危險因素，與既往研究結論基本一致[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1、TIM-1高表達也是影響NSCLC預后的危險因素，且二者高表達可導致患者術后24個月的無瘤生存率、總生存率降低。PD-1能幫助癌細胞逃過免疫監(jiān)視，而TIM-1可通過破壞T淋巴細胞亞群平衡，促進細胞惡變，二者均能加速癌癥進展。Fujimoto等[19]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者經(jīng)同步放/化療后PD-1水平降低，且低表達的PD-1有利于改善患者預后，也提示PD-1表達與NSCLC預后有關，本研究結果與之吻合。但該研究未分析PD-1與NSCLC臨床病理特征的關系，本研究分析了PD-1、NSCLC與患者臨床病理特征及預后的關系，為NSCLC診療提供了更可靠的依據(jù)。

綜上所述，PD-1、TIM-1在NSCLC組織中高表達，其高表達是影響NSCLC預后的危險因素，對患者無瘤生存率、總生存率有較大影響。但本研究也有局限性，如分析危險因素時納入變量較少，未來還需進一步完善病歷資料，納入更多變量予以探討。